用于映射植物根系架构特征的简单协议

Summary

我们使用简单的实验室工具来检查拟南芥和Medicago的根系结构（RSA）。将小苗水培生长在网眼上，并使用艺术刷展开以露出RSA。使用扫描或高分辨率相机拍摄图像，然后使用ImageJ进行分析以映射特征。

Abstract

全面了解植物根系结构（RSA）的发展对于提高养分利用效率和提高作物品种对环境挑战的耐受性至关重要。提出了用于建立水培系统，幼苗生长，RSA传播和成像的实验方案。该方法使用基于洋红色箱的水培系统，其中包含由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网。实验设置通过评估不同营养（磷酸盐[Pi]）供应下幼苗的RSA来举例说明。该系统的建立是为了检查拟南芥的RSA，但它很容易适应研究其他植物，如 Medicago sativa （苜蓿）。拟 南芥 （Col-0）幼苗在本次调查中用作了解植物RSA的示例。通过处理乙醇和稀释的商业漂白剂对种子进行表面灭菌，并保持在4°C进行分层。种子在由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网上的液体半MS培养基上发芽并生长。将幼苗在标准生长条件下生长所需的天数，从网中轻轻挑出，并浸没在含水的琼脂平板中。在圆形艺术刷的帮助下，将小苗的每个根系轻轻地铺在充满水的盘子上。这些培养皿以高分辨率拍照或扫描以记录RSA性状。根性状，如主根、侧根和分支区，使用免费提供的 ImageJ 软件进行测量。本研究提供了在受控环境环境中测量植物根系特征的技术。我们讨论了如何（1）种植幼苗，收集和传播根样本，（2）获得传播RSA样本的图片，（3）捕获图像，以及（4）使用图像分析软件量化根属性。该方法的优点是可以通用、简单、有效地测量RSA性状。

Introduction

地下的根系结构（RSA）是植物生长和生产力的重要器官¹，^2，3。在胚胎阶段之后，植物经历了最显着的形态变化。根在土壤中的生长方式极大地影响了地面上植物部分的生长。根系生长是发芽的第一步。这是一个信息性状，因为它对^{不同的可用营养素}做出独特的反应1，²，^3，4。RSA表现出高度的发展可塑性，这意味着环境总是被用来做出有关发展的决策^2，5。在目前的情况下，环境的变化使作物生产更加困难。RSA持续地将环境信号纳入发展选择⁵。因此，彻底了解根系发育背后的原理对于了解植物如何应对不断变化的环境至关重要^2，5。

RSA感知不同的营养浓度，并呈现表型改变

Protocol

图1示意性地总结了整个协议，显示了揭示小苗根系结构（RSA）所涉及的所有基本步骤。协议步骤详见下文:

1.拟南芥种子表面杀菌

1. 将一小勺（约100粒种子=约2.5毫克）种子转移到微量离心管中，并在室温（RT）下在蒸馏水中浸泡30分钟。整个过程在无菌条件下进行。
2. 将含有种子的微量离心管以500 x g 短暂离心5秒，在室温下使用任何台式离心机让种子沉淀下来。
3. 倒出水，加入 700 μL 70% （v/v） 乙醇，涡旋几秒钟，然后旋转。如果需要，重复涡旋和旋转，但确保70%乙醇的处理时间保持在3分钟。
4. 3分钟后，立即用无菌水冲洗一次。保持乙醇洗涤步骤尽可能及时，因为长时间接触乙醇会减少发芽。
5. 用稀释的商业漂白剂（4% v / v）处理种子，滴入吐温-207分钟。通过将试管快速倒置 8-12 次，将种子与漂白剂溶液混合，然后进行短暂的离心机（室温下 500 x g 5 秒）。可以看到泡沫出现在管中。
6. 使用 1 mL 移液管倒出上清液，并按照相同的涡旋程序用无菌水冲洗种子至少五次。
7. 将表面灭菌的种子留在水中，并在4°C下孵育2-3天以进行分层¹⁰。

Results

使用简单的实验室工具测量根系结构（RSA）的不同形态特征，步骤示意性地描述在 图1中。水培设置的细节证明了该方案在测量RSA方面的潜力（图1 和 图2）。

鉴于观察到的胶凝剂差异，我们使用水培生长系统进行所有研究^3，10。作为概念证明，这种水培系统运行良好，反映了Pi缺陷和充分条件下的明显对比表型（图3）。拟南芥种子在聚丙烯网的半MS培养基中水培5天，如图 2所示。将幼苗在5天后移植到Pi缺陷和足够的条件下，并使其生长7天（图3）。

不同养分.......

Discussion

这项工作演示了使用简单的实验室设备绘制RSA的地图。使用这种方法，在精细水平上记录表型改变。这种策略的好处是芽部永远不会与培养基接触，因此小苗的表型是原始的。该方法涉及建立水培系统以按照协议中所述种植幼苗。然后，将每个幼苗完整取出并放置在充满琼脂的培养皿上。然后允许使用艺术刷手动涂抹根系，并拍摄照片以使用ImageJ软件¹，¹⁰，^11，12进行分析。

种子发芽需要种子表面灭菌以去除细菌、真菌和病毒。酒精 - 70%乙醇 - 用于对种子表面进行消毒。为了在不破坏种子的情况下对其进行消毒，需要仔细遵循酒精灭菌的处理时间。当酒精灭菌过度时，种子发芽减少。治疗时间因植物物种而异（例如，对于拟南芥，时间限制仅为3分钟¹，10，¹¹，12，

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
拟南芥 （Col 0）	Lehle 种子	WT-02	哥伦比亚 （Col-0**，无标记）*
艺术画笔	亚马逊或任何其他供应商		水彩圆刷尺寸 14 （8 毫米）、16 （9.5 毫米）、18 （12 毫米） 和 20 （14.2 毫米）
带数码相机的自动显微镜	徕卡显微系统		LAS 版本 4.12.0，徕卡显微系统
成像软件	ImageJ		ImageJ V  1.8.0
品红色盒子 GA-7	Fisher Scientific	50-255-176
紫花苜蓿	Johnny's 种子
培养皿 （150 mm x 15 mm）	美国科学公司	8609-0215	150 mm x 15 mm PS 培养皿 （https://www.usascientific.com）
照相相机	Cannon 或 Nikon		距模式下的任何高百万像素（每英寸至少 12 百万像素）相机
植物琼脂	Sigma-Aldrich	A3301	沉香胶 适用于植物组织培养
聚碳酸酯片	Amazon		1毫米  厚
聚丙烯网	Amazon		孔径250 µm、500 和微型;m 和 1000 µm
扫描仪	Epson		Epson Perfection V700 照片 （扫描速度 600 dpi）