鼻腔上皮是所有呼吸道病原体首先接触的主要屏障部位。本文概述了利用气液界面（ALI）培养的原代鼻腔上皮细胞，以在生理相关系统中表征人类冠状病毒与宿主相互作用的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
三种高致病性人类冠状病毒（HCoVs）——SARS-CoV（2002年）、MERS-CoV（2012年）和SARS-CoV-2（2019年）——在过去20年中相继出现，并引发了重大的公共卫生危机。此外，还有四种HCoVs每年导致大量普通感冒病例（HCoV-NL63、-229E、-OC43和-HKU1），凸显了在生理相关系统中研究这些病毒的重要性。HCoVs通过呼吸道进入人体，并在鼻黏膜上皮建立感染，后者是所有呼吸道病原体入侵的首要部位。我们采用一种原代鼻上皮细胞培养系统，将来自患者的鼻腔样本在气液界面（ALI）条件下培养，以研究该关键哨兵部位上的宿主-病原体相互作用。这些培养物重现了鼻黏膜上皮的多种特征 体内 气道，包括 存在的细胞类型、纤毛功能以及黏液分泌。我们描述了在人类冠状病毒（HCoV）感染后，利用鼻腔气液界面（ALI）培养模型表征病毒复制、宿主细胞嗜性、病毒诱导的细胞毒性以及天然免疫反应的方法，并以近期对致死性和季节性HCoV的比较研究为例进行说明1对鼻腔内宿主与病原体相互作用的深入理解，有望为针对人冠状病毒及其他未来可能出现的呼吸道病毒的抗病毒治疗提供新的靶点。
引言
迄今为止已发现七种人类冠状病毒（HCoVs），可引起多种呼吸系统疾病2。常见或季节性人类冠状病毒（HCoV-NL63、-229E、-OC43 和 -HKU1）通常与上呼吸道疾病相关，每年估计导致10%–30%的普通感冒病例。尽管这是常见HCoVs典型的临床表型，但这些病毒在高风险人群中也可能引起更严重的下呼吸道疾病，包括儿童、老年人以及免疫功能低下者3,4。在过去20年中，已出现三种致病性HCoVs，并引发了重大的公共卫生紧急事件，分别为严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2。致死性HCoVs与更严重的呼吸道病理相关，MERS-CoV病例的病死率超过>34%（自2012年首次出现以来，已有2,500多例病例，其中894例死亡），这一数据清晰地说明了其严重性5,6。需要特别指出的是，这些致死性HCoVs同样可引起从无症状感染到致死性肺炎等一系列呼吸道疾病，正在持续的COVID-19大流行便是例证7。
与其他呼吸道病原体类似，人冠状病毒（HCoVs）进入呼吸道后，在鼻腔上皮....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
使用鼻腔样本已获得宾夕法尼亚大学机构审查委员会（方案编号 # 800614）和费城退伍军人事务机构审查委员会（方案编号 # 00781）的批准。
1. 鼻腔ALI培养物的感染
注意：临床标本的采集，以及鼻部气液界面（ALI）培养物的生长与分化，不在本文讨论范围之内。有关原代鼻上皮细胞培养的具体方法，可参考近期发表的利用此类培养体系的研究文献18,22,23。如下所述的实验方案也可根据需要应用于市售的鼻上皮ALI培养模型。下述方案及体积适用于24孔板Transwell插入式培养小室（直径6.5 mm，膜表面积0.33 cm2）。若使用在较大Transwell上生长的ALI培养物（例如12孔板，直径12 mm，表面积1.12 cm2），应按比例相应调整所用体积。
- 感染前一天：
- 从顶端用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗 ALI 培养物 3 次（加入约 200 μL 预热的 PBS，置于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟，吸除 PBS，重复此步骤）。
- 更换底部培养基（500 μL）。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
代表性图示部分改编自 Otter 等人手稿中可查的数据1。来自四至六名供体的鼻腔气液界面（ALI）培养物根据上述方案接种四种人冠状病毒之一（SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63 和 HCoV-229E），每种病毒的平均顶端释放病毒滴度如图1A所示。尽管这四种人冠状病毒均能在鼻腔ALI培养物中有效复制，但SARS-CoV-2和HCoV-229E的复制效率最高。需注意，此处展示的是平均病毒滴度，各HCoV在个体供体中的病毒滴度数据已近期发表1。在按照方案第3节所述清洗鼻腔ALI培养物后，MERS-CoV在顶端表面液体（ASL）中的滴度与细胞内病毒滴度的比较见图1B。感染后48小时（hpi），MERS-CoV的细胞内病毒滴度与顶端释放的病毒滴度大致相同。
感染后鼻部气液界面（ALI）培养物的免疫荧光成像是一种强大的工具，可用于研究病毒的细胞嗜性及其他感染.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文详细描述了一种原代上皮细胞培养系统，该系统在气液界面条件下培养源自患者的鼻上皮细胞，并用于研究人冠状病毒（HCoV）与宿主之间的相互作用。分化完成后，这些鼻源性气液界面（ALI）培养物可重现人体鼻黏膜上皮的多种特征 体内 鼻腔上皮，包含纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞在内的异质性细胞群体，以及具有强烈摆动的纤毛和黏液分泌功能的完整黏膜纤毛系统。这种异质性细胞群体相较于传统呼吸道上皮细胞系，是该培养系统的关键优势，可实现对病毒感染过程中宿主细胞趋向性的表征（如图所示） 图2传统的气道上皮细胞系也缺乏功能性黏膜纤毛清除机制，而该机制与干扰素产生等先天免疫通路共同在抵御呼吸道病毒的初级防御中发挥关键作用。
方案中的关键步骤包括初始感染程序；例如，培养物必须在感染前平衡至所需温度，并且应采用一致的方法启动每次感染。这些步骤对于标准化 方法并确保 后续研究结果的可重复性至关重要。
