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在气液界面培养的原代鼻上皮细胞感染模型中表征人冠状病毒与宿主相互作用

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DOI：

10.3791/64868

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2023年9月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Pennsylvania, 2Penn Center for Research on Coronaviruses and Other Emerging Pathogens, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Pennsylvania, 4Corporal Michael J. Crescenz VA Medical Center

通讯作者： Noam A. Cohen <ncohen@pennmedicine.upenn.edu>

本文内容

摘要

鼻腔上皮是所有呼吸道病原体首先接触的主要屏障部位。本文概述了利用气液界面（ALI）培养的原代鼻腔上皮细胞，以在生理相关系统中表征人类冠状病毒与宿主相互作用的方法。

摘要

三种高致病性人类冠状病毒（HCoVs）——SARS-CoV（2002年）、MERS-CoV（2012年）和SARS-CoV-2（2019年）——在过去20年中相继出现，并引发了重大的公共卫生危机。此外，还有四种HCoVs每年导致大量普通感冒病例（HCoV-NL63、-229E、-OC43和-HKU1），凸显了在生理相关系统中研究这些病毒的重要性。HCoVs通过呼吸道进入人体，并在鼻黏膜上皮建立感染，后者是所有呼吸道病原体入侵的首要部位。我们采用一种原代鼻上皮细胞培养系统，将来自患者的鼻腔样本在气液界面（ALI）条件下培养，以研究该关键哨兵部位上的宿主-病原体相互作用。这些培养物重现了鼻黏膜上皮的多种特征 体内 气道，包括 存在的细胞类型、纤毛功能以及黏液分泌。我们描述了在人类冠状病毒（HCoV）感染后，利用鼻腔气液界面（ALI）培养模型表征病毒复制、宿主细胞嗜性、病毒诱导的细胞毒性以及天然免疫反应的方法，并以近期对致死性和季节性HCoV的比较研究为例进行说明1对鼻腔内宿主与病原体相互作用的深入理解，有望为针对人冠状病毒及其他未来可能出现的呼吸道病毒的抗病毒治疗提供新的靶点。

引言

迄今为止已发现七种人类冠状病毒（HCoVs），可引起多种呼吸系统疾病2。常见或季节性人类冠状病毒（HCoV-NL63、-229E、-OC43 和 -HKU1）通常与上呼吸道疾病相关，每年估计导致10%–30%的普通感冒病例。尽管这是常见HCoVs典型的临床表型，但这些病毒在高风险人群中也可能引起更严重的下呼吸道疾病，包括儿童、老年人以及免疫功能低下者3,4。在过去20年中，已出现三种致病性HCoVs，并引发了重大的公共卫生紧急事件，分别为严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2。致死性HCoVs与更严重的呼吸道病理相关，MERS-CoV病例的病死率超过>34%（自2012年首次出现以来，已有2,500多例病例，其中894例死亡），这一数据清晰地说明了其严重性5,6。需要特别指出的是，这些致死性HCoVs同样可引起从无症状感染到致死性肺炎等一系列呼吸道疾病，正在持续的COVID-19大流行便是例证7。

与其他呼吸道病原体类似，人冠状病毒（HCoVs）进入呼吸道后，在鼻腔上皮建立有效的感染8。病毒扩散至下呼吸道通常被认为与口腔/鼻腔分泌物误吸入肺部有关，HCoVs 在肺部可引起更显著的下呼吸道病理改变9,10,11。因此，鼻腔作为病毒入侵的初始门户，凭借其强大的黏液纤毛清除机制以及独特的天然免疫机制，构成了抵御感染的主要屏障，旨在阻止病毒进一步扩散至下呼吸道12,13。例如，已有研究报道，鼻腔上皮细胞的基础抗病毒干扰素及干扰素刺激基因表达水平高于平均水平，表明鼻腔细胞可能已处于对呼吸道病毒作出早期应答的准备状态14,15,16。

我们先前利用患者来源的原代鼻上皮细胞，在气液界面（air-liquid interface, ALI）培养条件下建立模型，以研究鼻腔中人类冠状病毒（HCoV）与宿主之间的相互作用，因为HCoV感染通常始于鼻腔。鼻源性ALI培养体系对多种HCoV均具有易感性，包括致病性冠状病毒（如SARS-CoV-2和MERS-CoV）以及常见的人类冠状病毒（如HCoV-NL63和HCoV-229E），相较于传统的气道上皮细胞系（如A549，一种肺腺癌细胞系），该模型具有多种优势。16,17分化后，鼻腔气液界面培养物包含多种细胞类型，并表现出人体鼻腔上皮预期的多种功能 体内 鼻上皮，例如黏液纤毛清除系统18鼻腔细胞相较于下呼吸道培养系统（如人支气管上皮细胞，HBECs）也具有优势，因为鼻上皮细胞的获取 通过 细胞学刷取技术相较于支气管镜等获取人支气管上皮细胞（HBECs）的方法具有显著更低的侵入性19,20,21.

