需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种用于血管与肿瘤成像的高亮度近红外二区荧光探针

2.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64875

⸱

2023年3月17日

 ,  , 
1College of Science, Research Center for Ecology, Laboratory of Extreme Environmental Biological Resources and Adaptive Evolution, Tibet University, 2State Key Laboratory of Virology, Key Laboratory of Combinatorial Biosynthesis and Drug Discovery (MOE) and Hubei Province Engineering and Technology Research Center for Fluorinated Pharmaceuticals, Wuhan University School of Pharmaceutical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了使用近红外二区光学成像设备对小鼠进行实时近红外二区荧光成像的操作过程。

摘要

作为一种新兴的成像技术，近红外二区（NIR-II，1000–1700 nm）荧光成像因其高灵敏度、深组织穿透能力以及优异的空间和时间分辨率，在生物医学领域展现出巨大潜力。然而，如何推动NIR-II荧光成像在医学和药学等亟需领域的实际应用，一直是相关研究人员面临的难题。本实验方案详细描述了一种具有D-A-D（给体-受体-给体）骨架结构的NIR-II荧光分子探针HLY1的构建及其生物成像应用。HLY1表现出良好的光学性能和生物相容性。此外，利用NIR-II光学成像设备在小鼠体内开展了NIR-II血管与肿瘤成像研究，获得了实时、高分辨率的荧光图像，用于指导肿瘤及血管疾病的检测。从探针制备到数据采集，成像质量显著提升，确保了NIR-II分子探针在活体成像中数据记录的真实性。

引言

荧光成像是一种在基础研究中常用的分子成像工具，也常用于临床手术中肿瘤切除的引导1。荧光成像的基本原理是利用相机接收激光照射样品（组织、器官等）后所发出的荧光信号2。该过程在数毫秒内即可完成3。荧光成像的波长范围可分为紫外区（200–400 nm）、可见光区（400–700 nm）、近红外一区（NIR-I，700–900 nm）和近红外二区（NIR-II，1000–1700 nm）4,5,6。由于生物组织中的内源性分子（如血红蛋白、黑色素、脱氧血红蛋白和胆红素）在可见光区域具有强烈的吸收和散射效应，导致光的穿透深度和灵敏度显著降低，从而对可见光波长范围内的荧光成像产生不利影响7,8,9。

NIR-II 荧光成像具有光子吸收和散射低、成像速度快以及图像对比度（或灵敏度）高的优点10,11。随着荧光波长的增加，荧光在生物组织中的吸收和散射逐渐减少，且 NIR-II 区域的自发荧光极低12。因此，NIR-II 窗口显著提高了组织穿透深度，并获得更高的分辨率和信噪比13,14,15。NIR-II 窗口可进一步细分为 NIR-IIa（1300–1400 nm）和 NIR-IIb（1500–1700 nm）窗口16。迄今为止，已有多种具有里程碑意义的 NIR-II 材料被报道，包括无机材料单壁碳纳米管、稀土纳米颗粒、量子点，以及有机材料半导体聚合物纳米颗粒、小分子染料、聚集诱导发光材料等1,17,18,19,20,21,22。无机纳米材料容易在肝脏、脾脏等器官中积累，可能存在长期生物毒性23。有机小分子荧光团具有代谢快、毒性低、易于修饰和结构明确等优势，是最有希望用于临床的探针24。

NIR-II 光学成像系统也是荧光生物成像的关键组成部分，因为它能够高效地收集来自 NIR-II 探针的 NIR-II 荧光信号，从而获得精确的功能、解剖和分子图像25,26。NIR-II 成像系统主要由短波红外相机、长通（LP）滤光片、激光器和计算机处理器组成。体内 NIR-II 荧光成像被认为是阐明疾病机制和生命本质最具可行性的成像方法之一27,28,29。NIR-II 成像技术已广泛应用于癌症细胞检测、动态成像、体内 靶向示踪和靶向治疗等生物医学领域，尤其是在肿瘤学研究中30,31。然而，考虑到 NIR-II 成像技术对成像探针和仪器设备较高的技术要求，其复杂性也给不同领域研究人员的实际应用带来了困惑和限制。因此，本文将详细阐述 NIR-II 成像探针的制备及其成像技术的应用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

