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方法文章

使用石墨烯电极阵列进行脑部图谱绘制

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DOI：

10.3791/64910

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2023年10月20日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nano-Bioengineering, Incheon National University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提出一种基于石墨烯阵列的脑图谱绘制方法，以降低侵入性并提高时空分辨率。基于石墨烯阵列的表面电极具有长期生物相容性、良好的机械柔韧性，适用于复杂脑表面的脑图谱绘制。该方案可实现多种感觉图谱的同时和连续构建。

摘要

皮层图谱代表了大脑皮层中对感觉运动刺激产生位置依赖性神经反应的空间组织，能够预测具有生理意义的行为。已有多种方法被用于获取皮层图谱，例如穿透性电极、脑电图、正电子发射断层扫描、脑磁图以及功能性磁共振成像。然而，这些方法受限于较差的时空分辨率、较低的信噪比（SNR）、高昂的成本，以及缺乏生物相容性或会对脑组织造成物理损伤等问题。本研究提出一种基于石墨烯阵列的躯体感觉图谱绘制方法，作为皮层脑电图的一项技术特征，具有优异的生物相容性、高时空分辨率、理想的信噪比，并能最大限度减少对组织的损伤，从而克服了以往方法的缺陷。本研究验证了石墨烯电极阵列在大鼠躯体感觉图谱绘制中的可行性。所介绍的实验方案不仅适用于躯体感觉皮层，还可推广至听觉、视觉和运动皮层等其他皮层区域，为临床应用提供了先进的技术手段。

引言

皮层图谱是一组局部区域，用于表征大脑皮层对感觉运动刺激的反应特性。它们构成了神经网络的空间结构，并能够预测感知与认知功能。因此，皮层图谱在评估神经对外部刺激的反应以及处理感觉运动信息方面具有重要价值1,2,3,4。目前已有侵入性和非侵入性两种方法可用于皮层定位。其中最常见的侵入性方法之一是使用皮层内（或穿透性）电极进行图谱绘制5,6,7,8。

利用穿透性电极按需评估高分辨率皮层图谱面临诸多障碍。该方法获取优质图谱过于耗时，且侵入性过强，难以用于临床实践，从而限制了进一步发展。近年来，脑电图（EEG）、正电子发射断层扫描（PET）、脑磁图（MEG）和功能磁共振成像（fMRI）等技术因其侵入性较小且可重复性较高而受到广泛关注。然而，由于成本高昂且空间分辨率较低，这些技术仅在少数情况下得以应用9,10,11。最近，具有优异信号可靠性的柔性表面电极引起了广泛关注。基于石墨烯的表面电极表现出长期的生物相容性和良好的机械柔韧性，可在复杂的脑表面实现稳定的信号记录12,13,14,15,16。本课题组近期开发了一种基于石墨烯的多通道阵列，可用于皮层表面的高分辨率记录和靶向神经刺激。该技术使我们能够长期追踪感觉信息在皮层上的表征变化。

本文介绍了使用30通道石墨烯多电极阵列获取体感皮层脑图谱的步骤。为测量脑部活动，将石墨烯电极阵列放置于皮层的硬膜下区域，同时使用木棒依次刺激前爪、前肢、后爪、后肢、躯干和胡须。记录各体感区域的体感诱发电位（SEPs）。该方案也可应用于其他脑区，如听觉皮层、视觉皮层和运动皮层。

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方案

所有动物操作程序均经仁川国立大学机构动物护理和使用委员会批准（INU-ANIM-2017-08）。

1. 手术动物准备

注意：本实验使用无性别偏倚的 Sprague Dawley 大鼠（8–10 周龄）。

  1. 通过腹腔注射给予大鼠90 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪混合物进行麻醉。在整个手术过程中，当大鼠出现苏醒迹象时，追加45 mg/kg氯胺酮和5 mg/kg赛拉嗪混合物，以维持所需的麻醉深度。
  2. 确认大鼠处于深度麻醉状态，并定期检查其身体反射，如脚趾夹捏反射、尾部夹捏反射和角膜反射。
  3. 使用修剪器剃除大鼠两眼之间至耳后区域的毛发。
  4. 在眼睛上涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。