本文介绍了利用这种鼻腔气液界面（ALI）培养系统来表征人冠状病毒（HCoV）与宿主相互作用的方法。我们已在近期发表的研究中应用这些方法，比较了SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63和HCoV-229E1,16,17。尽管这些方法和代表性结果重点强调了在该鼻腔细胞模型中对HCoVs的研究，但该系统也可高度适用于其他HCoVs以及其他呼吸道病原体。此外，这些方法还可更广泛地应用于其他ALI培养系统，以研究病毒感染后的病毒复制与细胞嗜性，以及细胞毒性与天然免疫应答的诱导。

方案

使用鼻腔样本已获得宾夕法尼亚大学机构审查委员会（方案编号 # 800614）和费城退伍军人事务机构审查委员会（方案编号 # 00781）的批准。

1. 鼻腔气液界面培养物的感染

注意：临床样本的获取，以及鼻腔气液界面（ALI）培养物的生长与分化不在本文讨论范围之内。有关原代鼻上皮细胞培养的具体方法，可参考近期发表的使用此类培养体系的研究文献18,22,23。如下所述的实验方案也可根据需要应用于市售的鼻上皮细胞ALI培养模型。下述方案及体积适用于24孔板Transwell小室（直径6.5 mm，膜表面积0.33 cm2）。若使用在较大Transwell上生长的ALI培养物（例如12孔板，直径12 mm，表面积1.12 cm2），则应按比例调整试剂体积以适配Transwell尺寸。

  1. 感染前一天：
    1. 用磷酸盐缓冲液（PBS）从顶端冲洗 ALI 培养物 3 次（加入约200 μL 温PBS，置于 37 °C 孵育5分钟，吸除PBS，重复一次。
    2. 更换基础培养基（500 μL).
    3. 让培养物在即将进行过夜感染的温度下平衡（例如，如果在 33 °C，将培养物置于 33 °C 孵育器中孵育（PBS洗涤后）。
      注意：据报道，与普通感冒相关的HCoVs（如HCoV-229E和HCoV-NL63）在较低温度下复制效率更高 33 °C此外，温度的 体内 鼻上皮组织 33 °C （这不同于肺部的温度，后者为 37 °C).
  2. 根据需要将病毒在无血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中稀释，以在总体接种体积中达到所需的感染复数（MOI） 50 μL.
    注意：感染通常在 MOI = 5（高 MOI）条件下进行；然而，MOI = 0.5（低 MOI）也已用于 SARS-CoV-2 和引起普通感冒的 HCoV，这两种条件可产生相当的病毒峰值滴度，但动力学存在差异（两种 MOI 均可接受）。
  3. 从顶端加入接种物，将培养物放回培养箱中孵育1 h。
  4. 每15分钟轻轻摇动培养板一次（用双手牢固握住培养板，前后及左右摇动，以确保病毒接种物均匀吸附）。
  5. 孵育1小时后，吸除病毒接种液，并用PBS洗涤每份感染的培养物3次，以确保彻底去除病毒接种液（每次洗涤时，加入 200 μL PBS，孵育5分钟，然后吸除或用移液器移去。
  6. 如有需要，收集第三次PBS洗涤液，以确认输入病毒已被充分去除。
  7. 每72小时用新鲜培养基更换感染的ALI模型中的基础培养基。

2. 采集气道顶膜表面液体（ASL）及脱落病毒的滴定

  1. 在感染后的预定时间点，加入 200 μL 向每个感染的transwell的顶端室加入PBS。
    注意：相关时间点因所研究的HCoV不同而异，通常为感染后24小时至192小时（参见代表性结果部分中各种HCoV的病毒复制数据）。
  2. 用移液器将PBS上下吹打5次，以确保充分收集顶端脱落的病毒，并将全部液体转移至微量离心管中（此为ASL样本）。
    注意：ASL 除了包含来自 ALI 培养物顶端分泌的黏液和其他分泌物外，还含有脱落的病毒颗粒。
  3. 在气液界面培养物中定量感染性病毒 通过 标准病毒蚀斑实验（对含有病毒的样本进行系列稀释，以定量病毒颗粒的浓度）。
    注意：用于空斑试验的细胞类型和孵育时间取决于所使用的病毒：SARS-CoV-2（VeroE6细胞）；MERS-CoV（VeroCCL81细胞）；HCoV-NL63（LLC-MK2细胞）；HCoV-229E（Huh7细胞）。有关如何开展病毒空斑试验的具体操作细节不在本文范围之内，但此前已在《视觉化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments, JoVE）的出版物中详细描述。24.
  4. 必要时，可在感染后的不同时间点收集基底侧培养基，以确认无基础性病毒释放。人冠状病毒（HCoVs）通常从鼻上皮细胞的顶端释放，但需对此加以验证。 通过 未稀释基础培养基的蚀斑实验
  5. 将 ASL 样本储存在 −80 °C 如果无法在采集当天进行噬斑测定定量。

