植物细胞类型的分离与转录组分析

摘要

高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法的可行性和有效性预示着植物研究进入单细胞时代。本文介绍了一种分离特定拟南芥（Arabidopsis thaliana）根细胞类型，并进行后续转录组文库构建与分析的稳健且完整的实验流程。

摘要

在多细胞生物中，不同细胞类型甚至细胞内部的发育编程和环境响应可能具有高度差异性，这种现象被称为细胞异质性。近年来，单细胞和细胞类型分离技术结合高通量测序（NGS）已成为在单细胞分辨率下研究生物学过程的重要工具。然而，由于植物细胞具有细胞壁，植物细胞的分离相对更为困难，这限制了单细胞技术在植物中的应用。本实验方案描述了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的植物单细胞及特定细胞类型分离的可靠方法，适用于后续的多组学分析及其他研究。利用拟南芥（Arabidopsis）根部荧光标记品系，我们展示了如何分离特定细胞类型，例如木质部极中柱鞘细胞、侧根起始细胞、侧根冠细胞、皮层细胞以及内皮层细胞。此外，还提供了一种基于Smart-seq2的有效下游转录组分析方法。该细胞分离方法和转录组分析技术可推广至其他细胞类型和植物物种，在植物科学领域具有广泛的应用潜力。

引言

细胞是所有生物体的基本单位，执行着结构和生理功能。尽管多细胞生物中的细胞表现出明显的同步性，但在发育过程和环境响应中，不同类型细胞以及单个细胞的转录组仍存在差异。高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）为理解细胞异质性提供了前所未有的能力。在植物科学中应用scRNA-seq已成功构建了植物细胞图谱¹，用于鉴定植物组织中的稀有细胞类群²，揭示植物组织中细胞类型的组成，并用于识别细胞身份及植物发育与分化过程中的重要功能。此外，利用scRNA-seq可推断植物组织中的时空发育轨迹^1,2,3，发现新的标记基因⁴，研究关键转录因子的功能⁵，从而揭示不同植物中相同细胞类型的进化保守性³。非生物胁迫是影响植物生长和发育最重要的环境因素之一。通过单细胞转录组测序分析不同处理条件下植物组织中细胞类型组成的变化，还可解析植物对非生物胁迫的响应机制⁶。

利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析不同细胞类型间转录异质性的潜力，取决于细胞分离方法和测序平台。荧光激活细胞分选（FACS）是一种广泛应用的技术，可根据细胞的光散射特性和荧光特性，从混合细胞群体中分离出特定的亚群用于scRNA-seq。通过转基因技术构建的荧光标记品系已显著提高了FACS细胞分离的效率⁷。结合Smart-seq2⁸方法进行scRNA-seq，可进一步增强对细胞异质性的解析能力。Smart-seq2方法具有较高的基因检测灵敏度，即使在转录本输入量较低的情况下也能有效检测基因⁹。除了可用于批量细胞类型的收集外，现代细胞分选仪还提供单细胞索引分选模式，使得利用Smart-seq2¹⁰或其他多重RNA-seq方法（如CEL-seq2¹¹）实现单细胞分辨率的转录组分析成为可能。单细胞或特定细胞类型的分选还可应用于多种下游研究，例如并行的多组学分析^12,13。本文展示了一种稳健且通用的实验方案，用于从拟南芥（Arabidopsis thaliana）荧光标记品系的根中，通过FACS分离特定植物细胞类型，包括木质部极中柱鞘细胞、侧根冠细胞、侧根起始细胞、皮层细胞以及内皮层细胞。该方案进一步包括构建Smart-seq2文库，以用于后续的转录组分析。

方案

以下实验方案已针对A. thaliana野生型（WT）种子进行优化，这些种子无荧光，并含有以下根部细胞类型的荧光标记品系：木质部极中柱鞘细胞（J0121）、侧根起始细胞、侧根冠细胞（J3411）、内皮层和皮层 细胞 （J0571）（图1A）。所有标记品系均购自商业来源（见材料表），唯独侧根起始细胞的标记品系系通过将GATA23启动子驱动的GFP构建体导入野生型Arabidopsis植株中获得，方法依据先前发表的文献¹⁴。