NIR-II成像研究的动物实验在武汉大学动物实验中心进行，该中心已获得国际实验动物护理评估和认可委员会（AALAC）认证。所有动物实验均遵循中国实验动物福利委员会《实验动物护理与使用指南》，并经武汉大学动物实验中心动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

本研究采用6周龄的雌性BALB/c裸鼠（约20 g）。

1. 近红外二区成像准备

  1. 将市售黑色卡纸（参见材料表）放置于载物台中央，然后将样品置于黑色卡纸上，使样品位于载物台中心（成像设备中的成像平台位置）。
    注意：与白色卡纸相比，黑色卡纸在近红外二区（NIR-II）成像过程中产生的背景干扰更少。
  2. 根据NIR-II探针的波长选择合适的滤光片。当系统将滤光片移入光学成像光路时，在屏幕界面上长按（>2秒）以控制对应滤光片型号的区域（例如900 LP）。
  3. 在载物台控制区域的触摸屏界面上长按平台上升，使载物台上升；长按平台下降，使载物台下降。
  4. 将平台高度调节至"0 mm"（高度调节），并使用自动聚焦功能使NIR-II图像清晰。

NIR-II 染料（HLY1）的合成

  1. 称取合成实验所需的原料，确保其不发生降解。
  2. 将化合物1（200 mg，0.18 mmol）、PdCl2(dppf)2CH2Cl2 （28 mg，0.04 mmol）、N-苯基-N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)萘-2-胺 （170 mg，0.4 mmol）和K2CO3 （46 mg，0.34 mmol）加入25 mL圆底烧瓶中的四氢呋喃（THF）溶液中。在N2气氛下，75 °C搅拌反应混合物4小时（图1A）。
    注意：化合物1和N-苯基-N-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)苯基)萘-2-胺的合成步骤参见Li等21。化学结构见图1A。
  3. 冷却至室温后，用去离子水（DI水）（80 mL）淬灭反应，并用DCM（二氯甲烷）/H2O（30 mL）萃取混合物（三次）。通过柱层析16纯化粗产物（石油醚:DCM = 10:1），得到绿色固体HLY1（78 mg，产率30%）。
  4. 将染料HLY1置于氮气保护下，存于冰箱中以备后续使用。可保存长达6个月。

3. 水悬浮纳米探针的制备

  1. 称取HLY1（1 mg）和两亲性包封材料1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2k]（DSPE-PEG2k，10 mg；参见材料表）。
  2. 采用DSPE-PEG2k作为包封基质（纳米沉淀法12），制备HLY1纳米点20（图1C）。将HLY1溶于四氢呋喃（THF，1 mL）中，随后在25 °C条件下，缓慢加入含有DSPE-PEG2k水溶液（9 mL）的烧杯中，并同时进行超声处理。接着通过透析20去除混合物中的THF。
  3. 使用超滤法18对上述溶液进行离心浓缩（7100 × g，10分钟），然后置于4 °C冰箱中保存以备后续使用。该溶液可保存长达1个月。
    注意：由DSPE-PEG2k负载的纳米探针水溶液应保存在0 °C以上，并尽快使用。

4. 构建荷瘤小鼠模型

  1. 在添加了10%（v/v）胎牛血清（FBS）和1%（v/v）青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养4T1小鼠乳腺癌细胞（4T1），并在37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中维持培养（参见材料表）。
  2. 进行近红外二区（NIR-II）荧光成像实验时，将4T1细胞（5 × 107）培养24小时，用胰蛋白酶（1 mL）消化，并用无血清DMEM洗涤两次（每次4 mL）。
  3. 使用异氟烷（2%）对小鼠进行麻醉。通过刺激小鼠的脚趾或足底，观察其是否产生反应，以确认麻醉是否充分。若无反应，则表明麻醉已达到足够深度32。
  4. 随后，使用胰岛素注射针头将4T1细胞悬液通过皮下注射方式注入小鼠体内（100 µL）。
    ​注意：NIR-II成像研究在接种后约2周进行，此时肿瘤体积已生长至约100 mm3。在进行NIR-II肿瘤成像前，请确认肿瘤大小。本研究中肿瘤尺寸采用电子数显卡尺进行估算11。

