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方法文章

测量 体内 使用氘标记法研究人体脂肪组织动力学2H)-标记方法

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DOI：

10.3791/64883

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2023年7月21日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于测量的实验方案 体内 使用氘标记法研究人体脂肪组织动力学2H）标记方法。

摘要

白色脂肪组织是一种高度可塑的器官，对维持机体整体能量稳态至关重要。脂肪组织的质量及其脂肪量或分布的变化，受脂肪细胞和三酰甘油合成与分解（即周转）过程的调控。现有证据表明，皮下脂肪组织扩张的方式与程度（即肥大性增长 versus 增生性增长）及脂肪组织周转情况可影响代谢健康，因为脂肪生成已被认为参与肥胖及相关疾病的发病机制。尽管脂肪组织周转在人类健康中可能具有重要作用，但目前关于其 体内 脂肪细胞的动力学。这部分归因于脂肪组织中细胞的更新速率较慢，以及直接标记其代谢前体在实践上的复杂性 体内. 本文中，我们描述了用于测量的方法 体内 通过氘标记法研究人体内脂肪的动力学与 turnover 速率2H)-标记的水。其掺入情况 2H掺入前脂肪细胞和脂肪细胞DNA的脱氧核糖核苷酸部分，可准确测量细胞的形成与死亡（脂肪组织更新率）。总体而言，这是一种测量 在体 脂肪动力学，代表了与其他方法的实质性偏离 体外 评估

引言

肥胖是一种以白色脂肪组织（AT）过多为特征的疾病，是2型糖尿病和心血管疾病发生的重要风险因素1白色脂肪组织是一种高度可塑的器官，以甘油三酯（TGs）的形式储存能量，对维持代谢稳态至关重要。2白色脂肪组织在成年期仍具有扩张、缩减和重塑的能力3，且脂肪组织质量由脂肪细胞体积的动态变化决定（通过 TG 合成与分解，持续的脂肪细胞形成 通过 前脂肪细胞的增殖与分化（即增生或脂肪生成），以及脂肪细胞死亡4.

有证据表明，皮下脂肪组织更新（如脂肪细胞的形成与死亡）与 cardiometabolic 健康之间存在重要关联5,6,7,8，且脂肪生成在肥胖相关疾病发病机制中的作用仍有争议4然而，关于这方面的了解仍然很少 体内 由于脂肪组织（AT）的细胞成分 turnover 率较慢，以及直接标记其代谢前体的复杂性，导致人体内 AT 的 turnover 较慢 体内 尽管 体外 方法虽已提供了一些见解，但这些方法并未提供全面的 体内 在脂肪组织的天然微环境中进行评估

赫勒斯坦实验室开发了一种方法9 用于评估 体内 使用稳定同位素氘掺入法测定AT周转率2H) 从重水中2H2O）注入AT（图1)10该方案已在小鼠和人类中得到验证，包括初始的逐步递增阶段 2H2O 以增加 2体内水的氢同位素富集，随后通过充足的每日摄入量维持稳定、接近平台期的富集水平。 2H 来自 2H2O（即重水）被掺入脂肪细胞DNA中脱氧核糖核苷酸的脱氧核糖（dR）部分，并在DNA中测定同位素富集度 通过 质谱分析及质量同位素异构体分布分析（MIDA）的应用9,10,11. 使用稳定同位素前体对DNA中嘌呤脱氧核苷酸的脱氧核糖部分进行标记，相较于以往方法（如通过嘧啶核苷酸碱基部分标记的方法，例如来自 3H-胸苷或溴脱氧尿苷）。值得注意的是，内源性碱基（尤其是嘧啶类，但不包括dR）在复制DNA中的重新掺入，此前曾干扰了对标记物掺入结果的解读12此外，将稳定同位素标记掺入dR不会引起基因毒性，而放射性或具有基因毒性的试剂（如）的掺入则不同 3H（氚）或溴脱氧尿苷。因此，该技术在动物模型和人类中的长期使用是安全的。

测量 2H标记的DNA合成表示细胞通过了细胞分裂的S期，可识别新形成的前脂肪细胞和脂肪细胞（通过 前脂肪细胞分化）或脂肪生成13快速更替的细胞（如单核细胞）会迅速替换其DNA，并达到一个平台期 2H富集，从而为检测提供内部参照。该比值 2脂肪细胞DNA相对于单核细胞（参考细胞）或整体机体的H富集 2H2O测量可用于计算新合成脂肪细胞的比例。本文所述方案介绍了测量方法 体内 人类脂肪细胞更新（脂肪生成）速率 通过 的 2H代谢标记方案，包括纯化脂肪细胞的优化技术 通过 阴性免疫筛选以富集前脂肪细胞群体14.