1. 植物材料的准备

1. 将拟南芥（A. thaliana）野生型种子及荧光标记品系种子置于20%次氯酸钠溶液中，在室温下于旋转摇床中孵育15分钟，进行表面灭菌。
2. 用双蒸水（ddH₂O）清洗种子3至5次。此步骤应在无菌超净工作台上进行。
3. 将野生型和报告基因品系种子接种于含0.8%琼脂（w/v）的半倍浓度Murashige和Skoog（MS）培养基上¹⁵。在4 °C条件下春化处理2天后，于23 °C、16小时光照条件下垂直培养5天。

2. 原生质体制备

1. 制备原生质体分离溶液^2,5，即溶液A和溶液B（见材料表）。
   1. 配制含有400 mM甘露醇、0.05%牛血清白蛋白（BSA）、20 mM MES（pH 5.7）、10 mM CaCl₂和20 mM KCl的溶液A（见材料表）。将溶液A于−20 °C保存，可保存长达1个月。
   2. 在新鲜分装的溶液A中加入1%（w/v）纤维素酶R10、1%（w/v）纤维素酶RS、1%（w/v）半纤维素酶、0.5%（w/v）果胶酶和1%（w/v）离析酶R10，配制成溶液B。将溶液B于−20 °C保存，可保存长达1个月。
2. 实验开始前，将溶液A和溶液B在冰上轻轻解冻。
3. 使用洁净的刀片或剪刀切除根部，并将根切成约0.5 cm长的小段。将根段浸入1.5 mL溶液B中，在室温下轻轻旋转（约18 rpm）孵育1.5–2小时。
4. 用40 µm滤网（见材料表）过滤根原生质体。
5. 用1–2 mL溶液A冲洗滤网。
6. 合并步骤2.4和步骤2.5所得液体，在4 °C下以300 x g离心5分钟。用移液器弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500–600 µL溶液A中，立即置于冰上。
7. 将重悬的细胞溶液转移至一个新的5 mL试管中，用于细胞分选。

3. 荧光激活细胞分选（FACS）

1. 启动分选仪并完成仪器设置步骤（参见材料表）。选择荧光通道，使用野生型植株（无荧光）作为对照以确定自发荧光基线，并根据荧光强度及FSC/SSC单细胞群（图2）调整分选门。
2. 向1.5 mL收集管中加入500 µL溶液A（步骤2.1.1），以防止细胞受损。每管收集2,000–3,000个细胞。
3. 分选完成后，立即将样品置于冰上，在4 °C条件下以300 × g离心5分钟，并用移液器吸除上清液。
4. 取2 µL分选后的细胞，使用荧光显微镜检测荧光信号（参见材料表）。
5. 将分选后的细胞储存于−80 °C，或立即用于文库构建（步骤4）。
6. 进行单细胞指数分选时，将96孔板放入适配器中。校准板的位置，确保液滴落入板的中心孔。分选时选择单细胞分选模式，将目标分选细胞数设为1，然后开始分选。