5. 体内 近红外二区荧光成像

  1. 使用异氟烷（2%）麻醉小鼠，并利用近红外二区（NIR-II）光学成像系统对小鼠全身进行NIR-II成像（参见材料表）。
    注意：注意麻醉剂的剂量，避免小鼠死亡。通常麻醉持续5–10分钟。刺激小鼠的脚趾或足底，观察其是否产生反应。若无反应，则表明麻醉已充分。
  2. 取HLY1量子点溶液（0.8 mg/mL，200 µL），将HLY1量子点经尾静脉注射至麻醉后的小鼠体内。注射3分钟后，使用NIR-II成像系统对小鼠全身血管进行NIR-II荧光成像，并进一步聚焦于小鼠头部，采集脑部血管成像。
    注意：成像过程中应佩戴洁净的实验手套，有助于获得清晰的NIR-II图像。
  3. 在向小鼠注射HLY1量子点5分钟后采集图像，并使用ImageJ软件处理数据。光学NIR-II成像系统的仪器参数为90 mW/cm2（808 nm激光）。
  4. 实验结束后，按照机构批准的安乐死程序处理动物。
    注意：本研究中，动物通过暴露于过量异氟烷实施安乐死32。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过NIR-II成像仪器测定水悬浮HLY1点的荧光强度和亮度。90% HLY1的荧光强度 fwTHF/H2O混合物中的发光强度是THF溶液中的五倍，表明HLY1具有显著的聚集诱导发光（AIE）特性图1B）。此外，HLY1 纳米点在 1,500 nm 长通滤光片下发出强烈的荧光信号，表明 HLY1 纳米点可用于 NIR-IIb 成像（图1D）。HLY1 量子点的最大吸收波长和最大发射波长分别为 740 nm 和 1,040 nm（图 2A）。此外，通过动态光散射（DLS）测定HLY1点的流体动力学尺寸为145 nm图2B）。将 HLY1 点样物（0.2 mL，0.8 mg/mL）注入正常 Balb/c 小鼠体内 通过 尾静脉注射用于血管成像补充图1). 在1,500 nm长通滤光片下，后肢的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

近红外一区（NIR-I）荧光成像在一定程度上可用于肿瘤和血管成像，但由于NIR-I荧光探针的最大发射波长有限（<900 nm），导致组织穿透深度不足以及肿瘤信号与背景的比值较低33,34。成像分辨率差且偏低可能导致影像反馈治疗结果与实际治疗效果之间出现偏差。此外，大多数NIR-I荧光探针光学稳定性差且代谢极快，导致成像过程中信号不稳定。由于NIR-I荧光探针组织穿透能力弱且信号不稳定，其在肿瘤和血管成像中的应用受到极大限制35。与NIR-I光相比，近红外二区（NIR-II）荧光成像具有显著减少的光子散射和吸收、更低的组织自发荧光、更强的生物组织穿透能力以及更优的空间-时间成像分辨率等优势36。