3. 细胞内病毒的定量

  1. 收集ASL样本后，将每个transwell转移至预装有 500 μL 含2%胎牛血清（FBS）的DMEM基础培养基
    注意：使用含 2% FBS 的 DMEM 可在后续冻融循环中稳定病毒。
  2. 用 PBS 从顶端对每个 transwell 洗涤 3 次，以确保完全去除顶端脱落的病毒。
  3. 吸除最后一次 PBS 洗涤液后，加入 100 μL 向顶端室加入含2% FBS的DMEM。
  4. 将含有转染小室（transwell）及顶端和基底侧培养基的培养板转移至 −80 °C 冷冻，完成三个连续的冻融循环以裂解细胞。
  5. 经过最后一次冻融循环后，收集顶侧（100 μL）和基础（500 μL将培养基转移至洁净离心管中。
  6. 500 × g 离心 g 10 分钟 4 °C 以沉淀任何细胞碎片。
  7. 收集上清液。此为用于滴定的细胞内病毒样品。 通过 标准蚀斑实验
    注意：相对于ASL采集，收集过程中的稀释倍数为三倍；ASL样本采集于 200 μL PBS，而细胞内病毒样本则收集至总体积 600 μL.

4. 跨上皮电阻（TEER）测量

注意：测量TEER时，应使用添加了钙和镁的PBS（PBS + Ca2+/Mg2+）。使用设置为以欧姆（ohms）读数的上皮细胞伏特/欧姆计（见材料表）。

  1. 根据制造商的说明清洁、平衡并校准EVOM仪器；使用未接种鼻腔细胞的“空”Transwell进行空白校正。记录空白TEER测量值。
    注意：若使用多种病毒，不同条件之间必须严格清洁EVOM仪器以避免交叉污染（用70%乙醇清洗后，再用去离子水冲洗即可）。
  2. 将每个感染后的Transwell转移至预先标记的洁净24孔板中，每孔加入500 μL含Ca2+/Mg2+的PBS，从Transwell的基底侧洗去残留的培养基。
  3. 向每个Transwell的顶端室加入200 μL含Ca2+/Mg2+的PBS。
  4. 向Endohm-6测量室中加入1 mL含Ca2+/Mg2+的PBS。
  5. 将每个Transwell放入Endohm-6测量室中，并盖上盖子，使顶端电极浸入顶端室的200 μL PBS中；基底电极已集成在Endohm-6测量室的底部。
  6. 等待EVOM读数稳定后，记录原始TEER测量值。
  7. 如需进行滴度测定，在完成TEER测量后按上述方法收集ASL样本（收集于为TEER测量而加入的200 μL含Ca2+/Mg2+的PBS中）。
    注意：ASL样本的采集可能引起上皮屏障的微小撕裂，从而干扰TEER读数，因此ASL必须在TEER测量之后采集。此外，在TEER测量前不得立即更换基底侧培养基，否则也可能影响TEER数值。
  8. 将原始TEER读数转换为最终单位为Ohms/cm2的测量值时，需减去空白TEER值，并将结果乘以Transwell膜的表面积，计算公式如下（公式1）：
    TEER = [TEER读数 - 空白TEER值] × (Transwell膜表面积)    (1)
  9. 对于HCoV病毒，应在感染后每24小时或48小时评估一次TEER；不同病毒引起的TEER变化动力学常有差异，需在不同时间点进行优化和排查。
  10. 测量TEER时，应始终包括模拟感染（mock-infected）的培养物，并在每个时间点进行评估（作为阴性对照）。
    注意：对于模拟感染的培养物，在完成细胞分化后，TEER测量值应保持稳定或较基线略有上升。膜支持物的表面积因Transwell的尺寸和制造商而异；24孔Transwell的典型表面积为0.33 cm2。

5. 感染过程中细胞毒性的测定 通过 乳酸脱氢酶（LDH）检测

注意：本研究中，使用市售的细胞毒性检测试剂盒对ASL样本中的LDH含量进行定量。基础培养基中的LDH信号通常低于检测限，且相较于HCoV感染培养物的ASL样本中定量的LDH，其重复性通常较差。

  1. 准备乳酸脱氢酶（LDH）检测所需的额外对照。
    1. 背景对照：使用 PBS（如果 ASL 样本是以含钙和镁的 PBS 收集的，则使用含有钙和镁的 PBS）。
    2. 阳性对照（最大值）：在气液界面顶部加入Triton X-100进行处理。收集Triton对照孔（通常在每个时间点使用三个气液界面培养样本）。
      1. 添加 200 μL 将2% Triton X-100的PBS溶液直接加入transwell的顶室。
      2. 孵育10-15分钟，使细胞完全裂解。
      3. 收集全部体积作为Triton顶面样品。
    3. 阴性对照（低对照/基础LDH释放）：收集与感染培养物来自同一供体的模拟感染ALI培养物的ASL。
      1. 按照上述ASL收集步骤收集阴性对照模拟ASL。
        注意：同一款Transwell可用于所有时间点的该阴性对照，而Triton对照则需要为每个时间点使用新的Transwell。
  2. 为了在测定每份ASL样本的LDH读数的同时对脱落病毒进行定量，按如下方式加载光学透明平底黑色96孔板：
    1. 用 PBS 稀释所有样品，使用 45 μL 样品和 55 μL PBS（100 μL 总体积）。
    2. 以相同方式处理Triton阳性对照和模拟背景对照样本。
      注意：此稀释度可满足每个实验样本的三重加样需求（45 μL x 3）以及足量的残留ASL体积用于滴定 通过 噬斑测定
    3. 将LDH板设为三复孔：Triton最大释放对照、模拟背景对照、PBS对照及实验样品。
    4. 按照制造商的说明配制反应混合液（染料溶液 + 催化剂）。
      1. 添加 100 μL 向每孔加入反应混合液，避光于室温孵育20分钟。
    5. 20分钟后，在492 nm处测定吸光度。
    6. 使用公式（基于Triton的上限值）计算相对细胞毒性的百分比2).
      细胞毒性（%）  用于实验分析的百分比计算公式，涉及Triton对照和模拟处理值    (2)