4. Smart-seq2 文库构建

1. 由于输入量极低，应在无污染环境中进行单细胞类型RNA测序文库构建。实验开始前，使用表面去污剂⁸（见材料表）和75%乙醇清洁实验台。
2. 通过混合0.33 µL的10% Triton X-100、0.55 µL RNase抑制剂和0.22 µL的0.1 M DTT配制裂解缓冲液（混合液A）（表1）（见材料表）。
3. 向分选后的样品中加入1 µL混合液A，并用无菌研磨棒研磨。推荐样品体积≤0.5 µL；使用无RNase水将体积补至14 µL。将每个单细胞样品转移至0.2 mL薄壁PCR管中。
4. 配制含0.44 µL寡核苷酸-dT₃₀VN逆转录（RT）反应引物（100 µM）和4.4 µL dNTPs（10 mM）的混合液B（表2）（见材料表）。
5. 向每管14 µL样品中加入4.4 µL混合液B，轻轻吹打混匀，然后在72 °C孵育3分钟。孵育后立即置于冰上，使寡核苷酸-dT与poly A尾杂交。
6. 配制逆转录反应混合液（混合液C）（表3）（见材料表）。向每管含样品的反应体系中加入21.6 µL混合液C，并在普通PCR仪上启动逆转录程序（表4）。
7. 在冰上进行预扩增反应。通过混合44 µL 2x PCR聚合酶混合液和0.88 µL IS PCR引物（10 µM）配制混合液D（表5）（见材料表）。向40 µL逆转录反应产物中加入40.8 µL混合液D，并运行预扩增程序（表6）。
8. 使用Ampure XP磁珠纯化预扩增反应产物（见材料表）。向4.7步骤中的每个样品加入48 µL磁珠（0.6:1比例），并通过移液轻轻混匀样品。
9. 室温孵育样品10分钟。将含有样品的1.5 mL离心管置于磁力分离架上5分钟。小心弃去上清液，避免扰动磁珠。
10. 用200 µL 80%乙醇重悬磁珠以洗涤样品，再次将样品置于磁力分离架上（见材料表）3分钟，随后弃去含乙醇的上清液。
11. 将样品在空气中干燥10分钟，并盖好管盖，防止干燥过程中发生污染或交叉污染。
12. 用20 µL ddH₂O重悬磁珠，在室温下孵育5分钟，然后置于磁力分离架上5分钟。
13. 从每管中吸取18 µL上清液，转移至新的1.5 mL离心管中。取1 µL样品使用DNA定量试剂盒评估cDNA质量，使用片段分析仪（见材料表）测定各预文库的片段大小分布，并将剩余样品储存在−20 °C。
14. 使用测序文库构建试剂盒（见材料表），从4.13步骤获得的预文库产物构建用于Illumina测序¹⁶的cDNA文库⁸。
15. 使用Ampure XP磁珠纯化文库（来自步骤4.14），定量纯化后的文库，并参照步骤4.13测定各文库的片段大小分布。
    注意：应将各文库按相等的纳摩尔数混合，确保没有任何两个文库使用相同的Illumina索引组合。否则，可根据预期测序产出按比例混合文库，并在同一Illumina测序仪通道中共同测序。通常，每个文库测序深度达到4–6 GB，可获得>1000万条比对上的读段，从而实现拟南芥（Arabidopsis）基因组20x–30x的覆盖度。较低的测序深度也可接受，但可能影响差异表达分析的显著性。

5. RNA-seq 数据分析

1. 使用 Trim-Galore¹⁷ 对原始测序数据进行修剪，随后利用 hisat2¹⁸（daehwankimlab.github.io/hisat2）将数据比对至参考基因组 ，并使用 Picard¹⁹（broadinstitute.github.io/picard）去除 PCR 重复片段。
2. 使用 DESeq2²⁰ 对原始计数数据进行处理，并对差异表达基因（DEG）进行后续分析，每一样本至少需包含三个生物学重复。利用 Pheatmap 软件包对基因表达进行聚类分析，并以表达热图形式进行可视化。
   注意：基因和转座元件（TEs）的 RPKM（每千碱基每百万比对读段数）值通过 Stringtie¹⁸（github.com/gpertea/stringtie）计算，并在基因组浏览器中进行可视化展示。

结果

Protoplast isolation
This protocol is effective for the protoplast sorting of fluorescent A. thaliana root marker lines. These markers lines have been developed by the fusion of fluorescent proteins with genes expressed specifically in target cell types, or using enhancer trap lines (Figure 1). Numerous tissues and organs have been dissected into cell types expressing specific fluorescent markers in model plants and crops.

FAC...

