胰腺组织解离以分离有活力的单细胞

摘要

胰腺化生细胞是产生胰腺肿瘤的恶性细胞的前体。然而，分离完整且具有活性的胰腺细胞具有挑战性。本文介绍了一种高效的胰腺组织解离方法。所获得的细胞可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）或二维、三维共培养。

摘要

胰腺包含两大主要系统：内分泌系统和外分泌游戏副本。内分泌系统负责产生和分泌激素；外分泌系统约占胰腺的90%，包含产生和分泌消化酶的细胞。消化酶由胰腺腺泡细胞产生，储存于称为酶原颗粒的囊泡中，随后被释放至十二指肠。 通过 胰管以启动代谢过程。腺泡细胞产生的酶可杀死细胞或降解无细胞RNA。此外，腺泡细胞十分脆弱，常规的解离方案常导致大量细胞死亡，并释放出无细胞的蛋白酶和RNA酶。因此，胰腺组织消化面临的主要挑战之一是获得完整且具有活性的细胞，尤其是腺泡细胞。本文介绍的实验方案展示了一种我们开发的两步法，旨在满足这一需求。该方案可用于消化正常胰腺组织、包含癌前病变的胰腺组织，或含有大量基质细胞和免疫细胞的胰腺肿瘤组织。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最具侵袭性的癌症类型之一¹。临床证据表明，PDAC 是由外分泌系统细胞（包括腺泡细胞）在多年过程中发展而来，其驱动因素是 KRAS 原癌基因的突变²。

胰腺肿瘤包含多种不同的细胞类型，研究表明恶性细胞仅占肿瘤质量的20%–50%³。不同类型的细胞与上皮细胞相互作用，促进其转化，并增强肿瘤的形成和生长。早期事件导致腺泡细胞发生化生，进而产生一种称为胰腺上皮内瘤变（PanINs）的微小病变，这些病变在某些情况下可发展为胰腺导管腺癌（PDAC）⁴。

迫切需要研究这些相互作用并靶向关键信号。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种强大的方法，可在单细胞分辨率下揭示基因表达，从而追踪上皮细胞发生的变化，进而探索胰腺癌的发展过程。

组织解离和消化为单细胞是单细胞RNA测序（scRNA-seq）实验的第一步。胰腺组织的消化尤其具有挑战性，原因包括以下几点：（i）腺泡细胞占胰腺组织的90%以上，且含有大量消化酶，包括蛋白酶和RNase，这些酶会降低基于RNA文库的质量；（ii）腺泡细胞非常敏感，若采用标准操作流程，容易发生裂解；（iii）腺泡细胞会以极高水平表达少数基因，因此若在实验过程中发生裂解，可能污染其他细胞的基因表达谱；（iv）从肿瘤中获取的胰腺组织具有显著的间质增生（desmoplastic）特征，难以在不损伤细胞的情况下进行解剖。因此，尽管实验要求保持所有细胞类型的高存活率，但腺泡细胞数量多且敏感性高，进一步增加了实验复杂性。这些因素使得获得符合scRNA-seq实验要求的单细胞悬液——即细胞存活率高于80%且无细胞团块——变得十分困难。

本研究建立了一种使用胰蛋白酶C和胶原酶P的实验方案，并结合频繁的组织监测。该方法可在保持细胞高活性的同时实现单细胞解离，从而支持单细胞RNA测序（scRNA-seq）实验的成功进行^5,6。

方案

希伯来大学（以色列耶路撒冷）和哈达萨医学中心（以色列耶路撒冷）的联合伦理委员会（机构动物护理与使用委员会）批准了本研究的动物福利方案（MD-18-15417-5 "小鼠胰腺癌中的组织动态"），本文所述方案符合动物实验与研究相关的所有伦理规范。希伯来大学是国际实验动物评估和认可委员会认证的机构。