6. 用于免疫荧光（IF）成像的鼻部气液界面（ALI）培养物的制备

  1. 将transwell转移至新的24孔板中，并从顶端用PBS洗涤3次（若需滴定病毒，收集第一次PBS洗涤液作为ASL；随后再进行两次PBS洗涤，以去除可能影响免疫荧光质量的过量脱落病毒）
  2. 最后一次PBS洗涤后，从顶端和基底端加入4%多聚甲醛（PFA）覆盖transwell。
  3. 在4% PFA中固定30分钟，随后去除固定液，并用PBS洗涤3次。
  4. 使用锋利的剃须刀片或剪刀切除含有细胞的transwell支撑膜。
  5. 为增加每个transwell可检测的免疫荧光靶标数量，可将每张膜切成两半，并用不同的抗体组合分别对每一半进行染色。
  6. 用含0.2% Triton X-100的PBS处理10分钟以进行透化。
  7. 在室温下用含10%正常驴血清和1% BSA的PBST（PBS + 0.2% Triton X-100）封闭60分钟。
    注意：从本步骤开始，需避免样品暴露于光照下。
  8. 在4 °C下用一抗溶液孵育过夜。所有抗体均以1:1,000比例用封闭缓冲液稀释。
    注意：以下列出了用于HCoV核衣壳染色以及上皮细胞类型标志物和细胞骨架染色的代表性抗体（有关生产厂家信息和目录号，请参见材料表）。
    1. 针对HCoV抗原染色，使用靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白、MERS-CoV核衣壳蛋白和HCoV-NL63核衣壳蛋白的抗体。
    2. 为鉴定上皮细胞类型，使用靶向杯状细胞标志物MUC5AC和纤毛细胞标志物IV型β-微管蛋白的抗体。
    3. 对于细胞骨架标志物，使用靶向鬼笔环肽（结合F-actin）和上皮细胞黏附分子标志物EpCAM（CD326）的抗体。
  9. 在室温下用二抗溶液孵育60分钟；二抗染料以1:1,000比例用封闭缓冲液稀释。
  10. 染色完成后，用刮勺将膜转移至载玻片上，使transwell的顶端面向载玻片，然后加入封片液。静置15–30分钟后，在边缘涂抹透明指甲油密封。
  11. 使用共聚焦显微镜采集图像（Z轴步进：0.5 μm；逐帧扫描）1,16,17。
    ​注意：在4% PFA中固定培养物并用PBS洗涤后，固定后的培养物可在染色和成像制备前于4 °C保存数周至数月。膜染色并封片后，样品可在避光条件下于4 °C长期保存（>2年）。

7. 用于蛋白质印迹分析的细胞内蛋白收集或用于RT-qPCR分析的RNA收集

  1. 若需定量病毒滴度（方案第2节），请按上述方法收集ASL。
  2. 将transwell转移至洁净的24孔板中，因为刮取膜时可能导致插入物破裂。
  3. 进行Western blot分析时，在125 μL RIPA裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 8，150 mM NaCl，0.5% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS，1% NP40）中收集总蛋白裂解液，并加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
  4. 向顶端室加入125 μL RIPA缓冲液，孵育5–10分钟。
  5. 使用P200移液器吸头刮取膜表面，以去除任何残留的贴壁细胞，并收集全部液体（在整个膜表面用力刮擦，然后反复吹打数次以确保完全收集样品）。
  6. 将蛋白裂解样品置于冰上孵育10分钟，随后在4 °C下以最大速度（20,000 × g）离心10分钟。
  7. 根据制造商说明书，将上清液与含β-巯基乙醇（还原剂）的4× Laemmli上样缓冲液混合。
  8. 将蛋白样品在95 °C下煮沸5分钟，然后按照传统的Western blot实验流程进行电泳和转膜1,16,17。
  9. 如需收集总RNA，请选用 commercially available RNA提取试剂盒。
    注意：24孔transwell插入物的顶端室最大容积约为200 μL；因此，我们对每份培养物进行两次连续洗涤，以达到推荐的总体积。以下步骤对应于在350 μL总体积中推荐的RNA样本收集方法。
  10. 向感染后的transwell顶端室中加入200 μL裂解缓冲液。
  11. 静置5–10分钟，用移液器吸头刮下膜上残留的细胞，并将全部液体转移至已标记的微量离心管中。
  12. 向transwell的顶端室中再加入150 μL裂解缓冲液，吹打数次后收集至同一微量离心管中。
  13. 按照试剂盒制造商提供的说明书提取RNA。

