方法文章

从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型

5.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64917

⸱

2023年2月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1GenPhySE, Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM, Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria, Robert Koch-Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用冷冻保存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案。同时，我们还描述了一种由三维类器官衍生建立细胞单层的方法，可实现对上皮细胞顶膜侧的接触与研究。

摘要

肠道类器官正越来越多地被用于研究消化道上皮，以建立消化系统疾病的模型，或探究其与药物、营养物质、代谢物、病原体以及微生物群的相互作用。目前，多种物种的肠道类器官培养方法均已建立，其中包括猪。猪作为一种重要的家畜，同时也是人类转化医学研究的重要模型，例如用于研究人畜共患病。本文详细描述了一种利用冻存的上皮隐窝细胞培养猪肠道三维类器官的操作流程。该方案涵盖了从猪肠道中分离上皮隐窝的冷冻保存方法，以及后续三维肠道类器官的培养步骤。该方法的主要优势包括：（i）将隐窝分离与三维类器官培养在时间上分离开来；（ii）可一次性制备来自多段肠道及多只动物的大批量冻存隐窝库存；从而（iii）减少了对活体动物新鲜组织取样的需求。此外，我们还详细介绍了由三维类器官衍生建立细胞单层的方案，以便能够接触上皮细胞的顶膜侧，该区域是营养物质、微生物或药物相互作用的关键部位。总体而言，本文所述的实验方案为兽医学和生物医学研究中猪肠道上皮的研究提供了有价值的工具。

引言

肠上皮由单层细胞构成，覆盖在消化道黏膜表面，与管腔环境相接触。这一位置赋予其多种功能，例如营养吸收和屏障功能，这些功能依赖于干细胞以及多种分化的上皮细胞类型（吸收细胞、肠内分泌细胞、潘氏细胞和杯状细胞）1。传统上用于研究上皮细胞的永生化细胞系存在显著局限性，因为它们无法反映肠上皮的细胞复杂性，并且存在基因组异常2。Sato 等人3建立的三维（3D）类器官模型为研究肠上皮提供了更具生理相关性的新体系。实际上，肠类器官来源于非转化的干细胞，包含多种细胞类型，能够重现肠上皮的功能。目前，肠类器官正被越来越多地用于研究肠上皮的发育与功能，以及其与病原体、营养物质、毒素、药物、微生物群及其代谢产物之间的相互作用2。

最初为人类和小鼠开发的肠道类器官培养方法，近年来已扩展至其他物种，包括猪4。Gonzales 等人5首次成功从猪空肠培养出类器官；此后，已有研究报道了来源于其他肠道节段（十二指肠、回肠和结肠）的猪类器官6,7,8，并证实其可维持特定部位的表型特征9,10,11。目前，猪肠道三维类器官已被广泛用于研究营养物质的作用12,13以及肠道感染6,8,14。

大多数研究描述了从新鲜分离的肠上皮隐窝开始培养肠道类器官的方法。然而，由于后勤原因，这并不总是可行的，尤其是在使用猪等大型动物时。事实上，养猪的动物设施可能距离培养类器官的实验室较远，这给工作安排带来了困难。此外，类器官培养耗时较长，因此同时培养多个类器官系（例如来自不同肠段或多个动物）并不现实。为解决这些问题，已有少数针对人类、马和猪的研究报道了从冷冻肠道组织（或活检样本）或分离的上皮隐窝中培养类器官的方法4,15,16,17。这些方法允许将单个动物多个肠段的肠上皮干细胞进行冷冻保存，并在需要时用于类器官的培养。此外，该方法还可显著减少作为干细胞供体的活体动物使用数量，因为可以建立大量冷冻保存的隐窝库存（符合3R原则）。该方法的另一优势在于，可在获得表型或基因型结果后，仅选择感兴趣的动物进行肠道类器官的培养，从而大幅降低成本。

