利用牛单核细胞来源的树突状细胞测定疫苗免疫原性

摘要

该方法描述了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的制备及其应用 体外 在潜在兽用疫苗牛体开发过程中对抗原候选物的评估

摘要

树突状细胞（DCs）是免疫系统中最具效力的抗原呈递细胞（APCs）。它们在机体内巡逻，搜寻病原体，并通过连接先天免疫与适应性免疫应答，在免疫系统中发挥独特作用。这些细胞能够吞噬并捕获抗原，随后将抗原呈递给效应免疫细胞，从而触发多种免疫应答。本文展示了一种标准化的方法 体外 从牛外周血单个核细胞（PBMCs）分离牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）的制备及其在评估疫苗免疫原性中的应用

采用磁珠分选法从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离CD14⁺单核细胞，并通过在完全培养基中添加白细胞介素（IL）-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）诱导CD14⁺单核细胞分化为初始型MoDCs。通过检测主要组织相容性复合物II类分子（MHC II）、CD86和CD40等细胞表面标志物的表达，确认未成熟MoDCs的成功生成。使用市售狂犬病疫苗刺激未成熟MoDCs，随后将其与初始型淋巴细胞共培养。

抗原刺激的 MoDCs 与淋巴细胞共培养物的流式细胞术分析显示，通过 Ki-67、CD25、CD4 和 CD8 标记物的表达，T 淋巴细胞增殖被激活。利用定量 PCR 分析 IFN-γ 和 Ki-67 的 mRNA 表达水平，结果表明 MoDCs 在该 in vitro 共培养体系中可诱导淋巴细胞产生抗原特异性启动。此外，通过 ELISA 检测 IFN-γ 的分泌水平，在狂犬病疫苗刺激的 MoDC-淋巴细胞共培养组中显著高于无抗原刺激的 MoDC-淋巴细胞共培养组（**p < 0.01）。这些结果验证了该 in vitro MoDC 检测方法在评估疫苗免疫原性方面的有效性，表明该方法可用于在开展 in vivo 试验前筛选潜在的牛用候选疫苗，同时也适用于市售疫苗的免疫原性评估。

引言

兽医疫苗接种是畜牧养殖与动物健康的关键环节，通过预防影响全球畜牧业的各类疾病，有助于提升食品安全和动物福利水平¹有效的 体外 评估潜在疫苗候选物免疫原性的方法将有助于加速 疫苗研发与生产的过程。因此，有必要基于创新方法拓展免疫检测领域 体外 研究，因为这有助于揭示与免疫接种和病原体感染相关的免疫过程的复杂性。目前， 体内 动物免疫与攻毒试验需要进行周期性取样（例如血液和脾脏），用于评估候选疫苗和佐剂的免疫原性。这类检测成本高昂、耗时较长，且存在伦理问题，因为在大多数情况下，试验结束时需对动物实施安乐死。

作为替代方案 体内 检测外周血单个核细胞（PBMCs）已被用于评估疫苗诱导的免疫应答 体外²外周血单个核细胞（PBMCs）是一类异质性细胞群体，由70%-90%的淋巴细胞、10%-20%的单核细胞以及少量树突状细胞（DCs，1%-2%）组成。³外周血单个核细胞（PBMCs）含有抗原提呈细胞（APCs），如B细胞、单核细胞和树突状细胞（DCs），这些细胞持续在机体内巡逻，寻找感染或组织损伤的迹象。局部分泌的趋化因子通过与细胞表面受体结合，促进APCs向这些部位的募集和活化。对于单核细胞而言，趋化因子可引导其分化为树突状细胞或巨噬细胞⁴一旦树突状细胞（DC）遇到并捕获病原体，便会迁移至次级淋巴器官，在此通过主要组织相容性复合体（MHC）I类或II类表面蛋白将加工后的病原体肽抗原呈递给CD8⁺ T细胞或CD4⁺ T细胞，从而触发免疫反应^5,6.

树突状细胞在协调针对多种病原体的保护性免疫反应中发挥关键作用，这使其成为研究细胞内免疫机制的一个重要目标，尤其是在设计针对感染性病原体的疫苗和佐剂时。⁷由于从外周血单个核细胞（PBMCs）中获得的树突状细胞（DCs）比例较小（1%-2%），因此通常采用单核细胞来诱导生成树突状细胞 体外⁸这些单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）最初被开发作为癌症免疫治疗的一种潜在治疗策略⁹近年来，MoDCs 已被用于疫苗研究^10,11,12，且经典单核细胞是用于MoDC制备的主要亚型（89%）¹³. 产物的生成 的 体外MoDCs 此前已通过联合使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与其他细胞因子（如白细胞介素-4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）或IL-13）实现^14,15,16.

一项实验的成功与否取决于多个关键因素，包括实验设计的严谨性、操作步骤的精确执行、试剂与仪器的质量，以及数据记录与分析的准确性。在科学研究中，每一个细节都可能影响最终结果的可靠性与可重复性。因此，研究人员必须严格遵循标准化操作流程，确保实验条件的一致性，并对潜在的干扰因素进行有效控制。此外，良好的实验记录习惯和透明的数据报告也是确保研究可信度的重要环节。通过系统化的质量控制与同行验证，可以进一步提升实验结果的科学价值与应用前景。 体外 MoDC 实验依赖于抗原刺激后成熟的 MoDC 调控免疫应答强度和类型的能力，该免疫应答特异性地针对所识别的抗原类型¹⁷. MoDCs 识别并呈递的病原体类型决定了 CD4⁺ 辅助性T细胞（Th细胞）可分化为Th1、Th2或Th17效应细胞，其特征在于产生针对特定病原体的分泌型细胞因子谱。Th1应答针对胞内病原体，分泌干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-β（TNF-β），介导依赖吞噬细胞的免疫保护。Th2应答针对寄生虫感染，以分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13为特征，启动不依赖吞噬细胞的体液免疫保护。Th17应答通过分泌IL-17、IL-17F、IL-6、IL-22和TNF-α，介导针对胞外细菌和真菌感染的中性粒细胞依赖性免疫保护。^18,19,20,21根据以往研究，有观点指出并非所有病原体都符合预期的细胞因子谱型。例如，皮肤来源的单核细胞衍生树突状细胞（MoDCs）在应对某些刺激时 利什曼原虫 寄生虫感染，刺激CD4细胞分泌IFN-γ⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞，从而诱导产生具有保护作用的促炎性Th1反应²².