结果

代表性图示部分改编自 Otter 等人手稿中提供的数据1。采用上述方案，将来自四至六名供体的鼻腔气液界面（ALI）培养物分别接种四种人冠状病毒之一（SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-NL63 和 HCoV-229E），每种病毒的平均顶端释放病毒滴度如图1A所示。尽管这四种人冠状病毒均能在鼻腔ALI培养物中有效复制，但SARS-CoV-2和HCoV-229E的复制效率最高。需注意，此处展示的是平均病毒滴度，各HCoV在个体供体中的病毒滴度数据已近期发表1。按照第3部分方案清洗鼻腔ALI培养物后，MERS-CoV在顶端表面液体（ASL）中的滴度与细胞内病毒滴度的比较结果如图1B所示。感染后48小时（hpi），MERS-CoV的细胞内病毒滴度与顶端释放的病毒滴度大致相同。

对感染的鼻部气液界面（ALI）培养物进行免疫荧光成像是一种强大的工具，可用于研究细胞嗜性及其他感染相关参数，例如合胞体形成、细胞间融合以及上皮屏障完整性的损伤。通过使用针对病毒抗原（如核衣壳蛋白或HCoV非结构蛋白）的抗体，与纤毛细胞或杯状细胞标志物（分别为IV型β-微管蛋白和MUC5AC）对感染的培养物进行共染色，可确定HCoV在鼻部ALI模型中的细胞嗜性25,26。图2A展示了鼻部培养物感染SARS-CoV-2、MERS-CoV和HCoV-NL63后的代表性图像。

SARS-CoV-2 和 HCoV-NL63 主要感染纤毛细胞（通过病毒核衣壳染色与纤毛标志物 IV 型 β-微管蛋白的共定位，以及病毒抗原与杯状细胞标志物 MUC5AC 无共定位得以证实）。在鼻部气液界面（ALI）培养模型中，MERS-CoV 主要感染非纤毛杯状细胞，其感染模式与上述相反，表现为病毒抗原染色与 MUC5AC 共定位，而病毒核衣壳染色与 IV 型 β-微管蛋白共定位极少。可使用如结合肌动蛋白丝的鬼笔环肽（phalloidin）或上皮细胞黏附分子（EpCAM）等标志物来观察上皮细胞骨架，并检测上皮屏障完整性的丧失27。图 2B 展示了鼻部 ALI 培养物中的鬼笔环肽染色结果；图 1 显示模拟感染培养物中完整的细胞骨架 F-肌动蛋白超微结构，图 2 显示 HCoV-NL63 感染培养物中鬼笔环肽结构完整性丧失，提示上皮屏障功能可能受损。此类上皮标志物可用于人冠状病毒感染研究，以表征感染过程中上皮屏障动态变化。

在用四种HCoV分别感染鼻腔气液界面（ALI）培养物后，监测跨上皮电阻（TEER）。感染前（0 hpi）记录基础TEER值，并在96 hpi和192 hpi时再次评估每个Transwell小室的TEER。图3展示了每种HCoV的TEER变化。图3A、B显示ΔTEER值（通过从任意时间点测得的TEER中减去0 hpi的基础TEER值，计算每个Transwell小室的TEER差值）。对于SARS-CoV-2、MERS-CoV和HCoV-NL63，TEER的主要变化发生在感染后期（192 hpi），图3A表明SARS-CoV-2和HCoV-NL63感染导致ΔTEER值为负（192 hpi - 0 hpi），而MERS-CoV感染则未出现此现象。同时提供了模拟感染（mock）的ΔTEER值作为对照，显示MERS-CoV感染后的TEER变化与模拟感染相比无显著差异。负的ΔTEER值表明上皮屏障完整性的降低以及上皮屏障功能的受损。图3B显示HCoV-229E的ΔTEER值（基于96 hpi和192 hpi计算）。HCoV-229E在较早时间点（96 hpi）即引起上皮屏障功能障碍，但在较晚时间点（192 hpi）恢复至模拟感染水平。这些数据突显了不同病毒之间TEER动力学的差异。图3C、D显示TEER变化轨迹，描绘了每个感染Transwell小室随时间推移的原始TEER数据，从而可直观呈现感染过程中TEER的变化趋势。如需要，可在TEER实验中加入细胞因子IL-13处理作为阳性对照，因为IL-13可破坏紧密连接，损害上皮屏障功能，从而增加气道上皮的膜通透性；因此，预期细胞因子IL-13会导致TEER值下降28,29,30。

为补充鼻腔培养物中的TEER测量，可对细胞毒性进行定量分析 通过 感染期间顶端释放的乳酸脱氢酶（LDH）的定量分析 图4 显示了来自10名供体的鼻腔培养物在感染所检测的每种人冠状病毒（HCoV）后96小时和192小时的平均细胞毒性数据。SARS-CoV-2、HCoV-NL63和HCoV-229E在鼻腔培养物中引起显著的细胞毒性，而MERS-CoV则不引起明显细胞毒性。