体内，肠上皮细胞具有极性，其顶面朝向管腔。体外在三维类器官中，上皮细胞的顶面也朝向管腔（即位于类器官内部）4。这种结构限制了对顶面的接触，在研究管腔成分（例如营养物质、微生物、代谢物）对上皮细胞的影响时成为一个难题。为克服这一缺点，已开发出多种方法，如将类器官细胞培养为二维单层、显微注射以及极性翻转（"顶面朝外类器官"）18,19。其中，类器官细胞单层培养正逐渐成为最高效且易于操作的体系。其原理是将三维类器官解离为单个细胞，并接种于预先包被薄层细胞外基质（ECM）的细胞培养容器中20。在此培养条件下，上皮细胞的顶面朝上，因而可直接接受实验处理20。近期，类器官细胞单层培养技术已被成功应用于猪肠道研究21,22；源自猪三维类器官的细胞单层已被广泛用于多项研究，包括肠道感染研究6,23,24,25、营养物质转运9以及消化系统疾病建模26。

本研究首先提供了一种详细的方案，用于培养和维持由冷冻保存的上皮隐窝细胞获得的猪肠道三维类器官（图1）。随后，描述了一种从猪肠道三维类器官建立细胞单层的方案。本文所述方法为研究猪肠道上皮的营养物质转运、屏障功能以及宿主与微生物相互作用提供了实验工具。

方案

本方案已获得当地伦理委员会（N°TOXCOM/0136/PP）批准，符合欧洲关于用于科学目的动物保护的指令（2010/63/EU）。本方案以空肠为例进行描述，但可适用于小肠和大肠的各个节段（十二指肠、空肠、回肠、结肠）。

1. 从仔猪肠道中分离上皮隐窝

注意：准备一管完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEMc），即在DMEM中添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。分装成每份50 mL，于4 °C保存，可存放1个月。

  1. 溶液的制备（应在隐窝分离当天进行）
    1. 制备含有磷酸盐缓冲液（PBS）、3 mM 二硫苏糖醇（DTT）、9 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、10 µM Y27632 ROCK 抑制剂和 1% 青霉素-链霉素（P/S）的解离溶液，并置于冰上保存。
    2. 制备含有 DMEMc、10% 胎牛血清（FBS）、10% 二甲基亚砜（DMSO）和 10 µM Y27632 ROCK 抑制剂的冷冻溶液，并置于冰上保存（最终 FBS 浓度为 18%）。
    3. 制备含有添加 1% P/S 的冷 PBS 的运输溶液，并将其置于冰上保存。
  2. 上皮隐窝的分离
    1. 通过电击麻醉后放血的方式处死一只仔猪。
    2. 屠宰后立即使用手术刀打开仔猪腹部，取出整个肠道。
    3. 采集约 2 cm 长的一段肠组织，并将其保存在冷运输溶液中。将组织置于冰上，直至进行隐窝分离（最多 2 小时）。
    4. 将组织置于培养皿中，沿纵向切开肠段，并用含 1% P/S 的冷 PBS 轻柔冲洗组织，以去除肠内容物。
    5. 将组织转移至一个盛有 10 mL 含 1% P/S 的冷 PBS 的新培养皿中。
    6. 用镊子固定组织，使用载玻片刮除绒毛和残留黏液。
      注：可通过显微镜观察上清液来确认绒毛（舌状结构）是否已被去除。
    7. 将组织转移至含有 5 mL 冰冷解离溶液的 15 mL 圆锥形离心管中，在室温（RT）下于旋转摇床（15 rpm）中孵育 30 分钟。
    8. 将组织转移至新的培养皿中，并加入 10 mL 含 1% P/S 的冷 PBS。
    9. 使用载玻片用力刮擦黏膜，机械分离隐窝。
      ​注：在显微镜下确认 PBS 中存在上皮隐窝（图 2A）。
    10. 用移液管吸取隐窝溶液，通过 100 µm 细胞滤网过滤至 50 mL 圆锥形离心管中。
    11. 取 10 µL 溶液进行显微镜检查，确认隐窝的存在，随后在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    12. 在无菌生物安全柜中弃去上清液，将隐窝沉淀重悬于 10 mL 含 10 µM Y27632 ROCK 抑制剂的冷 DMEMc 中。
    13. 取 10 µL 隐窝溶液加入 48 孔板中，在显微镜下以 10 倍物镜手动计数隐窝数量，并计算每毫升溶液中的隐窝浓度。
      注：分离得到的隐窝可直接用于肠类器官培养。然而，通常更方便的做法是从每只仔猪中大量分离隐窝后进行冷冻保存，以便后续用于类器官培养。
  3. 上皮隐窝的冷冻保存
    1. 将相当于 900 个隐窝的体积转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    2. 弃去上清液，将隐窝沉淀重悬于 1 mL 冷冻溶液中，转移至冻存管，并将冻存管放入细胞冻存盒中。
    3. 将细胞冻存盒置于 -80 °C 保存 24 小时，然后将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