研究还表明，在用Salmonella脂多糖（LPS）致敏的鸡源MoDCs中，可通过激活Th1和Th2反应，对Salmonella typhimurium产生可变的免疫应答；而Salmonella gallinarum仅诱导Th2反应，这可能解释了后者对MoDC清除作用具有更高抵抗力的原因 ²³。在犬源和人源MoDCs中均已有报道MoDCs对Brucella canis (B. canis)的激活作用，表明这可能代表一种人畜共患感染机制²⁴。经B. canis致敏的人源MoDCs可诱导强烈的Th1反应，从而赋予对严重感染的抵抗力；而犬源MoDCs则诱导以Th17反应为主、Th1反应减弱的免疫应答，进而导致慢性感染的建立²⁵。与单独的非偶联口蹄疫病毒（FMDV）相比，牛源MoDCs对与免疫球蛋白G（IgG）偶联的FMDV表现出更强的亲和力，因为MoDCs会对前者形成病毒-抗体复合物¹⁰。综上所述，这些研究揭示了MoDCs如何被用于分析病原体感染过程中免疫应答的复杂性。适应性免疫应答可通过量化与淋巴细胞增殖相关的特异性标志物进行评估。Ki-67是一种仅在分裂细胞中检测到的胞内蛋白，被视为增殖研究的可靠标志物²⁶；同样，T细胞在活化晚期表面表达的CD25也对应于淋巴细胞增殖^27,28。

本研究展示了一种标准化的方法 体外 牛MoDCs的制备及其在后续实验中的应用 体外 用于检测疫苗免疫原性的免疫学检测方法。采用一种市售的狂犬病疫苗（RV）来验证该检测方法的有效性。通过流式细胞术、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附试验检测T淋巴细胞的活化与增殖情况。 通过分析公认明确的细胞活化标志物（如Ki-67和CD25）以及IFN-γ的分泌，进行酶联免疫吸附测定（ELISA）^28,29,30,31在MoDC检测过程中，未进行任何动物或人体实验。

方案

血液采集由经认证的兽医服务机构按照奥地利健康与食品安全局（AGES）的伦理准则并符合公认的动物福利标准进行³²。本研究已获得奥地利农业部的伦理批准。MoDCs 的生成及其后续应用的实验设计如图1所示。

1. 初始MoDCs的制备

注意：通过颈静脉穿刺，使用含肝素的真空采血管从一头无特定病原体的犊牛采集全血样本（本研究共使用八支9 mL血液采集管）。将血液置于冰盒中运输。样本可储存于2-4 °C以备后续使用，或立即进行处理。保持血液持续旋转以防止凝血。使用70%乙醇对真空采血管进行消毒。以下所有实验均使用一个生物学样本和六个技术重复进行。