讨论

基于 Smart-seq2 的实验方案可以从数百个细胞中生成可靠的测序文库⁸。起始材料的质量对于转录组分析的准确性至关重要。荧光激活细胞分选（FACS）是富集目标细胞的有力工具，但该流程（尤其是原生质体制备步骤）需针对植物应用进行优化。激光捕获显微切割（LCM）或手工分离的细胞也可作为起始材料^25,26，因此本文提供的实验方案有望适用于多种植物物种和细胞类型，无论是否存在已知的标记基因。

植物材料的制备
在植物发育生物学中，流式细胞术（FACS）通常用于分离表达荧光标记的富集细胞群体。表达此类标记的植株需制备成原生质体，随后根据细胞类型特异性标记的表达情况，将原生质体分选为纯化的亚群。因此，荧光标记的信号必须强且具有特异性。此外，研究人员应预先确认哪些标记可用于分选。所需种子的数量取决于表达水平、标记的表达位置、下游应用所需的细胞数量以及分选的重复次数。如果标记在每株植物中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 和微量;m 过滤器	Sorfa	622110
琼脂	Yeasen	70101ES76
安捷伦片段分析仪	Aglient	Aglient 5200
安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒	Aglient	DNF-474-0500
Ampure XP 珠子	BECKMAN	A63881
甜菜碱	yuanye	S18046-100g
漂白	Mr Muscle	FnBn83BK	20% （v/v） 漂白
BSA	sigma	9048-46-8
CaCl2	yuanye	S24109-500g
纤维素酶 R10	养乐多 （日本）	9012-54-8
纤维素酶 RS	养乐多 （日本）	9012-54-8
离心管 （1.5 mL）	Eppendolf	30121589
DNase、RNase、DNA 和 RNA 表面去污剂	Beyotime	R0127
dNTPs （10 mM）	NEB	N0447S
DTT （0.1 M）	invitrogen	18090050
乙醇	国药集团化学试剂有限公司	100092680
FACS	BD FACS Melody	BD-65745
FACS	索尼	SH800S
滤网提示 （1000 µL）	Thermo Scientific	TF112-1000-Q
滤芯吸头 （200 µL）	Thermo Scientific	TF140-200-Q
滤芯吸头（10 µL）	Thermo Scientific	TF104-10-Q
滤芯吸头（100 &微量;L）	Thermo Scientific	TF113-100-Q
荧光显微镜	Nikon	Eclipse Ni-E
四维旋转混合器	Kylin -Bell	BE-1100
半纤维素酶	sigma	9025-56-3
IS PCR 引物			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix（2X）	罗氏
KCl	国药集团化学试剂有限公司	7447-40-7
Macerozyme R10	Yakult （Japan）	9032-75-1
磁性分离架	invitrogen	12321D
甘露醇	阿拉丁	69-65-8
MES	阿拉丁	145224948
MgCl2	元业	R21455-500ml
微量离心机	Eppendorf	离心机 5425
微量微型离心机	Titan	Timi-10k
MS	Phytotech	M519
Nextera XT DNA 文库制备试剂盒	illumina	FC-131-1024
oligo-dT30VN 引物			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT< > TTTTTTTTTTVN-3'PCR
仪	热循环仪	A24811
果胶解酶	Yakult （Japan）	9033-35-6
植物标记系	诺丁汉拟南芥库存中心 （NASC）
Qubit 1x dsDNA HS 检测试剂盒	invitrogen	Q33231
Qubit 2.0 荧光计	invitrogen	Q32866
RNase 抑制剂	Thermo Scientific	EO0382
不含 RNase 的水	invitrogen	10977023
溶液 A			400 mM 甘露醇、0.05 % BSA、20 mM MES （pH5.7）、10 mM CaCl2、20 mM KCl
溶液 B			1 % （w/v） 纤维素酶 R10、1 % （w/v） 纤维素酶 RS，1 % （w/v）半纤维素酶，0.5 % （w/v）果胶裂解酶和 1 % （w/v）Macerozyme R10 在新鲜等分试样的溶液 A
无菌研杵	BIOTREAT	453463
过滤器（40 µm ）	索尔法	251100
SuperScript IV 逆转录酶 （200 U/µL）	invitrogen	18090050
SuperScript IV 缓冲液 （5x）	invitrogen	18090050
试管 （5 mL）	BD Falcon	352052
带盖薄壁 PCR 管 （0.5 mL）	AXYGEN	PCR-05-C
Triton X-100	Sangon Biotech	A600198-0500
TSO 引物			5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3'
涡流	泰坦	VM-T2