从感染的鼻黏膜培养物中收集的总蛋白或RNA可用于研究多种人冠状病毒（HCoV）与宿主之间的相互作用。我们使用2型细胞因子IL-13处理鼻黏膜培养物，以诱导杯状细胞增生，模拟哮喘气道的组织环境。图5A展示了经IL-13处理后，两种主要HCoV受体mRNA丰度的qPCR定量结果。DPP4是MERS-CoV的细胞受体，而ACE2是SARS-CoV-2和HCoV-NL63的共同细胞受体。IL-13处理显著增加了DPP4的表达，但对ACE2的表达无明显影响。图5B展示了在未感染及SARS-CoV-2感染的培养物中，经IL-13处理后蛋白丰度的Western blot分析结果。IL-13处理显著增加了MUC5AC（杯状细胞标志物）的表达，同时降低了IV型β-微管蛋白（纤毛细胞标志物）的表达，反映了该细胞因子处理所预期引起的杯状细胞增生。蛋白水平分析显示，IL-13处理可上调DPP4表达，但下调ACE2表达。针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白的Western blot检测表明，与假处理的培养物相比，IL-13处理导致病毒抗原略有减少。在对鼻黏膜气液界面（ALI）培养物进行干预和/或感染HCoVs后，可对任何感兴趣的mRNA或蛋白进行类似的分析。

SARS-CoV-2 及其他冠状病毒的平均病毒滴度图表；比较气液界面与细胞内滴度
图1鼻腔气液界面培养物中HCoV的复制 来自六名或四名供体的鼻腔培养物分别以MOI = 5感染SARS-CoV-2（6）、MERS-CoV（6）、HCoV-NL63（6）或HCoV-229E（4），每种条件设三个重复。于感染后0小时、48小时、96小时和144小时收集顶侧表面液体，并通过噬斑实验定量检测具有感染性的病毒。A) 所有感染每种人冠状病毒（HCoV）的供体的平均病毒滴度如图所示。B来自同一供体的鼻腔培养物以 MOI = 5 进行三重复感染，并在感染后 48 小时收集气液界面液。收集气液界面液后，Transwell 小室用 PBS 洗涤 3 次，随后裂解 通过 冻融以定量细胞内病毒。通过噬斑实验定量顶端脱落腔室与细胞内腔室中的感染性病毒。数据以均值 ± 标准差表示。缩写：ALI = 气液界面；MOI = 感染复数；ASL = 顶端表面液体；hpi = 感染后小时；PBS = 磷酸盐缓冲液。本图基于 Otter 等人发表的数据构建。1. 请点击此处以查看此图的放大版本。

病毒蛋白表达的荧光显微镜图像，SARS-CoV-2，MERS-CoV，HCoV-NL63，微管蛋白。
图 2：鼻部气液界面培养物的免疫荧光成像，用于表征细胞嗜性及上皮完整性。 （A）鼻部气液界面培养物以 MOI = 5 感染 SARS-CoV-2、MERS-CoV 或 HCoV-NL63，并于感染后 96 小时用 4% 多聚甲醛固定。按照上述第 6 部分实验方案所述方法进行免疫荧光染色，一抗分别针对各病毒的核衣壳蛋白（红色显示）、纤毛细胞标志物 IV 型 β-微管蛋白（绿色显示）或杯状细胞标志物 MUC5AC（绿色显示）。值得注意的是，由于与 MUC5AC 抗体存在种属不兼容问题，此处使用针对 MERS-CoV 非结构蛋白 8（nsp8）的抗体替代核衣壳蛋白抗体。病毒抗原与各上皮细胞标志物的共定位在合并图像中表现为橙色/黄色。 （B）使用鬼笔环肽（标记肌动蛋白细胞骨架纤维）对鼻部气液界面培养物进行染色，以观察细胞骨架完整性，呈粉红色显示；Hoescht 染色呈蓝色。图 2B.1 显示清晰完整的鬼笔环肽染色，表明细胞骨架结构完整；而图 2B.2 显示上皮完整性丧失，鬼笔环肽染色模糊。比例尺 = （A）50 µm，（B）10 µm。缩写：ALI = 气液界面；MOI = 感染复数；hpi = 感染后小时。本图基于 Otter 等人发表的数据构建。 请点击此处查看该图的放大版本。