1. 采用密度梯度离心法从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞（PBMCs）
   1. 通过反复倒置10次，充分混匀血液。
   2. 使用10 mL移液器将20 mL肝素抗凝血转移至无菌50 mL离心管中，并加入10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）进行稀释。
   3. 向无菌50 mL离心管中加入15 mL淋巴细胞分离液。
      注意：在移液前，应使淋巴细胞分离液恢复至室温。
   4. 将装有淋巴细胞分离液的50 mL离心管倾斜至45°角。将25 mL移液器的吸头垂直插入，小心地将30 mL血液-PBS混合液分层加至淋巴细胞分离液上方，避免两液层混合。随后缓慢将离心管恢复至垂直位置。
   5. 在20 °C条件下，以800 × g离心35分钟，加速度设为最大，不启用刹车（即关闭减速功能）。
   6. 使用巴斯德移液管收集PBMC层（位于血浆层下方的薄白色层），并将其转移至新的50 mL离心管中。
      注意：密度梯度离心可将全血分离为不同层次。红细胞沉降到底部形成沉淀，单个核细胞（PBMCs）位于界面层，血浆位于最上层。粒细胞则位于沉淀与PBMC层之间。
   7. 用PBS加至总体积40 mL，通过反复吹打充分混匀，洗涤收获的PBMCs两次。然后在4 °C条件下，以500 × g离心7分钟，加速度和减速度均设为最大。
   8. 倾去上清液，将沉淀重悬于15 mL 1×氯化铵-氯化钾（ACK）缓冲液中，在室温下孵育10–15分钟。
      注意：孵育时间不得超过15分钟。商用ACK缓冲液用于裂解PBMC组分中残留的红细胞（RBCs）。
   9. 加入PBS至总体积40 mL，然后在4 °C条件下，以500 × g离心7分钟，加速度和减速度均设为最大。
   10. 倾去上清液，并重复步骤1.1.9。
   11. 弃去上清液，将沉淀重悬于10 mL完全培养基（室温）中。
       注意：完全培养基由RPMI 1640细胞培养基添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素组成。
2. 使用CD14偶联磁珠从PBMC群体中磁性分离CD14^+/−细胞
   1. 取10 µL细胞悬液与10 µL 0.4%台盼蓝溶液混合，使用洁净的血细胞计数板进行细胞计数。
      注意：台盼蓝为有毒化学物质，可能具有致癌性。操作时应佩戴个人防护装备（PPE）以避免接触，废弃物应置于密闭的专用有毒废物容器中。在显微镜下，死细胞呈蓝色，活细胞则呈透明状。
   2. 以500 × g离心7分钟。
   3. 用移液器弃去上清液，按每1 × 10⁷个细胞加入40 µL荧光激活细胞分选缓冲液（FACS缓冲液）重悬沉淀，并用移液器充分混匀。
      注意：FACS缓冲液由PBS中溶解2% FBS和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）组成。
   4. 每1 × 10⁷个细胞加入5 µL CD14微珠缓冲液，并用移液器充分混匀。
   5. 在4–8 °C条件下孵育30分钟，以实现牛CD14⁺单核细胞的阳性筛选³³。孵育期间每15分钟涡旋混匀一次。
   6. 可选步骤（用于流式细胞术分析）：加入10 µL CD14-FITC（异硫氰酸荧光素）标记抗体，随后在4–8 °C条件下孵育15分钟。详见步骤5中的流式细胞术分析。
   7. 加入1 mL FACS缓冲液，以500 × g离心7分钟。
   8. 弃去上清液，按每1 × 10⁸个细胞加入500 µL FACS缓冲液重悬沉淀。
   9. 将免疫磁性细胞分离柱插入磁力架（磁柱支架）中，并在柱出口下方放置一个15 mL收集管，用于收集穿流液。
   10. 用1 mL脱气FACS缓冲液洗涤柱子。冲洗后，更换新的15 mL收集管。
   11. 通过移液器将细胞悬液（来自步骤1.2.8）分次加入柱中，每次加入500 µL缓冲液中含有1 × 10⁸个细胞，使其流经柱子。
       注意：在将细胞加入柱子前混匀时，应注意避免产生气泡。
   12. 每次用3 mL脱气FACS缓冲液冲洗柱子，重复3次。
   13. 收集穿流液，并将此第一洗脱组分标记为CD14⁻细胞组分（即去除CD14⁺单核细胞后的PBMCs）；该组分也称为初始淋巴细胞组分。
       注意：CD14⁻细胞在完全培养基中保存，直至抗原脉冲MoDCs制备完成。
   14. 将分离柱从磁力架上取下。
   15. 在柱子下方放置一个新的无菌15 mL离心管，用于收集流出液。
   16. 向柱中加入5 mL FACS缓冲液，并立即用推杆将其推出。
   17. 收集流出液，并将此第二洗脱组分标记为CD14⁺细胞组分；该组分也称为初始单核细胞组分。
   18. 向收获的CD14⁺单核细胞中加入完全培养基，调整至细胞浓度为1 × 10⁶个细胞/mL。
       注意：对洗脱得到的CD14⁺细胞组分中的活细胞进行计数，以估算达到目标细胞浓度所需的完全培养基体积。
   19. 取无菌24孔板，向每孔加入1 mL细胞悬液（1 × 10⁶个细胞/mL）。
3. 通过添加3% w/v细胞因子混合物（GM-CSF + IL-4）将CD14⁺初始单核细胞分化为初始MoDCs，共孵育5天
   1. 向每孔含CD14⁺单核细胞的培养孔中加入40 µL（3% w/v）试剂盒提供的细胞因子混合物。
   2. 将培养板置于含5% CO₂、37 °C的湿润培养箱中孵育48小时。
   3. 第2天，用移液器将每孔一半内容物（500 µL）转移至各自的1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以500 × g离心7分钟。
   4. 弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL新鲜完全培养基中。
   5. 将步骤1.3.4所得细胞悬液500 µL重新转移回对应孔中，使最终体积为1 mL。
   6. 每孔补充20 µL细胞因子混合物。
   7. 将培养物在含5% CO₂、37 °C的湿润培养箱中继续孵育72小时。
   8. 第5天孵育结束后，将培养板从培养箱中取出。
      注意：每孔将含有1 mL初始MoDCs的细胞悬液。MoDCs数量约为最初接种单核细胞数（1 × 10⁶/mL）的一定比例（约20%）。

2. MoDC 吞噬活性检测

注意：抗原摄取实验或内吞活性实验用于检测未成熟 MoDCs 内化外来物质的能力。按照先前所述方法³⁴，使用在含 3% w/v 细胞因子混合物的培养基中培养并孵育 5 天的未成熟 MoDCs 进行该实验。

1. 从24孔板中收集未成熟MoDC细胞悬液，转移至15 mL离心管中；并用PBS冲洗各孔，收集残留细胞。
2. 以500 ×g离心7分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL含1% FBS的培养基中。
3. 计数活MoDC细胞，以估算达到目标细胞浓度（2 × 10⁵ 个细胞/mL）所需的培养基体积。
4. 将未成熟MoDC细胞以2 × 10⁵ 个细胞/mL的终浓度接种于24孔板中，每孔加入100 µL完全培养基进行培养。
5. 每孔加入1 mg/mL的FITC标记葡聚糖（作为内吞示踪剂的荧光探针）。
   注：FITC-葡聚糖作为荧光探针，用于示踪内吞作用。
6. 盖好培养板，在5% CO₂、37 °C条件下避光孵育60分钟。
   ​注：对于背景对照，将额外的MoDC细胞（2 × 10⁵ 个细胞/mL）与1 mg/mL FITC-葡聚糖在冰上孵育，该条件可阻止示踪分子（FITC-葡聚糖）进入细胞。
7. 孵育结束后，立即将24孔板置于冰上，以终止FITC-葡聚糖的内吞过程。
8. 用预冷的FACS缓冲液洗涤细胞。
9. 收集细胞，离心后将沉淀重悬于500 µL FACS缓冲液中。
10. 通过流式细胞术分析细胞内FITC-葡聚糖的荧光强度。具体操作详见步骤5.2中的流式细胞术分析部分。

