高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）方法的可行性和有效性预示着植物研究进入单细胞时代。本文介绍了一种分离特定拟南芥（Arabidopsis thaliana）根细胞类型的稳健且完整的流程，以及后续的转录组文库构建与分析方法。
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本文内容
摘要
摘要
在多细胞生物中，不同细胞类型甚至细胞内部的发育编程和环境响应可能具有高度差异性，这种现象被称为细胞异质性。近年来，单细胞和细胞类型分离技术结合高通量测序（NGS）已成为在单细胞分辨率下研究生物学过程的重要工具。然而，由于植物细胞具有细胞壁，植物细胞的分离相对更为困难，这限制了单细胞技术在植物中的应用。本实验方案描述了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的植物单细胞及特定细胞类型分离的可靠方法，适用于后续的多组学分析及其他研究。利用拟南芥（Arabidopsis）根部的荧光标记品系，我们展示了如何分离特定细胞类型，例如木质部极中柱鞘细胞、侧根起始细胞、侧根冠细胞、皮层细胞以及内皮层细胞。此外，还提供了一种基于Smart-seq2的有效下游转录组分析方法。该细胞分离方法和转录组分析技术可推广至其他细胞类型和植物物种，在植物科学领域具有广泛的应用潜力。
引言
细胞是所有生物体的基本单位，执行着结构和生理功能。尽管多细胞生物中的细胞表现出明显的同步性，但在发育过程和环境响应中，不同类型细胞以及单个细胞的转录组仍存在差异。高通量单细胞RNA测序（scRNA-seq）为理解细胞异质性提供了前所未有的能力。在植物科学中应用scRNA-seq已成功构建了植物细胞图谱1，用于鉴定植物组织中的稀有细胞类群2，揭示植物组织中细胞类型的组成，并用于识别细胞身份及植物发育与分化过程中的重要功能。此外，利用scRNA-seq可推断植物组织中的时空发育轨迹1,2,3，发现新的标记基因4，研究重要转录因子的功能5，从而揭示不同植物中相同细胞类型的进化保守性3。非生物胁迫是影响植物生长和发育最重要的环境因素之一。通过单细胞转录组测序分析不同处理条件下植物组织中细胞类型组成的动态变化，还可解析植物对非生物胁迫的响应机制6。
利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析不同细胞类型间转录异质性....
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方案
以下实验方案已针对A. thaliana野生型（WT）种子进行优化，这些种子无荧光，同时适用于以下根部细胞类型的荧光标记品系：木质部极中柱鞘细胞（J0121）、侧根起始细胞、侧根冠细胞（J3411）、内皮层和皮层 细胞 （J0571）（图1A）。所有标记品系均购自商业来源（见材料表），唯侧根起始细胞标记品系系通过将GATA23启动子驱动的GFP载体导入野生型Arabidopsis植株中获得，方法依据先前发表的文献14。
1. 植物材料的准备
- 将 A. thaliana 野生型种子及荧光标记品系种子在室温下置于旋转培养箱中，用20%次氯酸钠溶液孵育15分钟，进行表面灭菌。
- 用重蒸水（ddH2O）清洗种子三至五次。此步骤需在无菌超净工作台上进行。
- 将野生型种子和报告基因品系种子接种于含0.8%琼脂（w/v）的1/2 Murashige和Skoog（MS）培养基上15。在4°C下层积处理2天后，于23°C、16小时光照条件下垂直培养5天。
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结果
原生质体分离
该方案适用于荧光标记的拟南芥（A. thaliana）根部标记品系的原生质体分选。这些标记品系通过将荧光蛋白与在特定靶细胞类型中特异性表达的基因融合，或利用增强子捕获品系构建而成（图1）。在模式植物和作物中，已有大量组织和器官被分离为表达特定荧光标记的不同细胞类型。
FACS 细胞群、分选细胞及文库质控
通过使用野生型植株作为对照，并设定前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）等门控参数，我们确定了主要的目标细胞群以及自发荧光的基线水平，并成功分选出荧光特异性标记的细胞（图 2）。最终测序文库（来自步骤 4.15）的质量通过片段大小分布分析进行评估。约 2,000 个木质部极中柱鞘细胞、侧根原基细胞、内皮层/皮层细胞以及侧根冠细胞的 RNA-seq 文库代表性结果如 图 3A-.......