假感染和冠状病毒感染中的TEER变化；柱状图和折线图详细展示了TEER测量结果。
图3：感染期间ALI培养模型中跨上皮电阻（TEER）的测量。（A）来自10名供体的鼻腔ALI培养物分别接受假感染或以MOI = 5感染SARS-CoV-2、MERS-CoV或HCoV-NL63。每个Transwell的ΔTEER计算为192 hpi时的TEER减去0 hpi时的TEER（基线TEER）。每根柱状图表示每个供体三复孔培养物中各病毒对应的平均ΔTEER值。（B）来自8名供体的鼻腔ALI培养物接受假感染或以MOI = 5感染HCoV-229E。ΔTEER从基线TEER计算，方法同（A），使用96 hpi或192 hpi时的TEER值。（C、D）展示了来自4名供体的假感染或HCoV感染培养物的TEER动态变化数据。每条曲线代表单个Transwell随时间变化的TEER数据（每个供体的三个Transwell重复检测）。供体编号采用颜色编码，并在每张图右侧的图例中显示。数据以均值±标准差（SD）形式展示于图A和图B中。缩写：ALI = 气液界面；MOI = 感染复数；hpi = 感染后小时；TEER = 跨上皮电阻。本图基于Otter等1发表的数据构建。请点击此处查看该图的放大版本。

SARS-2、MERS、NL63、229E 在感染后 96 和 192 小时的细胞毒性柱状图比较。
图 4：鼻腔 ALI 培养物感染人冠状病毒（HCoV）期间的细胞毒性定量。 来自 10 名供体的鼻腔培养物以 MOI = 5 的感染复数（MOI）进行每种 HCoV 的三重复感染，按上述方法对顶侧表面液体（ASL）样本进行乳酸脱氢酶（LDH）定量。结果显示了在 96 hpi 和 192 hpi 时所有供体测试中每种 HCoV 的平均细胞毒性。数据以均值 ± 标准差（SD）表示。缩写：ALI = 气液界面；MOI = 感染复数；hpi = 感染后小时；TEER = 跨上皮电阻；ASL = 顶侧表面液体；LDH = 乳酸脱氢酶。本图基于 Otter 等人发表的数据构建1。 请点击此处查看该图的放大版本。

基因表达分析；柱状图与蛋白质印迹；DPP4，ACE2；mRNA水平；受体研究
图5感染鼻腔培养物后进行 mRNA/蛋白质分析 使用2型细胞因子IL-13处理或模拟处理的鼻腔培养物，用于评估HCoV受体以及纤毛细胞和杯状细胞标志物表达水平的变化。AmRNA 表达水平 DPP4 和 ACE2 被定量 通过 RT-qPCR。数据显示了来自三位供体的IL-13处理培养物相对于同一供体的假处理培养物的倍数变化。数据以均值 ± 标准差表示，每个数据点代表一位供体的平均倍数变化诱导值。B从经假处理或IL-13处理、且经模拟感染或SARS-CoV-2感染的鼻腔培养物中提取总蛋白。蛋白被分离 通过 SDS-PAGE 和免疫印迹检测上皮细胞标志物（IV型β-微管蛋白、MUC5AC）、HCoV受体（ACE2、DPP4）、SARS-CoV-2核衣壳蛋白以及GAPDH。缩写：RT-qPCR = 逆转录-定量聚合酶链式反应；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。本图基于Otter等发表的数据制作。1. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本文详细描述了一种原代上皮细胞培养系统，该系统在气液界面条件下培养源自患者的鼻上皮细胞，并用于研究人冠状病毒（HCoV）与宿主之间的相互作用。分化完成后，这些鼻源性气液界面（ALI）培养物可重现人体鼻黏膜上皮的多种特征 体内 鼻腔上皮，包含纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞在内的异质性细胞群体，以及具有强烈摆动的纤毛和黏液分泌功能的完整黏膜纤毛系统。这种异质性细胞群体相较于传统呼吸道上皮细胞系，是该培养系统的关键优势，可实现对病毒感染过程中宿主细胞趋向性的表征（如图所示） 图2传统的气道上皮细胞系也缺乏功能性黏膜纤毛清除机制，而该机制与干扰素产生等先天免疫通路共同在抵御呼吸道病毒的初级防御中发挥关键作用。

方案中的关键步骤包括初始感染程序；例如，培养物必须在感染前平衡至所需温度，并且应采用一致的方法启动每次感染。这些步骤对于标准化 方法并确保 后续研究结果的可重复性至关重要。

这些方法中最重要的部分可能是对顶端释放病毒的定量，因为了解每种人冠状病毒（HCoV）独特的复制周期有助于确定最适合进行后续分析的时间点。上述免疫荧光技术同样至关重要，因为能够直观显示病毒感染情况对于研究具有重要意义 体外 具有代表性异质细胞群的鼻上皮能够准确评估病毒嗜性，并可在生理环境下进一步探究病毒与宿主之间的相互作用。

鼻上皮是所有呼吸道病毒首先接触的主要屏障部位，因此人冠状病毒（HCoV）感染很可能始于鼻上皮的初始感染，并有可能通过口-肺吸入途径扩散至下呼吸道。via这一途径可能在致病性HCoV感染（如MERS-CoV、SARS-CoV-2）引发重症肺炎和呼吸系统疾病的过程中发挥重要作用，而季节性HCoV通常仅引起上呼吸道疾病。深入理解HCoV与宿主在这一重要免疫哨兵部位的相互作用至关重要，而该鼻上皮气液界面（ALI）系统可用于表征HCoV感染过程中的病毒复制、宿主细胞嗜性，以及细胞毒性与天然免疫应答的诱导情况。

