我们使用简单的实验工具来观察拟南芥和苜蓿的根系结构（RSA）。将幼苗在网筛上进行水培培养，并用画笔将其展开以显露根系结构。通过扫描仪或高分辨率相机拍摄图像，然后使用ImageJ软件分析并绘制性状图谱。
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摘要
摘要
全面了解植物根系构型（RSA）的发育对于提高养分利用效率以及增强作物品种对环境胁迫的耐受性至关重要。本文介绍了一种用于建立水培系统、幼苗生长、根系展开及成像的实验方案。该方法采用基于Magenta盒的水培系统，内含由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网。通过在不同养分（磷酸盐[Pi]）供应条件下评估幼苗的根系构型，展示了实验设置的具体应用。该系统最初用于研究拟南芥的根系构型，但也可轻松适用于其他植物，如Medicago sativa（苜蓿）。本研究以Arabidopsis thaliana（Col-0）幼苗为例，探讨植物根系构型。种子经乙醇和稀释的商用次氯酸钠溶液表面灭菌后，于4 °C条件下进行层积处理。种子在由聚碳酸酯楔块支撑的聚丙烯网上萌发，并在液体半量MS培养基中生长。幼苗在标准生长条件下培养所需天数后，轻柔地从网上取出，浸入含水琼脂平板中。借助圆形美术画笔，将每株幼苗的根系在充满水的平板上轻轻展开。这些培养皿通过高分辨率拍照或扫描，以记录根系构型特征。使用免费的ImageJ软件测量主根、侧根和分枝区等根系性状。本研究提供了在受控环境条件下测定植物根系特征的技术。我们详细讨论了如何（1）培养幼苗并采集与展开根系样本，（2）获取展开后的根系构型图像，（3）采集图像，以及（4）利用图像分析软件量化根系属性。本方法的优势在于能够灵活、简便且高效地测量根系构型性状。
引言
根系构型（RSA）位于地下，是植物生长和生产力的重要器官1,2,3。在胚胎发育阶段之后，植物会经历最显著的形态变化。根系在土壤中的生长方式极大地影响着地上部分的生长。根的生长是萌发的第一步，是一个具有信息指示意义的性状，因为它对不同可利用的养分具有独特的响应1,2,3,4。根系构型表现出高度的发育可塑性，这意味着植物始终利用环境信号来决定其发育路径2,5。当前环境下各种变化使得作物生产变得更加困难。根系构型持续不断地将环境信号整合到发育决策过程中5。因此，深入理解根系发育的基本原理，对于认识植物如何响应环境变化至关重要2,5。
根系构型（RSA）能够感知不同的养分浓度并产生表型变化4,6,7,8,9,10,11,12。研究表明，与地上部分形态相比，根系形态/根系构型（RSA）具有更高的可塑性1,3。根系构型（RSA）性状作图在记录周围土壤环境变化的影响方面具有很高的有效性1,11,12。
总体而言，许多早期研究已报道了不同营养缺乏对根表型影响的差异3,11,13,14,15。例如，关于磷酸盐（Pi）饥饿对侧根（LRs）数量、长度和密度所诱导变化的报道存在多种相互矛盾的结果。有研究报道在Pi缺乏条件下侧根密度增加6,8；而另一些研究者则报道在Pi缺乏条件下侧根密度减少3,13,16。造成这些不一致结果的一个主要原因是使用了易受元素污染的凝胶培养基，而琼脂通常含有此类污染物10。研究人员通常将实验植物培养在基于琼脂的平板系统中并记录根部性状，但大量根系构型（RSA）性状常被掩盖或深陷于琼脂材料内部，因而无法被准确记录。对于旨在诱导营养缺乏的实验，用户通常需要从培养基中完全去除某一组分，而此类实验无法在易受元素污染的凝胶培养基中进行11,14,15。此外，琼脂培养基中常含有大量多种营养元素，包括P、Zn、Fe等11,14,15。同时，与非琼脂液体培养基相比，基于琼脂的培养基中RSA生长较慢。因此，有必要建立一种替代性的非琼脂培养方法，以实现对RSA表型的定量和定性记录。基于此，本研究开发了一种新方法，即在聚丙烯网架上、由聚碳酸酯楔块支撑的Magenta盒水培系统中培养植株1,10,11。
本研究提出了一种对Jain等人先前方法的详细改进版本10。该策略已针对当前植物根系生物学的研究需求进行了优化，除模式植物外，也可用于苜蓿等其他植物。该实验方案是测量根系构型（RSA）变化的主要方法，仅需使用简单的设备。本方案详细说明了如何在正常及改良培养基（缺磷条件下）对多种根系特征进行表型分析，例如主根和侧根的观察。文中提供了基于作者经验总结的逐步操作指南及其他实用提示，以帮助研究人员顺利实施本方法中的各项技术流程。本研究旨在提供一种简便且高效的方法，用于完整展示植物根系结构，包括高阶侧根。该方法通过使用圆形水彩画笔手动铺展根系，从而实现对根系暴露程度的精确控制1,10,11,12。该方法无需昂贵仪器或复杂软件。该技术有助于提升养分吸收效率和植物生长速率，使植物能够通过根系快速吸收富含营养的溶液。本方法适用于希望详细描绘植物根系性状的研究人员，尤其适用于早期发育阶段（萌发后10–15天）的研究。该方法适用于根系较小的植物，包括拟南芥和烟草等模式植物，以及苜蓿等非传统植物，只要其根系能够容纳于Magenta盒中即可。