2. 利用冻存的肠上皮隐窝建立仔猪肠道三维类器官

注意：仔猪肠道三维类器官在专为人类类器官生长配制的商用培养基中培养，培养基中添加1%青霉素-链霉素双抗和100 µg/mL针对原代细胞的抗菌剂，于4 °C保存，可使用长达1周。三维类器官的培养采用肿瘤来源的细胞外基质（ECM）。所有商用产品信息均列于材料表中。

  1. 材料准备
    1. 将移液器吸头置于 -20 °C 冰箱中（至少过夜）。
    2. 提前至少 1 小时将冻存的细胞外基质（ECM）分装液（500 µL）置于 4 °C 冰箱中。
    3. 将 48 孔板预热至 37 °C、5% CO2 培养箱中。
    4. 将培养基置于室温（RT）。
    5. 将水浴锅预热至 37 °C。
    6. 在超净台内放置一个小型冰桶，并保持无菌条件。
  2. 冻存上皮隐窝的解冻
    1. 将含有 900 个冻存隐窝的冻存管在 37 °C 水浴中快速解冻（不超过 5 分钟）。
    2. 将隐窝溶液转移至 15 mL 圆底离心管中。
    3. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    4. 使用预冷的吸头加入 150 µL ECM，使最终浓度为每 25 µL ECM 中含 150 个隐窝。上下吹打 10 次，使隐窝在 ECM 中形成均匀悬浮液。
      注意：操作过程中始终将 ECM 置于冰上，以防止其发生聚合。操作 ECM 时必须使用 -20 °C 预冷的移液器吸头。移液时应缓慢操作，避免在 ECM 中产生气泡。此步骤使用未稀释的 ECM，以防止小液滴塌陷。
    5. 使用预冷吸头在预热的 48 孔板中，每孔接种 25 µL 液滴，共接种六孔。
      注意：保持移液器吸头垂直，位于孔中央，缓慢移液且避免引入空气，以形成圆顶状液滴。此处使用 48 孔板，是因为从冻存隐窝起始时类器官数量通常较少。
    6. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟，使 ECM 聚合。
    7. 每孔加入 250 µL 室温培养基。置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，并每 2–3 天更换一次培养基。
      注意：解冻后隐窝通常不可见，大多数细胞在 ECM 中处于解离状态（图 2B）。