2. 皮层表面暴露手术

  1. 使用立体定位适配器将大鼠头部固定在立体定位仪上。手术期间，将大鼠置于温控加热垫上，以维持其体温在 37 °C。
  2. 用酒精和聚维酮碘交替擦拭剃毛区域，重复三次以进行消毒。
  3. 用镊子牢固夹住头皮，用注射器将 0.1 mL 利多卡因（2%）直接注射至头皮，以实现手术区域的局部麻醉。
  4. 使用手术刀沿中线做一条 2–3 cm 长的切口，分开头皮以暴露颅骨。
  5. 用蚊式钳夹住头皮，充分暴露颅骨。
  6. 用镊子刮擦颅骨表面，以去除骨膜。
  7. 钝性分离枕骨区域的肌肉，暴露位于脊髓上方枢椎水平的延髓池。
  8. 用刀片切开延髓池以引流脑脊液，并将无菌纱布置入延髓池切口内，持续吸收脑脊液，以防止脑水肿并减轻炎症反应。
  9. 使用铅笔在颅骨上标记一个矩形窗口，该窗口从前后方向距右侧半球前囟 3 mm，向右外侧方向 6 mm。
    注意：标记时必须确保距离中线 1 mm，以避免损伤上矢状窦。
  10. 根据立体定位坐标钻孔，并用骨钳去除标记区域的颅骨。
  11. 为去除硬脑膜，将 26 G 针头尖端弯成 90°，在硬脑膜上穿孔，挑起硬脑膜，将镊子插入孔中，用镊子撕除硬脑膜。
  12. 将生理盐水浸湿的纱布覆盖于体感皮层，防止其干燥。

3. 制备连接至记录系统的石墨烯电极阵列

  1. 准备带有Omnetics连接器的石墨烯电极阵列。
    1. 通过施加生理盐水溶液，无损伤地分离石墨烯多电极阵列。
    2. 移除连接器上参考电极和接地导线的外层包覆。
  2. 将前置放大器与石墨烯电极阵列连接至连接器。
  3. 将连接前置放大器的接口电缆插入记录系统。
  4. 将石墨烯电极阵列组件固定在立体定位臂上。
  5. 根据预先确定的立体定位坐标，将阵列无弯曲地置于体感皮层，以从所有通道采集神经信号。
  6. 将参考导线置于枕骨后方的组织下方，并将接地导线连接至接地的光学平台。

4. 物理刺激与记录 SEP 以进行定位

  1. 打开神经信号记录软件。
  2. 设置记录软件环境：（1）设定体感诱发电位（SEPs）的采样率和陷波滤波器（60 Hz 或 50 Hz，即家用电源频率），以去除电源线噪声。
  3. 进行须毛定位时，使用细棒弯曲须毛。
  4. 使用木棒持续轻戳前爪、前肢、后爪、后肢和躯干，进行躯体定位。
  5. 在数据采集系统中记录指定时间的神经信号。

5. 动物安乐死

  1. 完成所有记录步骤后，使用>5% 异氟烷麻醉处死大鼠，并进行颈椎解剖。

6. 用于皮层定位的 SEP 测量

  1. 打开 MATLAB 代码，文件名为 read_Intan_RHS2000_file.m，用于信号分析。
    注意：read_Intan_RHS2000_file.m 可从 "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software” 下载。
  2. 点击 运行 按钮，选择文件扩展名为 ".rhs" 的记录文件，并等待文件完成处理和读取。
  3. 输入命令 "plot (t, amplifier_data("通道编号",:))"，以生成记录数据的二维线图，识别体感诱发电位（SEPs），并计算所有通道中 SEPs 的幅值。
    注意：在 "通道编号"处输入具体的通道编号。例如，"plot(t, amplifier_data(1,:))" 将生成第 1 通道的二维线图。此外，在计算反应幅值时，需选择从每个通道记录到的反应信号。
  4. 根据 SEPs 幅值的不同，使用不同色调对网格进行着色，以获取数据可视化结果。
    注意：使用 MATLAB 命令 "imagesc" 可更快速地生成地形图。