3. 抗原脉冲MoDCs的制备

注意：一种市售且经临床批准的狂犬病病毒（RV）疫苗可诱导未成熟 MoDCs 分化为成熟的抗原呈递 MoDCs。使用单剂 RV 疫苗剂量的 0.1%（约 1 µL）来制备抗原脉冲 MoDCs。此外，建议在用于生成未成熟 MoDCs 的同一块培养板（步骤 1.3.8 中使用）中制备 RV 脉冲 MoDCs，因为将未成熟 MoDCs 转移至新的 24 孔板会对细胞产生不利影响。

1. 从步骤1.3.8开始）向24孔板中1 mL的未成熟MoDC培养物中加入1 µL/mL的RV悬液，在5% CO₂、37 °C条件下培养48小时。
   注意：未接受RV刺激的未成熟MoDC作为背景对照（并在后续步骤中用于与淋巴细胞共培养时的非特异性刺激对照）。
2. 培养结束后，在第7天将含有抗原脉冲MoDC的24孔板置于冰上10分钟。
3. 每孔加入1 mL预冷的PBS，通过移液器充分混匀各孔，然后将悬液转移至15 mL离心管中。
4. 用2 mL预冷的PBS洗涤各孔，以收集残留于孔内的细胞。
5. 将洗涤液转移至相应的离心管中，于500 × g 离心7分钟。
6. 弃去上清液，将细胞沉淀（抗原脉冲MoDCs）重悬于完全培养基中，并调整体积使最终细胞浓度为1 × 10⁵ 个细胞/mL。
   注意：计数活细胞以估算达到目标细胞数量所需的培养基体积。使用第7天的RV脉冲MoDC进行MoDC-淋巴细胞共培养体系。

4. MoDC-淋巴细胞共培养

注意：in vitro MoDC-淋巴细胞共培养系统用于评估MoDCs启动抗原特异性淋巴细胞的能力。经过16天共培养后，不同处理组包括特异性组、非特异性组和对照组。特异性组定义为与狂犬病疫苗（RV）脉冲的MoDCs共培养的淋巴细胞；非特异性组定义为与未脉冲抗原的MoDCs共培养的淋巴细胞；对照组定义为不与MoDCs共培养的淋巴细胞。

1. 向洗脱的初始淋巴细胞组分（CD14⁻）中加入完全培养基⁻ 细胞，使细胞浓度达到 2 × 10⁶ 细胞/毫升
   注意：对 CD14+ 细胞悬液中的活细胞进行计数⁻ 自采集以来已在24孔板的完全培养基中维持培养的细胞，用于估算达到目标细胞数量所需的培养基体积。
2. 第7天，取一个无菌的24孔板，每孔加入1 mL初始淋巴细胞悬液（2 × 10⁶ 细胞/mL）加上1 mL抗原脉冲或非抗原脉冲MoDC悬液（1 × 10⁵ 细胞/毫升
   注意：每孔总体积为 2 mL，MoDCs 与淋巴细胞的比例为 1:20。
3. 在37℃下孵育平板48小时 °C 和 5% CO₂₂.
4. 抗原脉冲MoDC的培养扩增及再刺激
   1. 在抗原脉冲的MoDC-淋巴细胞共培养孵育至第9天后，每孔补充20 ng/mL重组IL-2，并继续孵育120小时（即5天孵育）。
   2. 第14天，将1 mL共培养物转移至无菌的1.5 mL离心管中，在500 × g条件下离心 × g 7分钟
   3. 弃去上清液，用1 mL抗原脉冲或非抗原脉冲的MoDCs重悬细胞沉淀（1 × 10⁵ 细胞/mL）。用移液器轻轻混匀，并将细胞悬液转移回指定的孔中。
      注意：此步骤中，每孔的总体积为 2 mL。
   4. 继续在5% CO₂条件下孵育₂ 和 37 ˚37°C 培养 48 小时。第 16 天孵育结束后，共培养体系可用于流式细胞术、qPCR 和 ELISA 分析。
      ​注意：在每孔2 mL的MoDC-淋巴细胞共培养体系中，取1 mL重悬细胞用于流式细胞术染色，1 mL用于RNA提取，两者的上清液均用于ELISA检测。

5. 流式细胞术分析

注意：在将样本上机进行流式细胞术检测之前，需使用适当的标记物/单克隆抗体对细胞进行染色。有关流式细胞术分析所用试剂（染色单克隆抗体和同型对照）、试剂盒、仪器及软件的详细信息，请参见材料表。