注意：小鼠品系编号007908、编号008179和编号019378购自杰克逊实验室。PRT（Kras+/LSL-G12D; Ptf1a-Cre^ER; Rosa26^LSL-tdTomato）小鼠通过上述品系杂交获得。实验使用6周龄至15月龄、两种性别的小鼠。他莫昔芬通过将粉末溶于玉米油中配制而成。成年小鼠（6–8周龄，雌性和雄性）在第0天和第2天以400 mg/kg剂量皮下注射他莫昔芬，之后每周观察两次。由于肿瘤位于体内，无法测量；因此，根据伦理协议，若观察到异常临床症状，则实施安乐死。小鼠在他莫昔芬诱导后的不同时间点，通过异氟烷麻醉并行颈椎脱位法处死。

1. 胰腺解剖分离

注意：为了在提取过程中获得最佳产量并确保良好的细胞活力，快速解剖至关重要。为了缩短胰腺分离所需时间，在处死小鼠之前，所有器械和设备必须预先准备好并置于冰上。

1. 通过 CO₂ 窒息法处死小鼠，并通过颈椎脱位确认死亡。自此步骤起，所有操作必须使用无菌解剖器械进行。
2. 固定小鼠，并用 70% 乙醇喷洒腹部。用剪刀和镊子在生殖区域做一长约 2.5 cm 的 V 形切口，并向上延伸，完全打开腹腔。
3. 在小鼠左侧找到胃部，胰腺位于脾脏附近。用两把镊子将胰腺从胃和十二指肠上分离（避免撕裂）。继续操作，将胰腺从小肠、空肠和回肠上分离。
4. 将胰腺移至小鼠右侧。用镊子分离胰腺与胸腔之间剩余的连接组织，彻底游离胰腺及其附着的脾脏。
5. 取出胰腺，并在冰上的培养皿中铺展开进行检查。
   注意：此步骤需格外小心，仅取胰腺组织，避免连同肠系膜脂肪或其他邻近组织一并取下，以防细胞污染。

2. 胰腺的酶解与机械解离

1. 提前配制以下缓冲液。
   1. 解离缓冲液1：每个样本使用4 mL胰蛋白酶C和6 mL磷酸盐缓冲液（PBS）（见表1）。
   2. 解离缓冲液2：9 mL 1×Hanks′平衡盐溶液（HBSS）；4%牛血清白蛋白（BSA）；1 mL胶原酶P（10 mg/mL）；200 µL胰蛋白酶抑制剂（10 mg/mL）；以及200 µL DNase I（10 mg/mL）（见表1）。
   3. 洗涤缓冲液：50 mL 1×HBSS；2 g BSA；1 mL胰蛋白酶抑制剂（10 mg/mL）；以及1 mL DNase 1（10 mg/mL）。
   4. 酶活性终止液：含5%胎牛血清（FBS）和150 g DNase I（0.2 mg/mL）的1×HBSS。
2. 将胰腺置于冰上的50 mL离心管中。用含10% FBS的1×HBSS冲洗胰腺。脂肪组织会漂浮，而胰腺会下沉。这是一种简便的方法，可直观识别并快速去除仍附着在胰腺上的白色脂肪组织污染。
3. 将小鼠胰腺组织转移至含有5 mL冰上预冷的1×HBSS的无菌培养皿中。使用Noyes剪刀和手术刀将胰腺切成1至3 mm³的小块（图2A）。若处理多个样本，应将样本保存在含10% FBS的1×HBSS中并置于冰上。
4. 将组织转移至离心管中。在4 °C下以350 × g离心5分钟。吸除上清液以去除细胞碎片和血细胞。
5. 将组织块重悬于含0.02%胰蛋白酶C和0.05% EDTA的解离缓冲液1中，在37 °C下振荡（180 rpm）孵育10分钟。立即用含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）洗涤。在4 °C下以350 g离心5分钟。
6. 用10 mL洗涤缓冲液重悬沉淀，再次在4 °C下以350 × g离心5分钟，然后进行下一步解离操作。
7. 将胰腺组织在解离缓冲液2中于37 °C下振荡（180 rpm）孵育15分钟。
8. 孵育15分钟后，使用逐渐减小规格的无菌移液管（25、10和5 mL移液管）对胰腺碎片进行剧烈吹打10次以实现机械解离，随后放回37 °C继续孵育。
   1. 再孵育5分钟后，重复机械解离操作，并通过显微镜观察单细胞悬液的比例来监测解离程度。通常情况下，若此时单细胞比例低于90%，则需延长孵育时间。使用台盼蓝染色检测细胞活力。
   2. 继续孵育，并每隔5分钟取样检测解离情况。
      注意：总孵育时间取决于组织特性，不同样本间可能存在差异。当90%以上的细胞已解离为单细胞，或检测到细胞活力下降时，应终止孵育和组织解离过程。
9. 当胰腺组织充分解离（表现为胰腺碎片消失且溶液浊度增加）（图2）后，在4 °C下用酶活性终止液洗涤两次，每次5分钟，以终止酶反应。自此步骤起，始终将细胞悬液置于冰上。
10. 将细胞悬液通过70 µm尼龙筛网过滤，并在显微镜下检测细胞活力。使用更小孔径的尼龙筛网可能会降低细胞活力。
11. 用5–10 mL冰浴缓冲洗涤液重悬并洗涤沉淀，计数细胞。
12. 若观察到较多红细胞，可在室温下用红细胞裂解缓冲液处理细胞2分钟。若发现细胞团块，应按照步骤2.5所述再次使用胰蛋白酶处理样本。使用台盼蓝染色在显微镜下检测细胞活力，若活力低于80%，应使用磁珠激活细胞分选（MACS）死细胞去除试剂盒配合MACS MS柱分离活细胞（见表1）。