这些方法中最重要的部分可能是对顶端释放病毒的定量，因为了解每.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
Susan Weiss 担任 Ocugen 的科学咨询委员会成员。Noam A. Cohen 为葛兰素史克（GSK）、阿斯利康（AstraZeneca）、诺华（Novartis）、赛诺菲/再生元（Sanofi/Regeneron）和牡蛎点制药公司（Oyster Point Pharmaceuticals）提供咨询，并拥有一项美国专利"呼吸道感染的治疗与诊断"（10,881,698 B2，WO20913112865），以及与 GeneOne 生命科学公司的一项许可协议。
致谢
本研究的资助来源如下：美国国立卫生研究院（NIH）R01AI 169537（S.R.W. 和 N.A.C.），NIH R01AI 140442（S.R.W.），退伍军人事务部杰出研究奖 CX001717（N.A.C.），退伍军人事务部杰出研究奖 BX005432（S.R.W. 和 N.A.C.）， 宾夕法尼亚大学冠状病毒及其他新发病原体研究中心（S.R.W.），Laffey-McHugh 基金会（S.R.W. 和 N.A.C.），T32 AI055400（CJO），T32 AI007324（AF）。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 二抗（488、594、647） | Invitrogen | Various | |
| BSA（牛血清白蛋白） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂 | Roche | 11836170001 | |
| 细胞毒性检测试剂盒 | Roche | 11644793001 | |
| DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | Gibco | 11965-084 | |
| DPBS（杜尔贝科磷酸盐缓冲液） | Gibco | 14190136 | |
| DPBS + 钙 + 镁 | Gibco | 14040-117 | |
| Endohm-6G 测量室 | World Precision Instruments | ENDOHM-6G | |
| 上皮细胞黏附分子标记物（EpCAM；CD326） | eBiosciences | 14-9326-82 | |
| 上皮细胞伏特/欧姆（TEER）测量仪（EVOM） | World Precision Instruments | 300523 | |
| FBS（胎牛血清） | HyClone | SH30071.03 | |
| 成像用 FV10-ASW 软件 | Olympus | Version 4.02 | |
| HCoV-NL63（人冠状病毒 NL63） | BEI Resources | NR-470 | |
| HCoV-NL63 核衣壳抗体 | Sino Biological | 40641-V07E | |
| Hoescht 染色剂 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Laemmli 样品缓冲液（4x） | BIO-RAD | 1610747 | |
| LLC-MK2 细胞 | ATCC | CCL-7 | 用于滴定 HCoV-NL63 |
| MERS-CoV（人冠状病毒，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），EMC/2012） | BEI Resources | NR-44260 | |
| MERS-CoV 核衣壳抗体 | Sino Biological | 40068-MM10 | |
| MUC5AC 抗体 | Sigma-Aldrich | AMAB91539 | |
| Olympus Fluoview 共聚焦显微镜 | Olympus | FV1000 | |
| Phalloidin-iFluor 647 染色剂 | Abcam | ab176759 | |
| PhosStop easy pack（磷酸酶抑制剂） | Roche | PHOSS-RO | |
| 酶标仪 | Perkin Elmer | HH34000000 | 任何酶标仪或 ELISA 读板仪均可；必须能够读取 492 nm 处的吸光度 |
| RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8；150 mM NaCl；0.5% 脱氧胆酸钠；0.1% SDS；1% NP40） | Thermo Fisher | 89990 | 可自行配制或购买 |
| RNeasy Plus 试剂盒 | Qiagen | 74134 | |
| SARS-CoV-2（SARS 相关冠状病毒 2，分离株 USA-WA1/2020） | BEI Resources | NR-52281 | |
| SARS-CoV-2 核衣壳抗体 | Genetex | GTX135357 | |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151100 | |
| Type IV β-微管蛋白抗体 | Abcam | ab11315 | |
| VeroCCL81 细胞 | ATCC | CCL-81 | 用于滴定 MERS-CoV |
| VeroE6 细胞 | ATCC | CRL-1586 | 用于滴定 SARS-CoV-2 |
参考文献
- Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120(2023).
- Fehr, A., Perlman, S.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
