本研究描述了一种利用实时细胞分析（RTCA）系统监测人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在病毒感染过程中变化的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
内皮细胞排列在所有血管和淋巴管的内表面，形成一种半透性屏障，调节血液或淋巴液与其周围组织之间的液体和溶质交换。病毒穿越内皮屏障的能力是促进其在人体内播散的重要机制之一。已有许多研究表明，多种病毒在感染过程中会改变内皮通透性，和/或导致内皮细胞屏障功能破坏，从而引发血管渗漏。本研究描述了一种实时细胞分析（RTCA）方案，利用商用的实时细胞分析仪，监测寨卡病毒（ZIKV）感染人脐静脉内皮细胞（HUVECs）过程中内皮完整性和通透性的变化。ZIKV感染前后记录的阻抗信号被转化为细胞指数（CI）值并进行分析。该RTCA方案能够检测病毒感染期间以细胞形态变化形式出现的瞬时效应。该检测方法也可用于其他实验条件下HUVECs血管完整性的研究。
引言
内皮细胞（ECs）排列在所有血管和淋巴管的内表面，通过黏附连接、紧密连接和间隙连接相互连接，形成血液或淋巴液与周围组织之间的半透性屏障。1,2完整的内皮细胞间连接对于调控大分子、溶质和液体的转运至关重要，而这种调控对相应组织和器官的生理活动具有重要作用。3内皮屏障具有动态性，并受特定刺激的调节4内皮屏障功能的破坏或丧失是多种疾病在急性和慢性炎症发生发展过程中疾病病理生理学的显著特征。5,6,7，包括病毒感染8,9,10,11对于黄病毒而言，研究发现非结构蛋白NS1能够改变内皮细胞的通透性，例如 通过 由于组织蛋白酶L、唾液酸酶和内源性肝素酶的表达增加及其活化，导致内皮糖萼样层遭到破坏9在疾病状态下，内皮单层结构的完整性....
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方案
1. 细胞准备
- 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的制备
- 将7.5 × 105个HUVEC细胞/mL接种于一个75 cm2的细胞培养瓶中（培养瓶预先用20 µg/mL I型胶原蛋白包被），加入12 mL内皮细胞培养基（ECM），培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、0.01%内皮细胞生长补充剂（ECGS，含有培养HUVEC所需的生长因子、激素和蛋白质）以及0.01%青霉素-链霉素（P/S）。将细胞置于37 °C、5% CO2的细胞培养孵育箱中培养（图1）。
2. RTCA 实验的设置
- 在 RTCA 上进行电阻验证运行
- 双击桌面上的 RTCA 软件 图标以启动应用程序。登录窗口将出现，输入用户名和密码进行登录。
- 将一个 96 孔 RTCA 电阻板（A1 孔朝内）放入细胞培养孵育箱中的 RTCA 站内。
- 在 RTCA 软件的 实验备注（Exp Notes） 选项卡中，输入实验名称、设备序列号（SN）和设备类型（QC 板）。 ....
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结果
在感染寨卡病毒（ZIKV）之前，培养于特殊金微电极包被的微量培养板上的 HUVEC 单层细胞所记录的细胞指数（CI）高于 8，表明细胞具有较强的黏附特性。细胞指数低于 8 的培养板或孔应予以弃用。随后，将 HUVECs 以 0.1 和 1 的感染复数（MOI）感染 ZIKV，并连续记录 7 天的细胞阻抗。以 MOI 为 0.1 感染 ZIKV P6-740 的 HUVECs（浅蓝色线）的 CI 值在感染后 15 小时（HPI）开始下降，相较于阴性感染对照组（棕色线；图 4）。而对于以较高剂量 ZIKV P6-740（MOI = 1，蓝色线）感染的 HUVECs，CI 值早在 11 HPI 即开始下降。在 24 HPI 时，当内皮细胞以 MOI 0.1 和 1 感染 ZIKV 时，归一化 CI 值分别下降了 5% 和 7%（0.949，0.929）。在 MOI 为 0.1 和 1 时，分别于 96 HPI 和 66.75 HPI 记录到归一化 CI 值下降 50%。归一化 CI 值在 107 HPI 达到最低点，此时在 MOI 为 0.1 和 1 的 ZIKV 感染下，分别下降了.......
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讨论
容许性细胞中的杀细胞病毒感染通常伴随着细胞形态和生物合成的显著变化36。病毒诱导的细胞形态学改变，例如细胞皱缩、细胞肿大和/或合胞体形成，也被称为细胞病变效应（CPEs），是某些病毒感染的特征性表现37。在内皮细胞（ECs）中，CPE表现为细胞破坏以及相邻内皮细胞之间紧密连接的断裂，从而导致内皮屏障功能的破坏38,39。在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，CPE可表现为单层细胞从培养容器表面脱离并漂浮。感染引起的细胞形态变化，例如贴壁细胞的脱离和漂浮，可通过实时细胞分析（RTCA）方法持续检测。该技术基于电学阻抗原理，可实现对细胞的实时监测，频率可达每数秒一次。该方法可用于定量分析细胞增殖和形态变化，对于HUVECs而言，还可用于监测刺激后内皮完整性及细胞屏障功能的变化40。
在本研究中，关键步骤是实验设置，其中使用了96.......
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究获得了马来西亚高等教育 Ministry 在高等学府卓越中心（HICoE）项目（MO002-2019）下的支持，以及长期研究资助计划（LRGS MRUN 第一阶段：LRGS MRUN/F1/01/2018）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | 巢 | 615601 | |
| 37 °37°C 培养箱，含 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 组织培养瓶 | 康宁 | 430725U | |
| 抗生素溶液 青霉素-链霉素（P/S） | Sciencell | 0503 | |
| II级生物安全柜 | Holten | HB2448 | |
| I型胶原 | Sigma-Aldrich | C3867 | |
| 内皮细胞生长补充剂（ECGS） | Sciencell | 1052 | |
| 内皮细胞培养基（ECM） | Sciencell | 1001 | |
| E-plate 96 | 安捷伦科技公司 | 05232368001 | |
| 胎牛血清（FBS） | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' 平衡盐溶液（HBSS） | Sigma-Aldrich | H9394 | |
| 血细胞计数板 | Laboroptik LTD | 纽鲍尔改进 | |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVECs） | Sciencell | 8000 | |
| 倒置显微镜 | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 笔记本电脑 | 戴尔 | - | |
| 多通道移液器（10 - 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| 多通道移液器（30 - 300 µL | Eppendorf | 3125000052 | |
| 试剂储液槽 | 塔森斯 | T38-524090 | |
| RTCA 96孔电阻板 | 安捷伦科技公司 | 05232350001 | |
| RTCA Software Pro（版本 2.6.1） | 安捷伦科技有限公司 | 5454433001 | |
| 单通道移液器（10 - 100 µL | Eppendorf | 3123000047 | |
| 单通道移液器（100 - 1000） µL | Eppendorf | 3123000063 | |
| 单通道移液器（20 - 200 µL | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence 实时细胞分析仪 SP（型号：W380） | 安捷伦科技有限公司 | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
参考文献
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-34....
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