3. 来自冷冻隐窝的仔猪肠道三维类器官的传代

注意：从冻存的隐窝获得类器官所需的时间通常比使用新鲜隐窝更长。类器官通常在解冻后10天即可进行传代（图2B）。

  1. 材料准备
    1. 将冻存的细胞外基质（ECM）分装液（500 µL）置于 4 °C 至少 1 小时。
    2. 将 24 孔板预热至 37 °C。
    3. 将磷酸盐缓冲液（PBS）和添加了 10 µM Y27632 ROCK 抑制剂的酶解离试剂在 37 °C 水浴中预热。
    4. 将培养基置于室温（RT）。
    5. 在超净台内无菌条件下放置一个小冰桶。
  2. 源自冻存隐窝的 3D 类器官传代
    1. 吸除培养基，并用 250 µL 预热至 37 °C 的 PBS 洗涤每孔。
    2. 向每孔加入 250 µL 预热至 37 °C 的含 10 µM Y27632 ROCK 抑制剂的酶解离试剂。
      注意：由于类器官数量较少，解离操作直接在各孔中进行。
    3. 使用 P1000 移液器刮取以脱离 ECM 中的类器官，并通过上下吹打 5 次小心混匀。
    4. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 5 分钟。使用 P1000 移液器上下吹打 10 次以进一步解离细胞。
      注意：目标是获得单个细胞或小细胞团（<10 个细胞）。在显微镜下检查解离效果。若仍可见较大类器官片段，请重复步骤 3.2.4。
    5. 向含有解离细胞的每孔中加入 500 µL DMEMc，并将最多 12 孔的细胞合并至一个含有 3 mL 冷 DMEMc 的 15 mL 圆锥管中。
    6. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 mL 冷 DMEMc 中。
    7. 用台盼蓝按 1:2 稀释后使用细胞计数仪进行细胞计数。
      注意：如果存在小细胞团，自动细胞计数仪仍可对其中的细胞进行计数。
    8. 根据所需每穹顶（即 24 孔板每孔）接种 3,000 个活细胞的数量，取相应体积的细胞悬液，在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。
    9. 将每 3,000 个活细胞用 17 µL 冷 DMEMc 在冰上重悬。根据所需孔数调整总体积。
    10. 每 3,000 个活细胞缓慢加入 33 µL 冷 ECM（使用预冷的枪头），在冰上混匀，避免产生气泡。根据所需孔数调整总体积。
      注意：细胞最终重悬于含 1/3 DMEMc 和 2/3 ECM 的混合液中。每个穹顶需要 50 µL 此混合液。稀释后的 ECM 成本更低且更易于移液操作。
    11. 使用预冷枪头向预热的 24 孔板中每孔接种 50 µL ECM-细胞悬液。
    12. 在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 30 分钟，使 ECM 聚合。
    13. 每孔加入 500 µL 培养基。置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养，每 2–3 天更换一次培养基。
      注意：类器官可直接用于以下用途：i) 实验；ii) 维持 3D 类器官培养；iii) 冻存；或 iv) 接种类器官细胞单层（图 1）。每日在显微镜下观察类器官生长情况，以确定最佳传代时机。健康的类器官应具有清晰且空的腔体以及明确的边缘。腔内含有黑色碎片的成熟类器官不应用于传代（图 3）。

4. 类器官三维培养的维持

注意：传代时，类器官应呈现透明状并具有空腔。分裂后约5天，空腔内会出现黑色碎片，表明存在死亡细胞。为最佳维持培养状态，传代时应尽量减少死亡细胞数量。因此，应调整培养时间表，避免达到此成熟阶段。

  1. 材料准备
    1. 将ECM分装液（500 µL）置于4 °C条件下解冻，至少1 h。
    2. 将24孔板预热至37 °C。
    3. 将含有10 µM Y27632 ROCK抑制剂的酶解解离试剂在37 °C水浴中预热。
    4. 将培养基置于室温（RT）。
    5. 在无菌条件下，于生物安全柜内放置一个小冰桶。
  2. 肠道三维类器官传代
    1. 使用P1000移液器刮取附着在ECM上的类器官。在培养基中轻轻吹打混匀，并转移至含有5 mL冰上预冷DMEMc的15 mL锥形管中。
      注：每12个在24孔板中以50 µL基质胶滴培养的类器官孔需使用一个15 mL锥形管进行合并处理。
    2. 在4 °C条件下，以500 × g离心5 min收集类器官。
      注：类器官将在管底形成白色沉淀。若离心后类器官仍悬浮于ECM中，小心吸除上清液（避免触碰ECM层），用P1000移液器吹打混匀10次，然后重复离心步骤。此操作后不应再观察到明显的ECM层。
    3. 小心吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL预热的含10 µM Y27632 ROCK抑制剂的酶解解离试剂中。上下吹打10次以启动类器官解离。
    4. 在37 °C水浴中孵育5 min进行酶消化。
    5. 使用P1000移液器吹打10次，机械性破坏类器官结构。在显微镜下检查细胞悬液。
      注：目标为获得单细胞或小细胞团。若仍观察到较大类器官碎片，则重复孵育步骤（步骤4.2.4）和机械解离步骤（步骤4.2.5）。
    6. 加入4 mL冰上预冷的DMEMc。在4 °C条件下，以500 × g离心5 min。
    7. 弃去上清液，将类器官细胞沉淀重悬于1 mL DMEMc中。
    8. 按照上述步骤（步骤3.2.7至3.2.13）进行细胞计数，并将类器官细胞以每孔3000个活细胞接种至预热的24孔板中，每孔含50 µL ECM凝胶滴中。