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方案

彭宁顿生物医学研究中心机构审查委员会（IRB）批准了所有实验程序（#10039-PBRC），所有受试者均签署书面知情同意书。

1. 八周 2H2O 标记期

  1. 使用无菌塑料容器给予受试者70%或99.9%的氘标记水（2H2O）等分试样。
  2. 指导受试者在第1周（启动期）每天分三次饮用35 mL的99.9%富集2H2O，或40 mL的70%富集2H2O；在第2至8周每天分别饮用两次35 mL或50 mL剂量。
    注意：摄入2H2O后已知的唯一不良反应为短暂性头晕或眩晕，其与体液总体流动的快速变化有关，这种变化可被内耳毛囊感知。因此，应指导受试者每次服药间隔至少约2小时，以避免发生短暂性头晕或眩晕15。出于同样原因，不得通过单次加倍剂量来弥补漏服的剂量。按照上述方式给药（间隔≥2小时）可使该不良反应在人类受试者中极为罕见（<数百名受试者中不足1%）。
  3. 通过收集尿液样本检测体水中的2H富集度，并结合每周回收空瓶进行计数，以监测受试者对2H2O摄入的依从性。
    1. 使用活性炭和滤膜对尿液样本进行净化处理。
      1. 将8 mL尿液加入含有1 mL活性炭的10 mL离心管中。
      2. 将样本置于摇床上震荡10分钟，随后在800 × g离心5分钟，使活性炭沉降至管底，再用0.2 µm针筒滤器过滤样本。
    2. 采用同位素比值质谱法（IRMS）测定体水（尿液）中2H2O的富集度。
      注意：2H2O富集度可通过多种方法分析，包括气相色谱-质谱法16、高温转化元素分析仪（TC/EA）联用IRMS17、腔衰荡红外光谱法（IRIS）18，或通过连接至质谱仪（如IRMS）的H/Device装置进行测定19。
    3. 利用8周标记期内尿液中测得的平均2H2O富集度，计算前体2H2O暴露量以及新合成AT细胞的比例（见下文第7节和第8节）。

注意： 在为期8周的标记期间，2H2O标记方案可使体内水中的2H富集度维持在接近稳态的1.0%–2.5%范围内 （图2）10。​

2. 人体脂肪组织活检样本采集

  1. 用聚维酮碘溶液清洁皮肤后，进行局部麻醉（例如，2% 利多卡因/0.5% 布比卡因），在皮肤上做一个约 0.75 cm 的切口，并采集皮下脂肪组织活检样本 通过 无菌条件下的针吸脂肪抽吸技术13.
  2. 称量一个含有5 mL室温（RT）1 M HEPES缓冲液（pH 7.3）的无菌50 mL离心管。立即将AT放入该含HEPES缓冲液的离心管中进行处理。
  3. 称量装有AT的50 mL离心管，并记录重量。

3. 纯化脂肪细胞的分离

  1. 向 2 g/mL AT 中加入浓度为 2 mg/mL 的 I 型胶原酶/HEPES 溶液。
  2. 将脂肪组织（AT）置于37 °C水浴中振荡孵育（100 rpm）1小时，直至形成均匀混合物，仅残留少量较大的完整脂肪组织块。
  3. 将离心管在 500 x g 在室温下孵育8分钟，以分离脂肪细胞和基质-血管组分（SVF）。
  4. 轻轻移除上层脂肪层（脂肪细胞），并将其转移至另一管中。切勿扰动管底的沉淀物（SVF）。
  5. 如前所述14使用免疫磁珠细胞分离法纯化脂肪细胞。
    注意：此重要步骤旨在 "清洁" 脂肪细胞与其他更新较快的细胞类型（如造血细胞、内皮细胞和干细胞）一样，可能附着于漂浮的脂肪细胞上，从而影响测量结果。
    1. 将约 400 µL 脂肪细胞加入 5 mL 离心管中，用于阴性免疫纯化。
    2. 加入FcR阻断抗体（100 µL/mL）。
    3. 向脂肪细胞溶液中加入针对内皮细胞标志物（抗人 CD31；1:100）、造血细胞标志物（抗人 CD45；1:400）和间充质干细胞标志物（抗人 CD34；1:100）的生物素化抗体混合物，在室温下孵育 15 分钟。
    4. 向脂肪细胞溶液中加入生物素筛选混合液（100 µL/mL），充分混匀，并在室温下轻轻倾斜或旋转孵育15分钟。
    5. 用移液器上下吹打混匀磁性纳米颗粒，将颗粒（50 µL/mL）加入脂肪细胞溶液中，充分混匀，室温下轻柔旋转孵育10分钟（10 rpm）。
    6. 加入 PBS/2% FBS/1 mM EDTA 缓冲液至脂肪细胞溶液中，总体积为 1 mL。
    7. 将试管置于磁铁中，静置5分钟。
    8. 拿起磁铁，连续完成倒置磁铁并连同试管一同翻转的动作，将内容物倒入一支新的5 mL试管中。倾倒过程中不要敲击试管。与抗体结合的细胞会因磁性纳米颗粒的作用而被吸附并去除，而免疫纯化的脂肪细胞则保留在管中。
    9. 将纯化的脂肪细胞在液氮中快速冷冻2并于 -80 °C 保存，直至进行 DNA 提取。