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讨论
基于Smart-seq2的实验方案可以从数百个细胞中生成可靠的测序文库8。起始材料的质量对于转录组分析的准确性至关重要。荧光激活细胞分选（FACS）是富集目标细胞的有力工具，但该流程（尤其是原生质体制备步骤）需针对植物应用进行优化。激光捕获显微切割（LCM）或手工分离的细胞也可作为起始材料25,26，因此本文提供的实验方案有望适用于多种植物物种和细胞类型，无论是否存在已知的标记基因。
植物材料的制备
在植物发育生物学中，流式细胞术（FACS）通常用于分离表达荧光标记的富集细胞群体。表达此类标记的植株需制备成原生质体，随后根据细胞类型特异性标记的表达情况，将原生质体分选为纯化的亚群。因此，荧光标记的信号必须强且具有特异性。此外，研究人员应预先确认哪些标记可用于分选。所需种子的数量取决于标记的表达水平、表达部位、下游应用所需的细胞数量以及分选的重复次数。如果标记仅在每株植物中极.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本方案由上海交通大学农业与生物学院单细胞多组学平台建立，并得到国家自然科学基金（项目编号：32070608）、上海市浦江人才计划（项目编号：20PJ1405800）以及上海交通大学（项目编号：Agri-X20200202、2019TPB05）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm 滤网 | Sorfa | 622110 | |
| 琼脂 | Yeasen | 70101ES76 | |
| Agilent fragment analyzer | Aglient | Aglient 5200 | |
| Agilent 高灵敏度 DNA 试剂盒 | Aglient | DNF-474-0500 | |
| Ampure XP 磁珠 | BECKMAN | A63881 | |
| 甜菜碱 | yuanye | S18046-100g | |
| 漂白 | Mr Muscle | FnBn83BK | 20% (v/v) 次氯酸钠溶液 |
| BSA | sigma | 9048-46-8 | |
| CaCl2 | yuanye | S24109-500g | |
| 纤维素酶 R10 | Yakult（日本） | 9012-54-8 | |
| Cellulase RS | Yakult（日本） | 9012-54-8 | |
| 离心管（1.5 mL） | Eppendolf | 30121589 | |
| DNase、RNase、DNA和RNA清除表面去污剂 | Beyotime | R0127 | |
| dNTPs (10 mM) | NEB | N0447S | |
| DTT (0.1 M) | invitrogen | 18090050 | |
| 乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 100092680 | |
| 荧光激活细胞分选 | BD FACS Melody | BD-65745 | |
| 荧光激活细胞分选 | 索尼 | SH800S | |
| 滤尖 (1000 µL) | 赛默飞世尔科技 | TF112-1000-Q | |
| 滤嘴尖 (200 µL) | Thermo Scientific | TF140-200-Q | |
| 滤尖10 µL) | Thermo Scientific | TF104-10-Q | |
| 滤尖100 µL) | Thermo Scientific | TF113-100-Q | |
| 荧光显微镜 | 尼康 | Eclipse Ni-E | |
| 四维旋转混合器 | Kylin -Bell | BE-1100 | |
| 半纤维素酶 | sigma | 9025-56-3 | |
| IS PCR 引物 | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3' | ||
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) | 罗氏 | 7958935001 | |
| KCl | 国药集团化学试剂有限公司 | 7447-40-7 | |
| Macerozyme R10 | Yakult（日本） | 9032-75-1 | |
| 磁力分离架 | invitrogen | 12321D | |
| 甘露醇 | aladdin | 69-65-8 | |
| MES | 阿拉丁 | 145224948 | |
| MgCl2 | yuanye | R21455-500ml | |
| 微量离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5425 | |
| 微型离心机 | Titan | Timi-10k | |
| MS | 植物科技 | M519 | |
| Nextera XT DNA文库制备试剂盒 | illumina | FC-131-1024 | |
| oligo-dT30VN 引物 | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTVN-3' | ||
| PCR仪 | 热循环仪 | A24811 | |
| 果胶酶 | Yakult（日本） | 9033-35-6 | |
| 植物标记品系 | 诺丁汉拟南芥种质中心 (NASC) | ||
| Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit | invitrogen | Q33231 | |
| Qubit 2.0 荧光仪 | invitrogen | Q32866 | |
| RNase 抑制剂 | 赛默飞世尔科技 | EO0382 | |
| 无RNase水 | invitrogen | 10977023 | |
| 溶液A | 400 mM 甘露醇，0.05% BSA，20 mM MES（pH 5.7），10 mM CaCl₂2，20 mM KCl | ||
| 溶液B | 1 % (w/v) 纤维素酶 R10，1 % (w/v) 纤维素酶 RS，1 % (w/v)半纤维素酶，0.5 % (w/v)果胶酶和1% （w/v）Macerozyme R10 溶于新鲜分装的 A 溶液中 | ||
| 无菌研杵 | 生物处理 | 453463 | |
| 过滤器（40 µm ) | Sorfa | 251100 | |
| SuperScript IV 逆转录酶（200 U/µL) | invitrogen | 18090050 | |
| SuperScript IV 缓冲液 (5x) | invitrogen | 18090050 | |
| 试管（5 mL） | BD Falcon | 352052 | |
| 薄壁PCR管（带盖，0.5 mL） | AXYGEN | PCR-05-C | |
| Triton X-100 | Sangon Biotech | A600198-0500 | |
| TSO引物 | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACATrGrG+G-3' | ||
| 涡旋震荡 | Titan | VM-T2 |
参考文献
- Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
- Denyer, T., et al.
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重印与许可