1. 流式细胞仪染色方案
   注意：使用抗CD14单克隆抗体（mAb）对PBMCs、初始淋巴细胞和单核细胞进行细胞表面染色（步骤1.2.6）。对初始MoDCs的细胞表面染色，使用特异性抗CD86、特异性抗CD40和特异性抗MHC II单克隆抗体。对第16天共培养细胞的细胞表面染色，使用抗CD4、抗CD8和抗CD25单克隆抗体；对于胞内染色，使用抗Ki-67单克隆抗体。此外，使用同型阴性对照单克隆抗体或不加单克隆抗体（FMO：荧光减一）对细胞进行染色。细胞表面标记物与胞内标记物染色的主要区别在于，表面标记物染色需在活/死细胞（L/D）染色或其他处理步骤之前，先用特异性表面单克隆抗体对细胞进行染色；而胞内染色则需在L/D染色之后进行，并需经过固定和透化步骤，以允许抗体进入细胞内部。
   1. 使用移液器将1 mL细胞悬液转移至无菌的1.5 mL离心管中，在500 ×g条件下离心10分钟 × g.
      注意：离心后，在处理 MoDC-淋巴细胞共培养的细胞时，保留上清液用于 ELISA 分析。
   2. 将沉淀重悬于1 mL PBS中，转移至15 mL离心管。用1 mL PBS收集残留细胞，并与重悬的沉淀混合。
   3. 向含有细胞的15 mL离心管中加入10 mL PBS，用移液器吹打混匀，然后以850 × g离心7分钟 g.
   4. 弃去上清液，并重复步骤 5.1.3。
   5. 弃去上清液，并用残留的悬浮液（约180 μL）小心重悬细胞沉淀。 µL）倾去上清液后剩余的体积。
   6. 将细胞悬液转移至V型底96孔板中，并密封各孔以防止溢出。
   7. 将培养板在1,400 × g下离心 × g 5 分钟。离心后，将板在废液容器上方轻弹以排空孔中液体，并将板轻拍于吸水纸上，确保去除多余液体。
   8. 加入25 µ每孔加入 L 表面染色主混合液，用移液器轻轻混匀，随后于 4 ℃ 避光孵育 ˚30 分钟，4 °C
      注意：为单个孔制备表面染色预混液时，加入 2.5 µL 表面 mAb 加入 20 µL FACS缓冲液
   9. 加入200 µ每孔加入 L FACS 缓冲液，1,400 离心 × g 离心5分钟。离心结束后，倾去孔内液体，并将板轻拍于吸水纸上以去除多余液体。
   10. 加入100 µ每孔加入 L/D 染色液 L，用移液器充分混匀，随后于 4 ℃ 避光孵育 ˚在黑暗条件下 15 分钟
       注意：对于单个孔，溶解 0.25 µ100 中的 L/D 染料 L µL 的 FACS 缓冲液。L/D 染料有助于区分活细胞与死细胞。
   11. 加入100 µ升 FACS 缓冲液。用盖子盖住孔板，以 1,400 转离心板子 × g 5 分钟。倾去上清液，并将培养板轻敲于吸水纸上。
   12. 重复步骤 5.1.11。
   13. 加入50 µ每孔加入 L 固定液（试剂盒提供），用移液器混匀，然后将培养板置于室温避光孵育 10 分钟。
   14. 加入150 µ加入 1x 破膜-洗涤缓冲液（PW）（试剂盒提供）1 L，并用盖子覆盖各孔。
       注意：配制 10 mL 1x PW 缓冲液时，将 1 mL 10x perm 缓冲液用 dH₂O 定容至 10 mL。₂O.
   15. 以1,400 × g离心培养板 × g 4℃下离心5分钟 ˚C. 倾去上清液，并将培养板轻叩于吸水纸上。
   16. 加入200 µ升 1× PW，随后在 1,400 转/分钟离心 × g 4℃下离心5分钟 ˚C. 倾去上清液，并将培养板轻叩于吸水纸上。
   17. 用于细胞内染色，加入25 µ每孔加入 L 胞内染色主混合液（抗人 Ki-67 单克隆抗体），充分混匀，4 ℃ 避光孵育 30 分钟 ˚C 或置于冰上避光保存。
       注意：为单个孔制备胞内染色主混合液时，加入1 µL 的 Ki-67 单克隆抗体至 24 µ1×PW 的 L。细胞内染色标记仅在处理第 16 天共培养的细胞时使用。在处理 PBMCs、初始淋巴细胞、单核细胞和初始 MoDCs 时，不进行细胞内染色。
   18. 孵育后，加入200 µ每孔加入1×PW缓冲液1 L，用移液器混匀，然后以1,400 × g离心 × g 5 分钟。倾去上清液，并将培养板轻敲于吸水纸上。
   19. 加入200 µ升FACS缓冲液，随后在1,400 × g离心 × g 5 分钟后，倾去上清液，并将培养板轻敲于吸水纸上。
   20. 将细胞沉淀重悬于200 µL FACS 缓冲液，并将每孔中的内容物转移至单独的无菌流式管中。使用 300 µ每孔加入适量FACS缓冲液以收集残留细胞。细胞现可进行流式细胞术分析。
2. 在流式细胞仪上运行样本
   注意：样本按照制造商手册在流式细胞仪（使用488 nm、638 nm和405 nm激光器）上进行检测³⁵请参考说明书以获取有关该方案的详细信息、故障排除及定制化说明。
   1. 在读取样本前后执行常规清洁程序。
      注意：在将试管装入仪器时，不得跳过任何位置。
      1. 清洗循环过程中，共使用四支试管，其中第一支试管加入流路清洗试剂，其余三支试管加入dH₂O。₂O；每根试管将含有 3 mL. 清洗运行期间，以中等流速采集数据约 1 分钟 通过捕获 每管 100,000 个事件 在……之下 330 V 前向散射（FSC) 对 265 V 用于侧向散射（SSC).
         注意：清洗过程中不应报告任何碎片或细胞事件；如果发生此类情况，需重复清洗步骤。在运行样本前，务必确保所有样本均处于均匀悬浮状态，以保证数据采集的准确性。
   2. 连接并启动细胞仪，请点击 应用按钮 位于标题栏左上角。从 应用 下拉菜单，选择该选项 流式细胞术，然后点击该选项 开启电源.
      注意：从 应用 下拉菜单，该选项 开放 允许用户浏览预设的检测方法，同时该选项 新方案 允许用户创建新方案。
   3. 最初加载 阴性对照 多管架中的样品。选择 新方案，并观察 工作列表 在工作区/屏幕的左侧。
   4. 在工作列表中，定义样本在多管架中的位置，并为样本和方案命名以供识别。
   5. 从 硬件面板 位于工作区左侧，调整并选择多个参数，例如 检测器 (FSC, SSC，以及10个荧光范围）的 电压（V） 以及 获得 光电倍增管的 信号的面积-高度-宽度（AHW）.
      注意：以下检测器设置是根据所用实验和仪器选定的： FSC-AHW：AHW，V：270，G：5 SSC-AHW：A，V：350，G：10； FL1 (CD8/FITC 葡聚糖)-AHW：A，V：400，G：1 FL2 (CD25/PE)-AHW：A，V：500，G：1； FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW：A，V：700，G：1； FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW：A，V：625，G：1； FL9 (L/D)-AHW：A，V：425，G：1
   6. 从 仪器-采集控制面板 位于标题栏下方，调整选项以 流速（培养基）, 时间（5 分钟），以及 事件 （参见步骤 5.2.8）需要被检测的目标。点击该选项 获取单细胞 以使仪器能够吸取/运行样本，并实时显示所检测到的事件预览。
   7. 从实时预览中进行调整 荧光阈值 (电压 以及 获得）和 细胞大小 最终对目标细胞群绘制门控，同时排除任何细胞碎片。
      注意：FSC 可基于细胞大小对其进行区分，从而帮助用户区分免疫系统中的不同细胞，例如单核细胞和淋巴细胞；单核细胞体积较大，其 FSC 信号强度高于淋巴细胞。
   8. 获取约总计 5,000 个活 MoDC，50,000 个活淋巴细胞，以及 50,000 个活单核细胞事件.
   9. 在根据阴性对照样本调整完所有参数后，点击 停止，并保存该实验方案。
   10. 现在将所有样品加载到多管加载器上。在工作列表中定义每个样品，并将参照阴性对照调整好的参数应用到实验中的所有样品。点击选项 获取 以便实验中的所有样本能够连续运行。
   11. 所有样本数据采集完成后，使用合适的数据分析软件将数据保存并转换为可读格式，该软件应能够生成连续的双参数和单参数直方图。