4. 前脂肪细胞的分离

  1. 为了分离富集的前脂肪细胞群体，采用一种利用基质血管组分（SVF）短期培养后其贴附于塑料表面能力的实验方案20。
  2. 在超净工作台中，将SVF沉淀重悬于5 mL红细胞裂解缓冲液中，室温孵育5–10分钟（充分混匀），然后在800 × g条件下离心。弃去上清液，将沉淀用含10%胎牛血清（FBS）的α-最小必需培养基（αMEM）重悬。
  3. 将细胞接种至塑料培养皿中，在37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中培养约8–12小时。
  4. 约8–12小时后，在超净工作台内用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤培养皿，去除未贴壁的细胞。
  5. 吸除PBS后，向培养皿中加入1–1.5 mL 0.25%胰蛋白酶/1 mM EDTA，以解离贴壁细胞（富集的前脂肪细胞群体）。将培养皿置于37 °C孵箱中约5–8分钟，以促进细胞脱落。
  6. 向培养皿中加入含10% FBS的αMEM培养基，充分冲洗以收集所有细胞。将细胞悬液转移至15 mL或50 mL离心管中，在800 × g条件下离心8分钟。
  7. 弃去上清液，将沉淀（前脂肪细胞）于−80 °C保存，直至进行DNA提取。

5. 血液单核细胞的分离

注意：单核细胞被用于代表一个（几乎）完全更新的细胞群体，单核细胞中2H富集度的测定可作为每个个体2H2O暴露的参考标志。或者，也可通过测量体内2H2O的富集度来计算2H2O的暴露水平。

  1. 使用含EDTA的真空采血管从人体受试者中抽取新鲜全血。
  2. 在4 °C条件下，以1,000–2,000 × g 离心15分钟。
    注意：请勿使用刹车。
  3. 移除上层血浆。注意不要触碰血浆下方的白色絮状层（即血沉棕黄层）。
  4. 用移液管吸取白色血沉棕黄层，并转移至50 mL离心管中。向血沉棕黄层中加入约10 mL PBS。
  5. 轻柔地加入10 mL密度梯度介质，使其在血沉棕黄层下方形成分层。
    注意：确保移液管尖端接触管底，并缓慢排出液体，以便在底部形成清晰的密度梯度介质层。避免产生气泡。
  6. 关闭刹车，以800 × g 离心30分钟。
  7. 用移液管小心吸取约10 mL的白色层（单个核细胞组分），移液时使管尖在界面附近做环形移动，但不要接触上层。将所获液体转移至新的50 mL离心管中，加入10 mL PBS，以800 × g 离心5分钟（不使用刹车），弃去上清液。
  8. 向沉淀中加入5 mL红细胞裂解缓冲液，混匀后室温静置2分钟。
  9. 向红细胞裂解缓冲液与沉淀的混合液中加入5 mL含0.1% BSA的PBS，以800 × g 离心5分钟，弃去上清液。
  10. 使用免疫磁珠法通过CD14+细胞分离单核细胞。按照试剂盒制造商提供的操作说明进行CD14+细胞的分离。
  11. 将分离得到的单核细胞保存于−80 °C，直至进行DNA提取。

