用于蛋白质结构测定的冷冻电镜分析的最新进展和最佳实践

Julien Bergeron; Chiara Rapisarda

doi:10.3791/64907

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用于蛋白质结构测定的冷冻电镜分析的最新进展和最佳实践

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DOI：

10.3791/64907

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2023年2月10日

Julien Bergeron¹ , Chiara Rapisarda²

¹Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, King’s College London, ²Bio Structure and Biophysics (BSB), Sanofi

本文内容

摘要

文章讨论：

de Martin Garrido， N.， Ramlaul， K.， Aylett， CHS 使用支撑浮选块在透射电子显微镜中制备样品支撑膜。可视化实验杂志。（170）， doi：10.3791/62321 （2021）.

Klebl， DP， Sobott， F.， White， H. D.， Muench， SP. 时间分辨冷冻电子显微镜的快速网格制备。可视化实验杂志。（177），doi：10.3791/62199 （2021）。

Budell， WC， Allegri， L.， Dandey， V.， Potter， CS， Carragher， B. 使用新型机器人系统 Spotiton 进行时间分辨研究的冷冻电子显微镜网格制备。可视化实验杂志。（168），doi：10.3791/62271 （2021）。

Nguyen， H. P. M.， McGuire， K. L.， Cook， B. D.， Herzik， MA， Jr. 用于单颗粒低温电子显微镜的生物标本的手动印迹和浸入冷冻。可视化实验杂志。（180），doi：10.3791/62765 （2022）。

Martynowycz， M. W.， Gonen， T. 小分子的微晶电子衍射。可视化实验杂志。（169），doi：10.3791/62313 （2021）。

Bisson， C.， Hecksel， CW， Gilchrist， JB， Fleck， RA 使用用于冷冻电子断层扫描的双光束扫描电子显微镜从玻璃体生物样品中制备薄片。可视化实验杂志。（174），doi：10.3791/62350 （2021）。

Wypych， D.， Kierecki， D.， Golebiowski， FM， Rohou， A. gP2S，用于 CryoEM 实验的信息管理系统。可视化实验杂志。（172），doi：10.3791/62377 （2021）。

社论

自直接电子探测器的出现和软件和硬件的改进以来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已成为一种通常允许研究人员确定大分子结构的技术，使其接近原子的细节^1,2。从样品制备到数据收集和处理，一系列节奏极快的新发展催化了这种加速。为了允许将这项技术广泛民主化给非专家，已经创建了更高效、更易于访问的管道。引人注目的是，在“分辨率革命”后不到 10 年，冷冻电镜已成为学术界和工业界蛋白质表征的重要技术 ^3,4。

冷冻电镜研究界最引人注目的方面之一是愿意公开分享协议、策略和软件⁵。这种技术和专业知识的开放性极大地促进了非常快的发展步伐，但一些瓶颈仍然阻碍了它的完全普及。在本方法集中，我们旨在描述在制备适合冷冻电镜结构分析的网格方面的一些最新进展，这与数据分析硬件的访问一起，是许多项目的主要瓶颈。我们还讨论了该领域目前正在开发的新方案，用于冷冻电镜分析的新方法。

如上所述，目前冷冻电镜在实验室常规应用的瓶颈之一是样品制备。在样品应用于网格的层面上可能会遇到几个问题：最常见的是样品在冰中的首选方向，以及它在空气-水界面处的变性。将样品与空气-水界面隔离是解决此问题的一种方法，方法是使用碳或石墨烯支撑膜，物理上防止样品与空气接触。为了促进薄膜在网格上的应用，de Martin Garrido等人6^{开发了一种} 由3D打印机生产的支撑浮块，该块允许以受控方式应用小水滴和样品。使用该块，石墨烯和碳层以廉价且用户友好的方式沉积。

防止空气-水界面损坏的另一种方法是限制蛋白质暴露在大气中的时间。为此，Klebs 等人 ⁷ 和 Budell 等人 ⁸ 开发的两种不同的仪器使用新颖的方法进行快速（低至 10 毫秒）网格制备，从而降低了颗粒取向问题的可能性。这些设备的另一个优点是可以进行时间分辨实验，这是结构研究的一个令人兴奋的新领域。

在一种对比鲜明的方法中，Nguyen等^人9报告了一种在没有商业或定制设备的情况下冻结网格进行冷冻电镜分析的方法，这些设备要么非常昂贵，要么难以构建。他们展示了如何使用不需要任何昂贵仪器的廉价自制设备获得类似质量的网格，从而有助于冷冻电镜的民主化。

在冷冻电镜中，感兴趣的样品并不总是蛋白质，而可以是小分子或大型生物系统，例如整个细胞。此类样品的制备是独一无二的，需要特定的步骤以及不同的数据收集策略。

对于微晶电子衍射（MicroED），要研究的样品是一种通常以粉末形式存在的小化学物质。粉末直接涂在电磁网格上以保持结晶形式。然后以衍射模式进行数据收集，如 Martynowycz 和 Gonen¹⁰ 所示。相比之下，整个细胞对于冷冻电镜分析来说太厚了。为了解决这个问题，Bisson等人报告了一种使用SEM对此类样品进行物理钻孔的方法，以获得适合结构研究的薄片¹¹。

从样品到结构，保留过程的每个步骤的记录非常重要，因为每个蛋白质样品的许多参数都会发生变化，从蛋白质浓度到显微镜设置和数据分析。为此，Wypych 等人 ¹² 开发了一种基于网络的信息管理工具，允许用户组织他们的工作流程并跟踪未来出版物所需的所有细节。随着自动化在冷冻电镜中变得越来越普遍，尤其是在工业环境中，这一点尤为重要。

在过去十年中，冷冻电镜在硬件和软件方面都以惊人的速度发展。为确保广泛传播最佳做法和广泛采用新方法，有必要制定一套透明的议定书。本期特刊将促进这一努力。

致谢

JB 感谢 BBSRC （BB/R009759/2）和 HFSP （RGY0080/2021）的资助。

参考文献

Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Smith, M. T. J., Rubinstein, J. L. Beyond blob-ology. Science. 345 (6197), 617-619 (2014).
Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. 91, 1-32 (2022).
Wigge, C., Stefanovic, A., Radjainia, M. The rapidly evolving role of cryo-EM in drug design. Drug Discovery Today. Technologies. 38, 91-102 (2020).
Tachibana, C. Democratizing cryo-EM: Broadening access to an expanding field. Science. 367 (6484), 1394(2020).
de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block. Journal of Visualized Experiments. (170), e62321(2021).
Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (177), e62199(2021).
Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. (168), e62271(2021).
Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).
Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal electron diffraction of small molecules. Journal of Visualized Experiments. (169), e62313(2021).
Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (174), e62350(2021).
Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, an information management system for CryoEM experiments. Journal of Visualized Experiments. (172), e62377(2021).

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