结果

在最近发表的一项研究中⁵，我们应用上述方案，利用小鼠模型探索胰腺导管腺癌（PDAC）发展的早期阶段。该小鼠经过基因工程改造，携带 Ptf1a-CreER、LSL-Kras-G12D、LSL-tdTomato⁷ 等基因元件，可在注射他莫昔芬后于腺泡细胞中表达持续活化的KRAS蛋白。

在进行颈椎脱位（根据小鼠伦理操作规程）后，切除胰腺，并应用上述方案（见图1及方案部分）。

为了优化解离方案，分别在有或无胰蛋白酶C预孵育的条件下进行组织解离。结果发现，使用胰蛋白酶C预孵育可加速组织解离，且不影响细胞活力。此外，尝试了多种胶原酶，包括胶原酶D、胶原酶1a和胶原酶P（见表1）。结果显示，使用胶原酶D会导致大量细胞死亡；事实上，在其他使用该酶的研究中，腺泡细胞的比...

讨论

本文介绍了一种胰腺组织解离的实验方案。该方案操作简便，可用于在恶性病变过程的不同阶段（包括实体瘤）从胰腺组织中分离出具有活性的单细胞。在以往的研究中，曾使用不同类型的胶原酶来消化胰腺组织^8,9。使用活性较强的胶原酶（如胶原酶D）会导致获得较多的免疫细胞，而上皮细胞的比例则较低。而使用胶原酶P则适用于完整胰腺组织或肿瘤胰腺组织的消化。

根据我们的观察，所有细胞类型均可被分离。我们此前已通过免疫组织化学方法验证了免疫T细胞的浸润情况⁵；我们认为，在分析中观察到的各类细胞的相对数量能够较好地近似反映其在组织中的实际分布情况，但腺泡细胞因较为脆弱而存在代表性偏低的现象。如果需要准确评估组织中各类细胞的比例，我们建议采用免疫组织化学或空间转录组学方法^10,11,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂或资源
70 µM 尼龙网布	康宁	猫##431751
BSA	Sigma Aldrich	猫# A7906
胶原酶 P	罗氏	猫# 11213857001
关键商业检测
DAPI	Sigma Aldrich	猫#MBD0015
Dnase I	罗氏	猫# 10104159001
实验模型：生物/菌株
胎牛血清南美	ThermoFisher	Cat#10270106
Hanks'平衡盐溶液	生物工业	Cat#02-018-1A
KRASLSL-G12D小鼠	Jackson Laboratory	JAX008179
MACS 死细胞去除试剂盒	Milteny Biotec	cat#130-090-101
PBS	生物工业	cat#02-023-1A
Ptf1a-CreER 小鼠	杰克逊实验室	JAX019378
Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-td番茄 小鼠	杰克逊实验室	JAX007908
胰蛋白酶 C-EDTA 0.05%	生物工业	cat# 03-053-1A
胰蛋白酶抑制剂	Roche	cat#T6522