本实验方案概述了拟南芥根系统构型（RSA）发育表型分析的步骤，具体如下：（1）拟南芥种子的表面灭菌方法；（2）建立水培系统的操作步骤，随后将种子播种于培养基上；（3）完整幼苗的取出及在培养皿中铺展以进行RSA分析的流程；（4）RSA图像的采集记录方法；（5）利用ImageJ软件计算关键RSA参数的方法。
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方案
整个实验方案在图1中以示意图形式进行了总结，展示了揭示植物幼苗根系结构（RSA）所涉及的所有关键步骤。具体实验步骤如下：
1. 拟南芥种子表面灭菌
- 取少量种子（约100粒 = 约2.5 mg）转移至微量离心管中，加入蒸馏水在室温（RT）下浸泡30分钟。整个操作过程需在无菌条件下进行。
- 使用台式离心机在室温下以500 × g 短暂离心5秒，使种子沉降至管底。
- 弃去上清液，加入700 µL 70%（v/v）乙醇，涡旋振荡数秒后离心。如有需要可重复涡旋和离心操作，但须确保70%乙醇处理总时间保持3分钟。
- 3分钟后立即用无菌水漂洗一次。乙醇洗涤步骤应尽量及时完成，因乙醇暴露时间过长会降低种子萌发率。
- 用稀释的商用次氯酸钠溶液（4% v/v）加入一滴Tween-20处理种子7分钟。通过快速倒置试管8–12次使种子与漂白液充分混合，随后短暂离心（室温下500 × g 离心5秒）。此时可见管内产生泡沫。
- 用1 mL移液器吸弃上清液，并用无菌水至少漂洗五次，每次均按相同涡旋程序操作。
- 将表面灭菌后的种子置于水中，在4 °C下孵育2–3天以进行层积处理10。
2. 设置水培系统以进行种子萌发
- 用蒸馏水将一个标准的品红色盒子装至半满并进行高压灭菌。同时高压灭菌聚碳酸酯板（透明颜色，光滑质地），并将其切割成 4 cm × 8 cm 的矩形，矩形中点处切一个超过一半深度的缺口，以便两个矩形可相互插接形成 X 形10。利用此装置固定聚丙烯网（从 12×24 英寸板材上裁下的 6 cm × 6 cm 正方形，孔径为 250 µm，或根据需要而定）10。
注意：聚丙烯对酸、碱及其他化学品具有高度耐受性，因此被选用。高压灭菌可能导致聚丙烯网发生形变，故建议将其单独用铝箔包裹后进行灭菌。推荐采用典型的高压灭菌条件：16 分钟，121 °C，15 psi（或 775 mm Hg）。 - 在超净工作台中，向每个盒子中加入含维生素的无菌半量 MS 基本培养基 + 1.5%（w/v）蔗糖（按 Shukla 等人1所述方法配制），使液体刚好达到聚丙烯网的底边。所有操作均需在无菌条件下进行。
- 将表面灭菌的种子水培播种于网孔（孔径 250 µm）上，继续培养 3 天。
- 3 天后，将幼苗转移至另一网孔（孔径 500 µm）上，继续培养 2 天。
- 2 天后（共培养 5 天），将幼苗转移至对照培养基（即改良 MS 营养培养基1，含 2.0 mM NH4NO3、1.9 mM KNO3、0.15 mM MgSO4·7H2O、0.1 mM MnSO4·H2O、3.0 µM ZnSO4·7H2O、0.1 µM CuSO4·5H2O、0.3 mM CaCl2·2H2O、5.0 µM KI、0.1 µM CoCl2·6H2O、0.1 mM FeSO4·7H2O、0.1 mM Na2EDTA·2H2O、1.25 mM KH2PO4、100 µM H3BO3、1 µM Na2MoO4·2H2O、1.5% 蔗糖、1.25 mM MES，用 0.1 M MES 调节 pH 至 5.7 [pH 6.1]）以及实验培养基（例如缺磷 [0 mM] 处理：将上述对照培养基中的 KH2PO4 替换为 0.62 mM K2SO41；对于高磷处理，则在改良 MS 培养基中逐步提高 KH2PO4 浓度 [2.5、5.0、10.0、20.0 mM]1），继续培养 7 天。
注意：较大的网孔（500 µm）便于完整无损地取出整株幼苗，无需在下胚轴处剪切。植株在标准生长条件下培养（即 16 小时光照 / 8 小时黑暗光周期，光照强度 150 µmol·m-2·s-1，湿度 60%–70%），温度为 23 °C。