这种鼻腔气液界面（ALI）培养系统还具有高度可适应性，可用于模拟多种临床疾病状态。来自患有遗传性肺部疾病（如囊性纤维化，由氯离子通道缺陷引起；或原发性纤毛运动障碍，其纤毛摆动机制功能异常）患者的鼻腔样本可用于建立代表这些病理特征的鼻腔ALI培养模型，以研究这些患者在HCoV感染过程中可能存在的差异性影响31,32。此外，在鼻腔ALI培养分化过程中，可采用多种细胞因子处理来重现其他疾病状态的特征。例如，在分化过程中使用IL-13处理可诱导杯状细胞增生，可作为研究哮喘或过敏性气道的替代模型33,34。因此，该鼻腔ALI系统是一种强大的工具，可用于探究HCoV-宿主以及其他病毒-宿主在健康与病变鼻腔气道中的相互作用。

尽管该系统具有诸多优势，但使用鼻腔气液界面培养模型也存在一些局限性。虽然获取鼻腔细胞所需的侵入性技术远少于支气管或肺组织细胞，但气液界面培养的建立与分化过程相比传统永生化细胞系需要更长的时间和更多的资源。此外，不同供体之间在病毒感染易感性以及宿主对人冠状病毒（HCoV）感染的反应方面存在个体差异，这可能增加实验数据重复和解读的难度（因此，通常会使用来自5–10名供体的培养物进行实验，以减轻此类问题）。

披露

Susan Weiss 担任 Ocugen 的科学咨询委员会成员。Noam A. Cohen 为葛兰素史克（GSK）、阿斯利康（AstraZeneca）、诺华（Novartis）、赛诺菲/再生元（Sanofi/Regeneron）和牡蛎点制药公司（Oyster Point Pharmaceuticals）提供咨询，并拥有一项美国专利"呼吸道感染的治疗与诊断"（10,881,698 B2，WO20913112865），以及与 GeneOne 生命科学公司的一项许可协议。

致谢

本研究的资助来源如下：美国国立卫生研究院（NIH）R01AI 169537（S.R.W. 和 N.A.C.），NIH R01AI 140442（S.R.W.），退伍军人事务部杰出研究奖 CX001717（N.A.C.），退伍军人事务部杰出研究奖 BX005432（S.R.W. 和 N.A.C.）， 宾夕法尼亚大学冠状病毒及其他新发病原体研究中心（S.R.W.），Laffey-McHugh 基金会（S.R.W. 和 N.A.C.），T32 AI055400（CJO），T32 AI007324（AF）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor 二抗（488、594、647）InvitrogenVarious
BSA（牛血清白蛋白）Sigma-AldrichA7906
cOmplete mini EDTA-free 蛋白酶抑制剂Roche11836170001
细胞毒性检测试剂盒Roche11644793001
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Gibco11965-084
DPBS（杜尔贝科磷酸盐缓冲液）Gibco14190136
DPBS + 钙 + 镁Gibco14040-117
Endohm-6G 测量室World Precision InstrumentsENDOHM-6G
上皮细胞黏附分子标记物（EpCAM；CD326）eBiosciences14-9326-82
上皮细胞伏特/欧姆（TEER）测量仪（EVOM）World Precision Instruments300523
FBS（胎牛血清）HyCloneSH30071.03
成像用 FV10-ASW 软件OlympusVersion 4.02
HCoV-NL63（人冠状病毒 NL63）BEI ResourcesNR-470
HCoV-NL63 核衣壳抗体Sino Biological40641-V07E
Hoescht 染色剂Thermo FisherH3570
Laemmli 样品缓冲液（4x）BIO-RAD1610747
LLC-MK2 细胞ATCCCCL-7用于滴定 HCoV-NL63
MERS-CoV（人冠状病毒，中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV），EMC/2012）BEI Resources NR-44260
MERS-CoV 核衣壳抗体Sino Biological40068-MM10
MUC5AC 抗体Sigma-AldrichAMAB91539
Olympus Fluoview 共聚焦显微镜OlympusFV1000
Phalloidin-iFluor 647 染色剂Abcamab176759
PhosStop easy pack（磷酸酶抑制剂） RochePHOSS-RO
酶标仪 Perkin ElmerHH34000000任何酶标仪或 ELISA 读板仪均可；必须能够读取 492 nm 处的吸光度
RIPA 裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8；150 mM NaCl；0.5% 脱氧胆酸钠；0.1% SDS；1% NP40）Thermo Fisher89990可自行配制或购买
RNeasy Plus 试剂盒Qiagen74134
SARS-CoV-2（SARS 相关冠状病毒 2，分离株 USA-WA1/2020）BEI ResourcesNR-52281
SARS-CoV-2 核衣壳抗体GenetexGTX135357
Triton-X 100Fisher ScientificBP151100
Type IV β-微管蛋白抗体Abcamab11315
VeroCCL81 细胞ATCCCCL-81用于滴定 MERS-CoV
VeroE6 细胞ATCCCRL-1586用于滴定 SARS-CoV-2

参考文献

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