一种用于血管与肿瘤成像的高亮度近红外二区荧光探针

摘要

本方案详细描述了使用近红外二区光学成像设备对小鼠进行实时近红外二区荧光成像的操作过程。

摘要

作为一种新兴的成像技术，近红外二区（NIR-II，1000–1700 nm）荧光成像因其高灵敏度、深组织穿透能力以及优异的空间和时间分辨率，在生物医学领域展现出巨大潜力。然而，如何推动NIR-II荧光成像在医学和药学等亟需领域的实际应用，一直是相关研究人员面临的难题。本实验方案详细描述了一种具有D-A-D（给体-受体-给体）骨架结构的NIR-II荧光分子探针HLY1的构建及其生物成像应用。HLY1表现出良好的光学性能和生物相容性。此外，利用NIR-II光学成像设备在小鼠体内开展了NIR-II血管与肿瘤成像研究，获得了实时、高分辨率的荧光图像，用于指导肿瘤及血管疾病的检测。从探针制备到数据采集，成像质量显著提升，确保了NIR-II分子探针在活体成像中数据记录的真实性。

引言

荧光成像是一种在基础研究中常用的分子成像工具，也常用于临床手术中肿瘤切除的引导¹。荧光成像的基本原理是利用相机接收激光照射样品（组织、器官等）后所发出的荧光信号²。该过程在数毫秒内即可完成³。荧光成像的波长范围可分为紫外区（200–400 nm）、可见光区（400–700 nm）、近红外一区（NIR-I，700–900 nm）和近红外二区（NIR-II，1000–1700 nm）^4,5,6。由于生物组织中的内源性分子（如血红蛋白、黑色素、脱氧血红蛋白和胆红素）在可见光区域具有强烈的吸收和散射效应，导致光的穿透深度和灵敏度显著降低，从而对可见光波长范围内的荧光成像产生不利影响^7,8,9。

NIR-II 荧光成像具有光子吸收和散射低、成像速度快以及图像对比度（或灵敏度）高的优点^10,

方案

NIR-II成像研究的动物实验在武汉大学动物实验中心进行，该中心已获得国际实验动物护理评估和认可委员会（AALAC）认证。所有动物实验均遵循中国实验动物福利委员会《实验动物护理与使用指南》，并经武汉大学动物实验中心动物护理与使用委员会（IACUC）批准。

本研究采用6周龄的雌性BALB/c裸鼠（约20 g）。

1. 近红外二区成像准备

1. 将市售黑色卡纸（参见材料表）放置于载物台中央，然后将样品置于黑色卡纸上，使样品位于载物台中心（成像设备中的成像平台位置）。
   注意：与白色卡纸相比，黑色卡纸在近红外二区（NIR-II）成像过程中产生的背景干扰更少。
2. 根据NIR-II探针的波长选择合适的滤光片。当系统将滤光片移入光学成像光路时，在屏幕界面上长按（>2秒）以控制对应滤光片型号的区域（例如900 LP）。
3. 在载物台控制区域的触摸屏界面上长按平台上升，使载物台上升；长按平台下降，使载物台下降。
4. 将平台高度调节至"0 mm"（高度调节），并使用自动聚焦功能使NIR-II图像清晰。

NIR-II 染料（....

结果

通过NIR-II成像仪器测定水悬浮HLY1点的荧光强度和亮度。90% HLY1的荧光强度 f_wTHF/H₂O混合物中的发光强度是THF溶液中的五倍，表明HLY1具有显著的聚集诱导发光（AIE）特性图1B）。此外，HLY1 纳米点在 1,500 nm 长通滤光片下发出强烈的荧光信号，表明 HLY1 纳米点可用于 NIR-IIb 成像（图1D）。HLY1 量子点的最大吸收波长和最大发射波长分别为 740 nm 和 1,040 nm（图 2A）。此外，通过动态光散射（DLS）测定HLY1点的流体动力学尺寸为145 nm图2B）。将 HLY1 点样物（0.2 mL，0.8 mg/mL）注入正常 Balb/c 小鼠体内 通过 尾静脉注射用于血管成像补充图1). 在1,500 nm长通滤光片下，后肢的.......

讨论

近红外一区（NIR-I）荧光成像在一定程度上可用于肿瘤和血管成像，但由于NIR-I荧光探针的最大发射波长有限（<900 nm），导致组织穿透深度不足以及肿瘤信号与背景的比值较低^33,34。成像分辨率差且偏低可能导致影像反馈治疗结果与实际治疗效果之间出现偏差。此外，大多数NIR-I荧光探针光学稳定性差且代谢极快，导致成像过程中信号不稳定。由于NIR-I荧光探针组织穿透能力弱且信号不稳定，其在肿瘤和血管成像中的应用受到极大限制³⁵。与NIR-I光相比，近红外二区（NIR-II）荧光成像具有显著减少的光子散射和吸收、更低的组织自发荧光、更强的生物组织穿透能力以及更优的空间-时间成像分辨率等优势³⁶。

本文介绍了一种基于D-A-D骨架的高亮度AIE染料，具有优异的稳定性。采用有效的纳米沉淀法，制备了一种可用于多种生物成像（包括血管疾病和肿瘤成像）的纳米探针。该探针在水溶液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水吡啶	Perimed	110-86-1
无水硫酸钠	中国医药集团有限公司	SY006376
黑色卡纸	苏州盈锐光学科技有限公司	AO00158
柱层析	Energy Chemical	E080498
二氯二苯基膦钯	Sigma-Aldrich	B2161-1g
DSPE-PEG2000	Ponsure	PS-E1
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Gibco	8121587
EGTA	Biofroxx	EZ6789D115
胎牛血清	Gibco	2166090RP
异氟烷	GLPBIO	GC45487-1
K2CO3	Macklin	P816305-5g
N,N'-二甲基甲酰胺	中国医药集团有限公司	02-12-1968
NIR-II 成像仪器	苏州盈锐光学科技有限公司	16011109
N-磺酰苯胺	Enerry chemical	1250030-5g
PdCl2(dppf)2CH2Cl2	TCI	B2064-1g
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
四氢呋喃	中国医药集团有限公司	M005197
四(三苯基膦)钯	Immochem	1021232-5g
四(三苯基膦)钯	Sigma-Aldrich	1021232-5g
三丁基氯化锡	Immochem	QH004335
三甲基氯硅烷	中国医药集团有限公司	40060560