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结果

本方案描述了如何将石墨烯多通道阵列安装在脑表面。通过采集物理刺激引发的神经反应并计算反应幅度，构建体感图谱。图1展示了本实验的示意图。

图2A展示了石墨烯电极阵列的结构特征。电极之间的基底上设有通孔。这些孔有助于电极牢固地接触皮层表面（图2B）。电极与皮层之间的牢固贴合有助于记录噪声更小的神经信号。

图2C（左）显示了通过刺激胡须、躯干、足部和四肢（以不同颜色编码）所获得的与位置相关的神经反应。根据体感皮层图中每种颜色区域的实际比例，绘制了一个大鼠体感小人图（rat homunculus），即大鼠的微型身体表示（图2C，右）。

图2D<...

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讨论

本方案详细阐述了使用石墨烯电极阵列记录和绘制大鼠体感反应的逐步操作流程。通过该方案获取的数据为体感诱发电位（SEPs），可提供与各个身体部位突触连接的体感信息。

在进行该实验方案时，应考虑多个方面。当抽取脑脊液以防止脑水肿并减轻炎症时，实验人员必须注意不要损伤位于小脑延髓池前方的脑干。

面部须毛可提供有关周围环境的触觉信息，例如黑暗而狭窄的环境。因此，啮齿类动物的须毛发育良好，能够通过须毛的偏转方向、刺激强度以及受刺激须毛的位置来感知物体。体感皮层对每根须毛的弯曲方向、强度和位置具有不同的响应18,19。因此，本实验方案中所有须毛均以恒定的强度和方向进行刺激。

由于我们的石墨烯电极阵列安装在皮层表面，该方案无法记录深部脑结构中诱发的信号。因此，实验者无法确定柱状网络在神经反应方面的层次化组织方式。

该...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本工作由仁川国立大学（国际协作）为Sunggu Yang提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器KOREAVACCINE CORPORATION注射麻醉药物 
3 mL 注射器KOREAVACCINE CORPORATION注射麻醉药物 
骨钳Fine Science Tools16220-14去除颅骨
连接器Gbrain将石墨烯电极连接至前置放大器
钻机FALCON tool研磨颅骨
钻头Osstem implant研磨颅骨
Graefe 爱丽丝镊（轻度弯曲带齿）vubuvudu-02-73010从颅骨上移除组织或夹持擦拭工具
石墨烯多电极阵列Gbrain记录神经元信号
异氟烷Hana Pharm Corporation处死实验动物
氯胺酮yuhan corporation用于麻醉
利多卡因（2%）Daihan pharmaceutical 局部麻醉剂
Matlab R2021bMathworks数据分析软件
蚊式止血钳Fine Science Tools91309-12固定头皮
眼膏Alcon防止眼睛干涩 
聚维酮碘Green Pharmaceutical corporation消毒切口区域
RHS 32通道刺激/记录前置放大器intan technologiesM4032连接连接器与接口电缆，并内置 Intan RHS 刺激/放大芯片
RHS 6英尺（1.8米）刺激SPI接口电缆intan technologiesM3206将石墨烯电极连接至前置放大器
RHS 刺激/记录控制器软件intan technologies数据采集软件
RHS 刺激/记录控制器intan technologiesM4200
生理盐水JW Pharmaceutical
手术刀HammacherHSB 805-03
立体定位仪stoelting固定实验动物
无菌皮下注射针头KOREAVACCINE CORPORATION去除硬脑膜
Steven 爱丽丝组织镊KASCO50-2026去除硬脑膜
手术刀片 No.11FEATHER切开头皮
手术剪Fine Science Tools14090-09切开头皮并去除硬脑膜
木棒胡须刺激
赛拉嗪Bayer Korea用于麻醉

参考文献

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