3D 类器官的冷冻保存

  1. 准备所需体积的冻存液（每两个类器官池使用1 mL），其中包含添加了10% FBS、10% DMSO和10 µM Y27632 ROCK抑制剂的DMEMc，并置于冰上保存（最终FBS浓度为18%）。
  2. 移除待冻存孔中的培养基。
  3. 向第一个待冻存孔中加入1 mL冻存液，通过刮擦法脱离细胞外基质（ECM），并用移液枪头充分混匀。
  4. 将第一个孔中的类器官悬液转移至第二个待冻存孔中。
  5. 将两个孔的类器官混合悬液转移至冻存管中，并将冻存管放入细胞冻存盒内。
  6. 将细胞冻存盒置于-80 °C环境中保存24小时，随后将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

6. 来源于三维类器官的细胞单层培养

注意：猪类器官细胞的单层培养是在二维培养基中进行的，该培养基由用于三维类器官培养的培养液添加20%胎牛血清（FBS）组成。

  1. 材料准备
    1. 配制2D培养基，并置于室温保存。
    2. 将含有10 µM Y27632 ROCK抑制剂的酶解离试剂在37 °C水浴中预热。
  2. 培养插件的包被
    1. 对一对镊子进行灭菌处理，并将其转移至生物安全柜中。
    2. 用镊子将细胞培养插件（0.33 cm2）放入24孔板中。
    3. 配制包被溶液：将IV型胶原蛋白用冷PBS稀释至50 µg/mL，上下吹打混匀。
    4. 向每个细胞培养插件中加入150 µL稀释后的IV型胶原蛋白溶液，相当于22.7 µg/cm2。
      注意：将移液枪垂直对准可渗透膜中心缓慢加入，确保胶原溶液完全覆盖整个膜表面。
    5. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜（或至少3小时）。
  3. 将3D类器官细胞接种至细胞培养插件
    1. 按照步骤4.2.1至4.2.7所述方法制备单细胞悬液。
    2. 用1:2稀释的台盼蓝染液对细胞进行计数，并使用细胞计数仪计算接种所需体积，使每孔插件接种2.5 × 105个细胞，相当于7.6 × 105个细胞/cm2。
    3. 将所需体积的细胞悬液在4 °C条件下以500 × g离心5分钟。
    4. 离心过程中，小心吸除培养插件中的包被溶液，并在无盖条件下于通风橱中室温干燥5分钟。
    5. 离心结束后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于适量含有10 µM Y27632 ROCK抑制剂的2D培养基中。每个插件需加入含细胞的2D培养基200 µL。
    6. 将200 µL细胞悬液（含2.5 × 105个细胞）接种至已包被的可渗透膜（顶侧）表面（图4A）。
      注意：移液时应缓慢对准膜中心，保持枪头垂直。
    7. 向底层腔室（基底侧）加入500 µL含有10 µM Y27632 ROCK抑制剂的2D培养基，置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。
    8. 接种后24小时，更换顶侧和基底侧的培养基为不含Y27632 ROCK抑制剂的新鲜2D培养基。
    9. 每天更换一次2D培养基。单层细胞通常在接种后1天达到融合状态，即可用于后续实验。
      注意：跨上皮电阻（TEER）值高于空白对照（无细胞的插件）表明细胞已达到融合状态（图4B）。