本文介绍了一种基于D-A-D骨架的高亮度AIE染料，具有优异的稳定性。采用有效的纳米沉淀法，制备了一种可用于多种生物成像（包括血管疾病和肿瘤成像）的纳米探针。该探针在水溶液...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了国家自然科学基金（82273796，82111530209）、中央引导地方科技发展专项资金（XZ202202YD0021C，XZ202102YD0033C，XZ202001YD0028C）、湖北省科技创新重点项目（2020BAB058）、中央高校基本科研业务费专项资金以及西藏自治区科技发展新冠肺炎防控专项项目的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水吡啶Perimed 110-86-1
无水硫酸钠中国医药集团有限公司SY006376
黑色卡纸苏州盈锐光学科技有限公司AO00158
柱层析Energy ChemicalE080498
二氯二苯基膦钯Sigma-AldrichB2161-1g
DSPE-PEG2000PonsurePS-E1
杜尔贝科改良伊格尔培养基 Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
胎牛血清Gibco2166090RP
异氟烷GLPBIOGC45487-1
K2CO3MacklinP816305-5g
N,N'-二甲基甲酰胺中国医药集团有限公司02-12-1968
NIR-II 成像仪器苏州盈锐光学科技有限公司16011109
N-磺酰苯胺Enerry chemical 1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2TCI B2064-1g
青霉素-链霉素Gibco15140-122
四氢呋喃中国医药集团有限公司M005197
四(三苯基膦)钯Immochem1021232-5g
四(三苯基膦)钯Sigma-Aldrich1021232-5g
三丁基氯化锡ImmochemQH004335
三甲基氯硅烷中国医药集团有限公司40060560