6. 信使RNA（mRNA）表达分析

1. RNA提取
   注意：从抗原刺激的 MoDC-淋巴细胞共培养物（特异性）、非抗原刺激的 MoDC-淋巴细胞共培养物（非特异性）、不含 MoDC 的淋巴细胞培养物（对照）以及初始淋巴细胞（CD14⁻ 细胞在共培养前分离）。进行RNA提取时，使用无RNase的水配制乙醇。参见 材料表 有关提取试剂盒和试剂的详细信息。
   1. 从 MoDC-淋巴细胞共培养板中转移 1 mL 细胞悬液（约 1 × 10⁶ 细胞/mL）转移至无菌的1.5 mL离心管中，于500 × g离心10分钟 × g.
   2. 将上清液保留用于ELISA。用1 mL PBS重悬细胞沉淀，并转移至15 mL离心管中。再用1 mL PBS收集残留细胞。
   3. 离心10分钟，500 × g × g.
      注意：在使用试剂盒中提供的裂解缓冲液进行细胞裂解之前，所有样品均应作为活细胞小心处理。细胞死亡会释放RNase，从而迅速水解后续定量所需的RNA模板。RLT缓冲液可在抑制RNase的溶液中裂解细胞。
   4. 加入350 µ每孔加入裂解缓冲液 L，孵育 2–3 分钟，以裂解前步未收获的贴壁细胞。
   5. 在完成步骤6.1.3的离心后，弃去上清液，并将细胞沉淀与350 µ步骤 6.1.4 中加入的裂解缓冲液的体积（L）
      注意：此时可将试管置于 −80 ℃ 保存 ˚C 或继续进行 RNA 提取（后续步骤）。
   6. 移液350 µ在步骤 6.1.5 中，向裂解液加入 L 的 70% 乙醇。每份样品的最终体积为 700 µL.
   7. 将提取柱插入2 mL收集管中（随试剂盒提供）。
   8. 转移700 µ每提取柱加入1 L样品，于10,000 ×g离心 × g 15秒后，弃去收集管中的流穿液，并将收集管重新放回离心柱中。
   9. 在提取柱中加入 350 µL 严格洗涤缓冲液（试剂盒提供），并在超过 10,000 × g 15秒。弃去流穿液。
   10. 加入80 µ每份样品加入1 L DNase I孵育混合液至提取柱膜上，20–30℃静置15分钟 ˚C.
       注意：每份样品的DNase I孵育混合液制备方法为加入10 µL 的 DNase I 储存液加入 70 µL DNase 缓冲液，终体积为 80 µL. 通过反复倒置试管充分混匀，随后在离心机中短暂离心。
   11. 用 350 洗涤提取柱 µL 严格洗涤缓冲液，随后在 10,000 × g 离心15分钟。离心后弃去收集管中的流穿液。
   12. 用500 μL洗涤液洗涤提取柱2次 µ每次使用 L 温和洗涤缓冲液，并在 10,000 × g 条件下离心 × g 15秒和2分钟各离心一次。每次离心后弃去穿流液。
   13. 以最大速度离心柱子1分钟以干燥膜，然后弃去收集管。
   14. 将提取柱放入新的1.5 mL收集管中。
   15. 移液50 µ将1 L无RN酶的水加入到柱膜上，在室温下孵育3-5分钟。
       注意：对于浓度低于 100 ng 的 RNA，将洗脱体积减少至 30 μL µL，并使用第一次洗脱所得产物重新洗脱提取柱膜，以浓缩最终产物。
   16. 以 10,000 离心 × g 孵育1分钟以洗脱RNA。
   17. 使用0.5–2在260 nm处检测吸光度，测定RNA浓度 µL 样品。将最终 RNA 浓度调整至 0.1–1 µ克/µ使用无RN酶的水。
   18. 将 RNA 等分试样于 −80 ℃ 保存 ˚C，以备后续使用。
2. 互补DNA的合成
   1. 根据试剂盒附带的制造商说明书，从提取的模板RNA合成互补DNA（cDNA）（参见 材料表 详情请参见）。
      注意：所用试剂及其体积的汇总见下表 表1 以及 表 2完整的实验方案详见于 补充文件 1.
3. 实时定量聚合酶链式反应
   1. 对于qPCR，将cDNA样本进行三复孔检测。定量分析牛Ki-67和IFN-γ的mRNA转录水平。γ 使用特异性引物组相对于 GAPDH 基因，如图所示 表3.
      ​注意：完整方案详见 补充文件 1.