6. DNA 制备（分离、水解和衍生化）

  1. 使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从前脂肪细胞、脂肪细胞和血液单核细胞中分离DNA。
  2. 为了释放脱氧核糖核苷，将DNA（约200 µL）在含有1 mL S1核酸酶、1 mL磷酸酶和36.8 mL 5x水解缓冲液的50 µL酶水解混合液中，于37 °C酶解过夜（不超过24小时），反应在16 mm × 100 mm（10 mL）螺口玻璃管中进行。此外，还需包括以下样品：水空白、水解混合液空白、DNA提取试剂盒的柱空白，以及500 ng的DNA标准品。
    1. 配制5x水解缓冲液：将94 mL分子生物学级纯水加入无菌烧杯中。称取3.08 g乙酸钠和21.5 mg硫酸锌，加入水中并搅拌至完全溶解。用冰醋酸调节pH至5.0，并用pH试纸检测。加水定容至100 mL。
    2. 配制磷酸酶：将一管酸性磷酸酶用1 mL纯水重悬。
    3. 配制0.5 U/µL的S1核酸酶：将2.5 µL S1核酸酶加入2 mL 1x水解缓冲液中（将1 mL 5x水解缓冲液与4 mL纯水混合）进行稀释。
  3. 将水解产物衍生化为五氟苄基羟胺（PFBHA）衍生物。具体操作：在已消化的DNA样品（包括标准品和空白样品）中，直接加入16 mm × 100 mm（10 mL）螺口管中：100 µL五氟苄基羟胺盐酸盐（PFBHA；1 mg/mL）和75 µL冰醋酸。涡旋混匀（短暂），盖紧管盖，将样品置于100 °C加热块中反应30分钟。
  4. 取出样品，室温下冷却约5分钟。冷却后，在通风橱中向每管加入2 mL乙酸酐和100 µL 1-甲基咪唑。将试管置于100 °C加热块中反应5分钟。
  5. 取出样品，冷却约15–20分钟。冷却后，向每个样品中加入3 mL分子生物学级水，短暂涡旋混匀，静置10分钟。
  6. 向各管中加入2 mL二氯甲烷（DCM），剧烈涡旋15秒，以将衍生物萃取至有机相。
  7. 以800 × g离心5分钟以分离两相。小心将下层二氯甲烷相转移至洁净的1.6 mL气相色谱小瓶中。
    注意：避免转移任何水相，以免增加背景信号。
  8. 用氮气吹干约20分钟以去除DCM和残留的乙酸，随后在室温下用真空浓缩仪干燥约10分钟，彻底去除试剂残留。

7. DNA的气相色谱-质谱法（GC-MS）分析

  1. 干燥后，将PFBHA衍生物重悬于150 µL乙酸乙酯中，盖紧。随后分析其掺入情况 2H 进入 DNA，使用配备 DB-225 柱的气相色谱（GC）/质谱（MS）仪器，以甲烷负化学电离方式电离，并在选择离子监测模式下采集 m/z 435、m/z 436 和 m/z 437 的离子（代表 M0，M1，以及 M2 质量同位素体，分别）。请遵循所用仪器的制造商说明。
    1. 设定气相色谱条件如下：色谱柱：30 m × 0.25 mm 内径 × 0.25 µm 涂层厚度；载气：氦气，恒流1.0 mL/min；脉冲不分流进样；进样口温度：250 °C；质谱传输线温度：325 °C；程序升温条件：初始温度100 °C，保持2 min，以40 °C/min升温至220 °C，保持7.5 min，再以40 °C/min升温至320 °C，保持1 min。总运行时间为16.0 min。第一和第二峰的典型dR洗脱时间分别为10.5 min和10.8 min。
    2. 设定质谱条件如下：甲烷负化学电离源，单离子监测模式检测；采集dR的离子：m/z 435、m/z 436 和 m/z 437（代表M0，M1，以及 M2 质量同位素体，分别）。
      注意：在玻璃衬管下部放入一小团硅化玻璃棉，对敞口玻璃衬管进行硅化处理。需经常更换该衬管（约每100次进样后）。
  2. 计算未富集（天然丰度）dR衍生物中M1质量同位素异构体丰度比，方法如下：
    M1 比例 = M1 丰度 /（M0、M1 和 M2 丰度之和）
    然后，从标记样品的 dR 中的 M1 比值减去天然丰度的 M1 比值，以计算富集度（同位素过量丰度，即 %EM1）21.
  3. 在分析样品中M0离子丰度范围内，同时测量基线（未富集）DNA标准品在一系列M0离子丰度下的质量同位素异构体丰度。
    注意：此步骤对于校正至关重要 "丰度灵敏度" 通过气相色谱-质谱法（GC/MS）测定的同位素比值22.
  4. 构建未标记标准品中实测M0离子丰度与实测质量同位素异构体M1比值之间的关系图，以确定对M1质量同位素异构体最准确的上柱样品浓度（即M1比值最接近已知的、计算得到的天然丰度M1比值时的浓度） "最佳点"）。该未富集的dR衍生物的M1比值为0.1669。
  5. 注射实验样品时，应使其尽可能接近M0峰区域 "最佳点". 采用未富集标准品的M1比率与M0峰面积之间的二次回归来估算一个 "调整后的自然丰度" 每个样本在其特定M0浓度下的M1比率。从脂肪细胞样本的M1比率中减去该值，得到高于天然丰度的富集百分比，即%EM1。图3)23.
  6. 计算理论最大 M1 使用质量同位素分布分析（MIDA）方程在脂肪细胞中测定富集度（EM1*）24 根据身体 2H2O暴露（通过尿液检测）在8周期间的累积值（图4或中间测得的单核细胞富集度（步骤 7.5）。

