测量 体内 使用氘标记法研究人体脂肪组织动力学2H)-标记方法

摘要

本文介绍了一种用于测量的实验方案 体内 使用氘标记法研究人体脂肪组织动力学²H）标记方法。

摘要

白色脂肪组织是一种高度可塑的器官，对维持机体整体能量稳态至关重要。脂肪组织的质量及其脂肪量或分布的变化，受脂肪细胞和三酰甘油合成与分解（即周转）过程的调控。现有证据表明，皮下脂肪组织扩张的方式与程度（即肥大性增长 versus 增生性增长）及脂肪组织周转情况可影响代谢健康，因为脂肪生成已被认为参与肥胖及相关疾病的发病机制。尽管脂肪组织周转在人类健康中可能具有重要作用，但目前关于其 体内 脂肪细胞的动力学。这部分归因于脂肪组织中细胞的更新速率较慢，以及直接标记其代谢前体在实践上的复杂性 体内. 本文中，我们描述了用于测量的方法 体内 通过氘标记法研究人体内脂肪的动力学与 turnover 速率²H)-标记的水。其掺入情况 ²H掺入前脂肪细胞和脂肪细胞DNA的脱氧核糖核苷酸部分，可准确测量细胞的形成与死亡（脂肪组织更新率）。总体而言，这是一种测量 在体 脂肪动力学，代表了与其他方法的实质性偏离 体外 评估

引言

肥胖是一种以白色脂肪组织（AT）过多为特征的疾病，是2型糖尿病和心血管疾病发生的重要风险因素¹白色脂肪组织是一种高度可塑的器官，以甘油三酯（TGs）的形式储存能量，对维持代谢稳态至关重要。²白色脂肪组织在成年期仍具有扩张、缩减和重塑的能力³，且脂肪组织质量由脂肪细胞体积的动态变化决定（通过 TG 合成与分解，持续的脂肪细胞形成 通过 前脂肪细胞的增殖与分化（即增生或脂肪生成），以及脂肪细胞死亡⁴.

有证据表明，皮下脂肪组织更新（如脂肪细胞的形成与死亡）与 cardiometabolic 健康之间存在重要关联^5,6,7,8，且脂肪生成在肥胖相关疾病发病机制中的作用仍有争议⁴然而，关于这方面的了解仍然很少 体内 由于脂肪组织（AT）的细胞成分 turnover 率较慢，以及直接标记其代谢前体的复杂性，导致人体内 AT 的 turnover....

方案

彭宁顿生物医学研究中心机构审查委员会（IRB）批准了所有实验程序（#10039-PBRC），所有受试者均签署书面知情同意书。

1. 八周 ²H₂O 标记期

1. 使用无菌塑料容器给予受试者70%或99.9%的氘标记水（²H₂O）等分试样。
2. 指导受试者在第1周（启动期）每天分三次饮用35 mL的99.9%富集²H₂O，或40 mL的70%富集²H₂O；在第2至8周每天分别饮用两次35 mL或50 mL剂量。
   注意：摄入²H₂O后已知的唯一不良反应为短暂性头晕或眩晕，其与体液总体流动的快速变化有关，这种变化可被内耳毛囊感知。因此，应指导受试者每次服药间隔至少约2小时，以避免发生短暂性头晕或眩晕¹⁵。出于同样原因，不得通过单次加倍剂量来弥补漏服的剂量。按照上述方式给药（间隔≥2小时）可使该不良反应在人类受试者中极为罕见（<数百名受试者中不足1%）。
3. 通过收集尿液样本检测体水中的²H富集度，并结合每周回收空瓶进行计数，以监测受试者对²H₂O摄....

结果

的 ²H₂O标记方案（第1节）保持接近平台期 ²在为期8周的标记期间，体内水的氢同位素富集度维持在1.0%–2.5%范围内¹⁰，如图所示 图2. 之前的一项研究利用了 ²H₂用于评估脂肪组织动力学的同位素标记方案 通过 的整合 ²H 插入脂肪细胞的 DNA 中，如第 2-8 节所述，并报告了 体内 在肥胖女性中，皮下股部（scFEM）脂肪库的脂肪生成（包括前脂肪细胞增殖和脂肪细胞形成）高于皮下腹部（scABD）脂肪库图5)¹³。进一步数据显示，皮下脂肪组织库中前脂肪细胞和脂肪细胞的形成率与总体体脂百分比呈正相关图6)¹³总体而言，这些已发表的数据证实了这.......

讨论

在体 评估对于提供关于白色脂肪组织周转动态及其在肥胖及相关代谢性疾病中作用的新知识是必要的，因为 体外 评估并未涵盖脂肪组织（AT）的自然环境。尽管采用回顾性放射性碳定年法来评估脂肪动态已提供了重要信息^7,25此方法不适用于捕捉前瞻性干预研究过程中的动态变化。 ²H标记方法已得到验证，可提供生理学测量指标 体内 人类脂肪细胞的形成与更新研究，与其他评估方法相比具有显著差异。近年来，该方法已被应用于研究并揭示啮齿类动物中新的脂肪组织动力学特征²⁶ 和人类^13,27,28.

值得注意的是，采用该方法时，额外实施了脂肪组织处理技术，以纯化新分离的脂肪细胞，并去除可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-甲基咪唑	MilliporeSigma	336092
2H2O	Sigma Aldrich
乙酸酐	Aldridge	539996
ACK裂解缓冲液（红细胞裂解缓冲液）	Quality Biological Inc (VWR)	10128-802
Agilent 6890/5973 气相色谱-质谱联用仪（GC/MS）	Agilent
抗人CD31（PECAM-1）生物素标记抗体	Invitrogen	13-0319-82
抗人CD34生物素标记抗体	Invitrogen	13-0349-82
抗人CD45抗体	BioLegend	304004
抗生素-抗真菌溶液	MilliporeSigma	A5955
I型胶原酶	Worthington Biochemical Corporation	LS004196
脱氧核糖（2-脱氧-D-核糖）	MilliporeSigma	31170
氧化氘	MilliporeSigma	756822
DB-225色谱柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm）	J&W Scientific	122-2232
二氯甲烷（DCM）	MilliporeSigma	34856
DNA标准品（小牛胸腺DNA）	MilliporeSigma	D4764
DNeasy 血液与组织试剂盒（DNA提取试剂盒）	Qiagen	69504
EasySep人生物素标记试剂盒	Stem Cell Technologies	17663
EasySep人CD14阳性选择混合液	Stem Cell Technologies	18058C
乙酸乙酯	Fisher	EX0241-1
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管	VWR	60819-295
Ficoll-Paque Plus	MilliporeSigma	GE17-1440-02
气相色谱小瓶（2 mL）	Fisher	C-4011-1W
气相色谱小瓶内插管	Fisher	C-4011-631; C-4012-530
冰醋酸	Fisher	AC14893-0010
玻璃管（用于水解）	Fisher	14-959-35AA
HEPES缓冲液	ThermoFisher	15630080
Hyclone水，分子生物学级	Thomas Scientific	SH30538.02
MEM α培养基	Fisher Scientific	32561-037
PFBHA（o-(2,3,4,5,6)-五氟苄基羟胺盐酸盐）	MilliporeSigma	194484
pH指示试纸	Fisher	987618
酸性磷酸酶	Calbiochem (VWR)	80602-592
S1核酸酶（源自米曲霉）	MilliporeSigma	N5661
硫酸钠	MilliporeSigma	23913