参考文献

  1. Liu, Y., et al. Versatile types of inorganic/organic NIR-IIa/IIb fluorophores: from strategic design toward molecular imaging and theranostics. Chemical Reviews. 122 (1), 209-268 (2022).
  2. Zhou, H., et al. Mn-loaded apolactoferrin dots for in vivo MRI and NIR-II cancer imaging. Journal of Materials Chemistry C. 7 (31), 9448-9454 (2019).
  3. Zhang, F., Tang, B. Z. Near-infrared luminescent probes for bioimaging and biosensing. Chemical Science. 12 (10), 3377-3378 (2021).
  4. Yao, C., et al. A bright, renal-clearable NIR-II brush macromolecular probe with long blood circulation time for kidney disease bioimaging. Angewandte Chemie International Edition. 61 (5), 202114273(2022).
  5. Gao, S., et al. Molecular engineering of near-infrared-II photosensitizers with steric-hindrance effect for image-guided cancer photodynamic therapy. Advanced Functional Materials. 31 (14), 2008356(2021).
  6. Ding, F., Fan, Y., Sun, Y., Zhang, F. Beyond 1000 nm emission wavelength: recent advances in organic and inorganic emitters for deep-tissue molecular imaging. Advanced Healthcare Materials. 8 (14), 1900260(2019).
  7. Yang, Y., Zhang, F. Molecular fluorophores for in vivo bioimaging in the second near-infrared window. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (9), 3226-3246 (2022).
  8. Ding, B., et al. Polymethine thiopyrylium fluorophores with absorption beyond 1000 nm for biological imaging in the second near-infrared subwindow. Journal of Medicinal Chemistry. 62 (4), 2049-2059 (2019).
  9. Cheng, X., et al. Novel diketopyrrolopyrrole Nir-Ii fluorophores and Ddr inhibitors for in vivo chemo-photodynamic therapy of osteosarcoma. Chemical Engineering Journal. , 136929(2022).
  10. Yang, Y., et al. Nir-Ii chemiluminescence molecular sensor for in vivo high-contrast inflammation imaging. Angewandte Chemie International Edition. 59 (42), 18380-18385 (2020).
  11. Liu, Y., et al. A second near-infrared Ru(Ii) polypyridyl complex for synergistic chemo-photothermal therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2225-2237 (2022).
  12. Xu, Y., et al. Long wavelength-emissive Ru(Ii) metallacycle-based photosensitizer assisting in vivo bacterial diagnosis and antibacterial treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (32), 2209904119(2022).
  13. Xu, Y., et al. Construction of emissive Ruthenium(II) metallacycle over 1000 nm wavelength for in vivo biomedical applications. Nature Communications. 13 (1), 2009(2022).
  14. Wang, S., Li, B., Zhang, F. Molecular fluorophores for deep-tissue bioimaging. ACS Central Science. 6 (8), 1302-1316 (2020).
  15. Sun, Y., Sun, P., Li, Z., Qu, L., Guo, W. Natural flavylium-inspired far-red to NIR-II dyes and their applications as fluorescent probes for biomedical sensing. Chemical Society Reviews. 51 (16), 7170-7205 (2022).
  16. Shen, H., et al. Rational design of NIR-II AIEgens with ultrahigh quantum yields for photo- and chemiluminescence imaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (33), 15391-15402 (2022).
  17. Mu, J., et al. The chemistry of organic contrast agents in the NIR-II window. Angewandte Chemie International Edition. 61 (14), 202114722(2022).
  18. Lu, S., et al. NIR-II fluorescence/photoacoustic imaging of ovarian cancer and peritoneal metastasis. Nano Research. 15 (10), 9183-9191 (2022).
  19. Liu, Y., et al. Novel Cd-Mof NIR-II fluorophores for gastric ulcer imaging. Chinese Chemical Letters. 32 (10), 3061-3065 (2021).
  20. Lin, J., et al. Novel near-infrared II aggregation-induced emission dots for in vivo bioimaging. Chemical Science. 10 (4), 1219-1226 (2018).
  21. Li, Y., et al. Small-molecule fluorophores for near-infrared IIb imaging and image-guided therapy of vascular diseases. CCS Chemistry. 4 (12), 3735-3750 (2022).
  22. Li, Y., et al. Novel NIR-II organic fluorophores for bioimaging beyond 1550 nm. Chemical Science. 11 (10), 2621-2626 (2020).
  23. Li, Y., et al. Organic NIR-II dyes with ultralong circulation persistence for image-guided delivery and therapy. Journal of Controlled Release. 342, 157-169 (2022).
  24. Li, Y., et al. Self-assembled NIR-II fluorophores with ultralong blood circulation for cancer imaging and image-guided surgery. Journal of Medicinal Chemistry. 65 (3), 2078-2090 (2022).
  25. Li, Q., et al. Novel small-molecule fluorophores for in vivo NIR-IIa and NIR-IIb imaging. Chemical Communications. 56 (22), 3289-3292 (2020).
  26. Li, J., et al. Recent advances in the development of NIR-II organic emitters for biomedicine. Coordination Chemistry Reviews. 415, 213318(2020).
  27. Li, J., et al. long-fluorescence-lifetime dyes for deep-near-infrared bioimaging. Journal of the American Chemical Society. 144 (31), 14351-14362 (2022).
  28. Li, C., Chen, G., Zhang, Y., Wu, F., Wang, Q. Advanced fluorescence imaging technology in the near-infrared-II window for biomedical applications. Journal of the American Chemical Society. 142 (35), 14789-14804 (2020).
  29. Li, B., Lin, J., Huang, P., Chen, X. Near-infrared probes for luminescence lifetime imaging. Nanotheranostics. 6 (1), 91-102 (2022).
  30. Lei, Z., Zhang, F. Molecular engineering of NIR-II fluorophores for improved biomedical detection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (30), 16294-16308 (2021).
  31. He, S., Song, J., Qu, J., Cheng, Z. Crucial breakthrough of second near-infrared biological window fluorophores: design and synthesis toward multimodal imaging and theranostics. Chemical Society Reviews. 47 (12), 4258-4278 (2018).
  32. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and real-time recording of dynamic tension changes along vessel diameter. Journal of Visualized Experiments. (184), e64121(2022).
  33. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/P53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278(2022).
  34. Ji, A., et al. Acceptor engineering for NIR-II dyes with high photochemical and biomedical performance. Nature Communications. 13 (1), 3815(2022).
  35. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged Ht22 cells by stimulating Pi3k-Akt-Mapk signaling pathway. Phytomedicine. , (2022).
  36. Jiang, Y., Pu, K. Molecular probes for autofluorescence-free optical imaging. Chemical Reviews. 121 (21), 13086-13131 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

HLY1
一种用于血管与肿瘤成像的高亮度近红外二区荧光探针
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。