3. RSA 检测
- 制备用于根系伸展的琼脂（1.1%）平板（培养皿尺寸：150 mm × 15 mm）。
- 如上所述，向培养皿中加入10–20 mL经高压灭菌并过滤的自来水。轻轻将幼苗从尼龙网（500 µm）中取出，并浸入平板中的水中。
- 借助圆形水彩画笔（型号：14、16、18 和 20）在盛水的平板中轻轻展开每株幼苗的根系。
注意：在进行根系展开操作时，首先抓住主根，并将其拉直成一条直线，作为展开的轴线。然后尽可能在主根两侧对称地展开侧根（LR）。接着展开与一级侧根相连的二级侧根。该展开过程类似于艺术创作，请像艺术家描绘根系构型（RSA）图像一样，轻柔缓慢地操作。 - 轻微倾斜平板以去除多余水分。
注意：此时可将已展开根系的平板置于4 °C条件下暂停操作。后续需要进行图像采集时，取出平板并在室温下放置一段时间。擦去冷凝水后，即可方便地进行图像处理。
4. 采集 RSA 所需图像
- 适当地扫描或拍摄这些培养皿。
注意：为了获得高质量的照片，建议扫描分辨率为 600 dpi，摄影建议使用至少 1200 万像素的相机。 - 使用免费的 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/index.html）测量根系构型性状。如需快速了解使用 ImageJ 软件测量根长的步骤，请参考示例 "测量 DNA 轮廓长度"17。
注意：这些步骤用于测量使用高分辨率扫描仪或相机拍摄的图片中的根长。- 使用已知长度距离设置比例尺。图 3 中比例尺的已知距离为 2 cm。从 ImageJ 工具栏中选择 直线 工具（从左数第五个工具）。使用 直线 工具创建一条线选区，沿比例尺边缘绘制。通过右键单击、双击或点击起点处的方框完成绘制。
- 使用 分析 > 测量 工具栏测量已知比例尺在像素上的长度。记录下该像素长度。
- 点击 分析 选项卡中的 设置比例尺 标签，打开 设置比例尺 对话框。在 像素距离 字段中输入上述记录的像素长度；接着在 已知距离 字段中输入比例尺所示数值（此处为 20 mm）；将 长度单位 设为 mm；像素纵横比为 1.0。此时比例尺已定义为每毫米对应的像素数。若要为此特定图像锁定比例尺，请点击 确定。
- 使用 分段线 工具创建一条沿根长边缘的线选区。通过右键单击、双击或点击起点处的方框完成绘制。根据需要，点击并拖动沿线选区上的小黑白色"控制点"来调整线选区。
- 使用 ImageJ 中 分析 选项卡下的 测量 命令量化根长。要将测量数据导入电子表格，可在 结果 窗口中右键单击，从弹出菜单中选择 全部复制，切换至电子表格后粘贴数据。
注意：如上所述，在 ImageJ 的“设置比例尺”选项中，使用图像中比例尺的已知距离设定比例尺，以获得每单位长度对应的像素数。每次分析新图像时，都必须重新设置比例尺。
- 根系构型（RSA）性状的测量与计算
- 测量主根从子叶节到根尖末端的长度。
- 测量一级和二级侧根（LR）的长度。
- 测量主根的分枝区（BZ）。主根的分枝区（BZPR）从第一个侧根出现的位置延伸到最后一个侧根出现的位置。
- 记录侧根数量，即位于 BZPR 边界内的侧根数目。
- 测量一级及更高级别侧根的平均长度。通过将一级侧根（1° LR）的总长度除以一级侧根总数，计算出每根主根上的一级侧根平均长度（厘米/根）。
- 测量二级侧根的平均长度。通过将二级侧根（2° LR）的总长度除以二级侧根总数，计算其平均长度。
- 测量一级侧根密度。通过将一级侧根数量除以 BZPR 的长度，计算单位长度 BZPR 内的一级侧根密度（每单位长度的 1° LR 数量）。
- 测量二级侧根密度。通过将二级侧根数量除以一级侧根分枝区（BZ）的长度，计算单位长度一级侧根分枝区内二级侧根的密度（每单位长度一级侧根分枝区内的 2° LR 数量）。
- 测量总根长（TRL）。总根长为主根、一级侧根、二级侧根（如有更高级别则包括在内）长度的总和。
5. 根毛测量
注意：尽管水培系统在促进根毛生长和发育方面效果不佳，即使其生长状况与在固体培养基中一样健壮，但在当前研究背景下仍有必要对其进行研究。请按照以下步骤分析幼苗主根根尖5 mm区段内的根毛发育情况。
- 从根尖处切下一段长约 2 cm 的主根。
- 使用 10% 甘油作为封片剂，将根段置于载玻片上。
- 将载玻片置于体视显微镜下。
- 利用轴向载物台观察并采集根毛的图像。
- 采用 ImageJ 软件对图像进行分析，研究根毛的结构与特征，分析方法如前所述。