8. 新合成细胞比例的计算，或 体内 脂肪生成

  1. 计算新细胞的比例（%），这是衡量新细胞数量的指标 体内 脂肪生成，即新合成的前脂肪细胞或脂肪细胞的形成，使用以下公式：
    新细胞比例（%）= [（M1 样本[脂肪]细胞中的富集)/EM1*（理论最大M1 富集率)] × 100
    注意：*The 2单核细胞中的H富集度也可用作方程的分母。该指标在单核细胞中代表一种参考性细胞标志物 2H2O暴露量在每个个体中的测定可用于验证理论最大M的计算结果1从测量的样本中富集 2H2O值。

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结果

的 2H2O标记方案（第1节）保持接近平台期 2在为期8周的标记期间，体内水的氢同位素富集度维持在1.0%–2.5%范围内10，如图所示 图2. 之前的一项研究利用了 2H2用于评估脂肪组织动力学的同位素标记方案 通过 的整合 2H 插入脂肪细胞的 DNA 中，如第 2-8 节所述，并报告了 体内 在肥胖女性中，皮下股部（scFEM）脂肪库的脂肪生成（包括前脂肪细胞增殖和脂肪细胞形成）高于皮下腹部（scABD）脂肪库图5)13。进一步数据显示，皮下脂肪组织库中前脂肪细胞和脂肪细胞的形成率与总体体脂百分比呈正相关图6)13总体而言，这些已发表的数据证实了这...

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讨论

在体 评估对于提供关于白色脂肪组织周转动态及其在肥胖及相关代谢性疾病中作用的新知识是必要的，因为 体外 评估并未涵盖脂肪组织（AT）的自然环境。尽管采用回顾性放射性碳定年法来评估脂肪动态已提供了重要信息7,25此方法不适用于捕捉前瞻性干预研究过程中的动态变化。 2H标记方法已得到验证，可提供生理学测量指标 体内 人类脂肪细胞的形成与更新研究，与其他评估方法相比具有显著差异。近年来，该方法已被应用于研究并揭示啮齿类动物中新的脂肪组织动力学特征26 和人类13,27,28.

值得注意的是，采用该方法时，额外实施了脂肪组织处理技术，以纯化新分离的脂肪细胞，并去除可能...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢彭宁顿生物医学研究中心质谱核心实验室的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-甲基咪唑MilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
乙酸酐Aldridge539996
ACK裂解缓冲液（红细胞裂解缓冲液）Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 气相色谱-质谱联用仪（GC/MS） Agilent
抗人CD31（PECAM-1）生物素标记抗体Invitrogen13-0319-82
抗人CD34生物素标记抗体Invitrogen13-0349-82
抗人CD45抗体BioLegend304004
抗生素-抗真菌溶液MilliporeSigmaA5955
I型胶原酶Worthington Biochemical CorporationLS004196
脱氧核糖（2-脱氧-D-核糖）MilliporeSigma31170
氧化氘MilliporeSigma756822
DB-225色谱柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm）J&W Scientific122-2232
二氯甲烷（DCM）MilliporeSigma34856
DNA标准品（小牛胸腺DNA）MilliporeSigmaD4764
DNeasy 血液与组织试剂盒（DNA提取试剂盒）Qiagen69504
EasySep人生物素标记试剂盒Stem Cell Technologies17663
EasySep人CD14阳性选择混合液Stem Cell Technologies18058C
乙酸乙酯FisherEX0241-1
Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管VWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
气相色谱小瓶（2 mL）FisherC-4011-1W
气相色谱小瓶内插管FisherC-4011-631; C-4012-530
冰醋酸FisherAC14893-0010
玻璃管（用于水解）Fisher14-959-35AA
HEPES缓冲液ThermoFisher15630080
Hyclone水，分子生物学级Thomas ScientificSH30538.02
MEM α培养基Fisher Scientific32561-037
PFBHA（o-(2,3,4,5,6)-五氟苄基羟胺盐酸盐）MilliporeSigma194484
pH指示试纸Fisher987618
酸性磷酸酶Calbiochem (VWR)80602-592
S1核酸酶（源自米曲霉）MilliporeSigmaN5661
硫酸钠MilliporeSigma23913

参考文献

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