7. 酶联免疫吸附测定

1. 通过ELISA对富含分泌蛋白的收集培养上清液进行处理，以定量检测干扰素-γ（IFN-γ）。
   注：试剂盒使用详情请参见材料表。完整实验方案详见补充文件1。

8. 统计学分析

1. 使用商业软件分析数据，并绘制实验设计的图示。采用非配对的非参数检验进行比较分析。当 P 值 < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。

结果

该方法描述了 体外 用于在开展后续实验前评估候选疫苗抗原的牛单核细胞来源树突状细胞的制备 体内 研究。 图1 展示了牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）的实验制备方案及其在MoDCs应用中的流程 体外 检测。利用基于磁珠的细胞分选技术，可收集约2600万个CD14⁺ 从50 mL牛血中分离并收获的PBMCs中提取的心肌细胞，其洗脱的细胞组分不含CD14⁺ 单核细胞富含淋巴细胞，被用作初始CD4⁺ 和 CD8⁺ T细胞（CD14⁻ 淋巴细胞组分

初始单核细胞组分中，98%为CD14⁺单核细胞，该结果基于CD14细胞染色及流式细胞术分析（图2A、B）。将纯化的初始单核细胞在含3%细胞因子混合物（GM-CSF和IL-4）的条件下培养，并继续孵育5天后，...

讨论

本研究展示了一种标准化的 体外 生成和表型分析牛单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）及其在评估商用疫苗（如RV疫苗）免疫原性中的后续应用方法。牛MoDCs可作为筛选针对牛病的潜在疫苗抗原的工具，并基于免疫应答在进入临床试验前预测其潜在的临床影响 在体 动物实验。所生成的MoDCs根据其形态学、表型和功能特征进行鉴定。我们证明了来源于牛CD14的MoDCs⁺ 单核细胞表现出树突状细胞的特征，例如伸出的树突样突起、表达MHC II等参与抗原呈递的细胞表面标志物、表达MoDCs上的共刺激分子（如CD40和CD86）、内吞活性，以及激活初始淋巴细胞的能力。