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结果
使用简单的实验工具测量根系构型（RSA）的不同形态计量特征，其步骤如图1所示。水培装置的细节展示了该方案在测量RSA方面的潜力（图1和图2）。
鉴于观察到的不同凝胶剂之间的差异，我们采用水培培养系统进行所有研究3,10。作为概念验证，该水培系统效果良好，能够反映出在磷（Pi）缺乏与充足条件下明显的表型差异（图3）。如图2所示，拟南芥种子在聚丙烯网架上的半量MS培养基中水培培养5天。5天后将幼苗转移至磷（Pi）缺乏和充足的条件下继续生长7天（图3）。
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讨论
本研究展示了利用简单的实验室设备进行根系构型（RSA）定位的方法。通过该方法，可以在精细水平上记录表型变化。该策略的优点在于，植物的地上部分始终不与培养基接触，因此植株的表型保持原始状态。该方法包括按照实验方案建立水培系统以培养植株，随后将每株植株完整取出并置于含琼脂的培养皿中。接着使用画笔手动展开根系，并拍摄图像，以便使用 ImageJ 软件进行分析1,10,11,12。
种子萌发需要对种子表面进行灭菌，以去除细菌、真菌和病毒。通常使用70%乙醇对种子表面进行消毒。为了在不破坏种子的前提下实现有效消毒，必须严格控制酒精消毒的处理时间。若酒精处理过度，会降低种子的萌发率。不同植物物种的处理时间有所不同（例如，拟南芥的处理时间仅为3 min1,
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢美国农业部（资助号 58-6406-1-017）对本研究的支持。同时感谢美国肯塔基州鲍灵格林市西肯塔基大学生物技术中心（WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA）以及印度卢克诺印度科学与工业研究理事会中央药用与芳香植物研究所（CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India）所长提供仪器设施与支持（CSIR CIMAP 论文通讯编号：CIMAP/PUB/2022/103）。 SS 感谢美国费城圣约瑟夫大学提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 拟南芥 (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | 哥伦比亚生态型 (Col-0**，无标记)* |
| 画笔 | Amazon 或其他供应商 | 水彩圆头画笔，型号 14 (8 mm)、16 (9.5 mm)、18 (12 mm) 和 20 (14.2 mm) | |
| 配备数字相机的自动显微镜 | Leica Microsystems | LAS 版本 4.12.0，Leica Microsystems | |
| 成像软件 | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 | |
| Magenta 盒 GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| 紫花苜蓿 (Medicago sativa) | Johnny's Seeds | ||
| 培养皿 (150 mm × 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm × 15 mm 聚苯乙烯培养皿 (https://www.usascientific.com) |
| 数码相机 | Canon 或 Nikon | 任何高百万像素（至少每英寸 12 百万像素）并支持微距模式的相机 | |
| 植物琼脂 | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel 适用于植物组织培养 |
| 聚碳酸酯板 | Amazon | 厚度 1 mm | |
| 聚丙烯筛网 | Amazon | 孔径 250 µm、500 µm 和 1000 µm | |
| 扫描仪 | Epson | Epson Perfection V700 Photo（扫描分辨率为 600 dpi） |
参考文献
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