本实验所用的细胞培养基（DMEM 和 RPMI）广泛用于细胞分化与培养，其中 RPMI 更常用于单核细胞的分化³⁶。在 RPMI 中添加胎牛血清（FBS）或马血清（HS）均不影响单核细胞的分化过程³⁷。添加重组 GM-CSF 和 IL-4 可创造一种促炎环境，从而启动单核细胞分化，该...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ACK裂解缓冲液	Gibco, Thermo Fisher	A1049201	用于裂解收获的PBMC组分中残留红细胞的氯化铵-氯化钾缓冲液
BD Vacutainer肝素管	Becton, Dickinson (BD) and Company	366480	10 mL，添加钠肝素158 USP单位，玻璃管，尺寸16 x 100 mm
牛树突状细胞生长试剂盒	Bio-Rad, UK	PBP015KZZ	由重组牛IL-4和GM-CSF组成的细胞因子混合物
牛IFN-γ ELISA试剂盒	Bio-Rad	MCA5638KZZ	用于检测培养上清液中IFN-γ表达的试剂盒
CD14抗体	Bio-Rad	MCA2678F	小鼠抗牛CD14单克隆抗体，克隆号CC-G33，同型IgG1
CD25抗体	Bio-Rad	MCA2430PE	小鼠抗牛CD25单克隆抗体，克隆号IL-A11，同型IgG1
CD4抗体	Bio-Rad	MCA1653A647	小鼠抗牛CD4单克隆抗体，克隆号CC8，同型IgG2a
CD40抗体	Bio-Rad	MCA2431F	小鼠抗牛CD40单克隆抗体，克隆号IL-A156，同型IgG1
CD8抗体	Bio-Rad	MCA837F	小鼠抗牛CD8单克隆抗体，克隆号CC63，同型IgG2a
CD86抗体	Bio-Rad	MCA2437PE	小鼠抗牛CD86单克隆抗体，克隆号IL-A190，同型IgG1
CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统	Bio-Rad	-	热循环PCR仪
Corning离心管	Falcon Corning	352096 & 352070	15 mL和50 mL，高透明度聚丙烯锥底，带刻度，无菌，带密封螺帽，Falcon管
Cytofix/Cytoperm Plus	BD Bio Sciences	555028	固定/透化试剂盒，含BD GolgiPlug，用于流式细胞术细胞染色
乙醇	Sigma Aldrich	1009832500	分析纯绝对乙醇，符合EMSURE ACS、ISO、Reag. Ph Eur标准
胎牛血清（FBS）	Gibco, Thermo Fisher	10500064	经鉴定合格，热灭活
Ficoll Plaque PLUS	GE Health care Life Sciences, USA	341691	淋巴细胞分离介质
FlowClean清洗剂	Beckman Coulter, Life Sciences	A64669	500 mL
FlowJo	FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA	-	流式细胞仪直方图分析软件
FlowTubes / FACS （荧光激活单细胞分选）管	Falcon Corning	352235	5 mL，无菌，圆底聚苯乙烯试管，带滤网 snap cap，用于流式细胞术分析
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	Sigma Aldrich, Germany	60842-46-8	FITC-葡聚糖分子量
Gallios流式细胞仪	Beckman Coulter	-	流式细胞仪设备
硬壳96孔PCR板	Bio-Rad	HSP9601	96孔，低轮廓，薄壁，带裙边，白色/透明
人CD14 MicroBeads	Miltenyi Bioteck, Germany	130-050-201	2 mL微珠，偶联至抗人CD14单克隆抗体（IgG2a同型），用于从PBMC中筛选牛单核细胞
Kaluza	Beckman Coulter, Germany	-	流式细胞术多色数据分析软件
MACS柱	Miltenyi Bioteck, Germany	130-042-401	磁性激活细胞分选或免疫磁性细胞分离柱，基于细胞表面抗原分离不同CD14细胞群体
MHC II类DQ DR多态性抗体	Bio-Rad	MCA2228F	小鼠抗羊MHC II类DQ DR多态性抗体：FITC标记，克隆号49.1，同型IgG2a，与牛交叉反应
微量离心管	Sigma Aldrich	HS4325	1.5 mL，锥底，带刻度，无菌管
Microsoft PowerPoint	Microsoft	-	实验设计的图形化展示工具
小鼠IgG1阴性对照：CD14、CD40抗体用FITC标记	Bio-Rad	MCA928F	CD14和CD40单克隆抗体的同型对照
小鼠IgG1阴性对照：CD86抗体用PE标记	Bio-Rad	MCA928PE	CD86单克隆抗体的同型对照
小鼠IgG1阴性对照：CD25抗体用RPE标记	Bio-Rad	MCA928PE	CD25单克隆抗体的同型对照
小鼠IgG2a阴性对照：MHC II类抗体用FITC标记	Bio-Rad	MCA929F	MHC II类单克隆抗体的同型对照
Nobivac狂犬病疫苗	MSD Animal Health, UK	-	每毫升细胞培养物中含1 µL灭活疫苗，狂犬病毒株含量> 2 I.U./mL
光学封膜	Bi0-Rad	TCS0803	0.2 mL平头PCR管8联管盖，光学透明，超清晰，适用于qPCR仪
青霉素-链霉素	Gibco, Thermo Fisher	15140122	100 mL
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco, Thermo Fisher	10010023	pH 7.4，1x浓度
Prism - GraphPad 5软件	Dotmatics	-	统计分析软件
纯化抗人Ki-67抗体	Biolegend, USA	350501	单克隆抗体，与牛交叉反应，克隆号ki-67
纯化小鼠IgG1 k同型对照抗体	Biolegend	400101	Ki-67单克隆抗体的同型对照
READIDROP碘化丙啶	BD Bio Sciences	1351101	用于流式细胞术的活/死细胞标记物，胺反应性染料
重组人IL-2蛋白	R&D System, USA	202-IL-010/CF	白细胞介素-2，20 ng/mL
RNeasy Mini试剂盒	Qiagen	74106	用于总RNA提取的试剂盒；RLT缓冲液 = 裂解缓冲液；RW1缓冲液 = 含强胍盐的洗涤缓冲液；RDD缓冲液 = DNase缓冲液；RPE缓冲液 = 温和洗涤缓冲液；RNaseOUT = RNase抑制剂
RPMI 1640培养基	Sigma Aldrich	R8758	含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的细胞培养基
SMART-servier医学插图	Les Laboratories Servier	-	根据知识共享署名3.0未本地化许可协议授权使用
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5270	2x qPCR预混液，含dNTPs、Sso7d融合聚合酶、MgCl2、SYBR Green I supermix（预混液）、ROX归一化染料
SuperScript III第一链合成系统	Invitrogen, Thermo Fisher	18080051	cDNA合成试剂盒
组织培养测试板24孔	TPP, 瑞士	92024	24孔板，辐射灭菌，表面促生长处理，容积3.18 mL
台盼蓝溶液	Gibco, Thermo Fisher	15250061	0.4%，100 mL，用于评估细胞活力的染料
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水	Invitrogen, Thermo Fisher	10977023	经0.1 µm膜过滤的蒸馏水
VACUETTE肝素采血管	Thermo Fisher Scientific	15206067	VACUETTE肝素采血管顶部为绿色，内壁喷涂干燥的锂、钠或铵肝素，用于临床化学、免疫学和血清学检测。抗凝剂肝素可激活抗凝血酶，阻断凝血级联反应，从而获得全血或血浆样本。
水	Sigma Aldrich	W3500-1L	经无菌过滤，适用于细胞培养的生物试剂级水