7. 类器官细胞单层的免疫染色

  1. 溶液的配制
    注意：根据需要染色的孔数调整溶液的体积；每步每孔需要200 µL溶液。所有商品化产品的参考信息见材料表。
    1. 在通风橱中，将5 mL 32%的多聚甲醛（PFA）加入35 mL PBS中，配制4% PFA溶液。分装成10 mL等份，于-20 °C保存。
      注意：操作PFA时必须始终在通风橱内进行，并佩戴腈手套。
    2. 使用前，将2 µL Triton X100加入1 mL PBS中，现配0.2% Triton X100-PBS溶液。室温保存。
    3. 将100 mg牛血清白蛋白（BSA）加入1 mL PBS中，配制10% BSA-PBS溶液。室温保存。
    4. 将10 mg BSA加入1 mL PBS中，配制1% BSA-PBS溶液。室温保存。
    5. 将5 µL一抗加入995 µL 1% PBS BSA中，配制1:200稀释的一抗（occludin）溶液。将溶液置于冰上保存。
    6. 将1 µL二抗加入999 µL 1% BSA-PBS中，配制1:1,000稀释的二抗溶液。将溶液置于冰上，避光保存。
    7. 将10 µL浓度为1 mg/mL的TRITC加入990 µL PBS中，配制10 µg/mL的鬼笔环肽TRITC（phalloidin TRITC）溶液。置于冰上，避光保存。
  2. 免疫染色
    注意：除非另有说明，所有孵育步骤均在室温下进行，并在摇床（30 rpm）上缓慢振荡。免疫染色直接在细胞培养小室中进行。
    1. 移除基底侧和顶侧培养基，将培养板置于通风橱中。
    2. 用200 µL PBS在室温下洗涤单层细胞两次，每次孵育5分钟。
    3. 用200 µL 4% PFA在室温下固定细胞单层，孵育20分钟。
    4. 用200 µL PBS在室温下洗涤单层细胞两次，每次孵育5分钟。
      注意：固定和洗涤后，单层细胞可在PBS中于4 °C保存1周。
    5. 吸除PBS，加入200 µL 0.2% Triton X100-PBS进行透化处理，孵育20分钟。
    6. 用200 µL PBS在室温下洗涤单层细胞两次，每次孵育5分钟。
    7. 加入200 µL用1% BSA-PBS稀释的一抗溶液，在4 °C下于摇床上缓慢振荡孵育过夜。设置阴性对照孔，仅加入不含一抗的1% BSA-PBS。
    8. 用200 µL PBS在室温下洗涤单层细胞三次，每次孵育5分钟。
    9. 加入200 µL用1% BSA-PBS稀释的二抗溶液，在室温下避光孵育2小时。
    10. 用200 µL PBS在室温下洗涤单层细胞三次，每次孵育5分钟。
    11. 加入200 µL浓度为10 µg/mL的鬼笔环肽TRITC溶液，孵育10分钟。
    12. 用200 µL PBS在室温下洗涤单层细胞两次，每次孵育5分钟。
    13. 吸除PBS，用手术刀切割膜。
    14. 用镊子取出膜，将其放置于载玻片上，确保顶侧朝上。
    15. 直接在膜上滴加15 µL含DAPI（1:1,000稀释）的封片剂，盖上盖玻片并封片。
    16. 避光保存于4 °C，待成像时使用。

结果

按照上述方案，从猪肠道中获取上皮隐窝，并在液氮中冷冻保存以长期储存图1 和 图2A）。解冻后，将隐窝干细胞接种于细胞外基质（ECM）中（图2B）。由于细胞外基质（ECM）中隐窝结构的解体，此步骤后通常会失去隐窝结构。类器官可在3-4天内被观察到，随后迅速生长并发育出出芽结构。图2B）。我们在解冻冻存的隐窝后，成功获得了类器官 >80% 的尝试成功率。解冻后约 10 天（根据类器官的生长速率），进行类器官传代以扩增培养图3）。类器官在传代后生长速度加快，并呈现多种形态，部分为囊状，多数为出芽状类器官。为了最佳地维持培养，用于传代的类器官必须具有清晰且空的腔体以及界限分明的边缘（绿色箭头所示示例），腔内无黑色碎片（红色箭头所示），如成熟类器官中所观察到的那样。图3我们发现，传代后约第6天开始出现黑色细胞碎片的聚集。因此，建议在传代后第4-5天进行类器官的传代或冻存。

类器官的成熟阶段也是获得单层细胞的重要因素。成熟度过高的类器官（以腔内出现黑色细胞碎片为标志）不适合用于接种单层细胞。我们通常在传代后第4天对三维类器官进行解离，以收集用于二维培养的细胞。接种一个含2.5 × 105个细胞的培养小室，大约需要1至3个来自三维类器官培养的孔，这些孔中的类器官以每50 µL基底膜基质（ECM）滴加3,000个细胞的密度进行培养。细胞在1天内贴壁并形成完全汇合的单层（图4A），这可通过约700 Ω·cm2的高跨上皮电阻（TEER）值证实（Figure 4B）。然而，在此早期时间点，由于细胞分化程度较低，细胞边界在明场显微镜下难以观察。TEER值在随后3天内保持较高水平（Figure 4B）。

肌动蛋白染色显示，在三维类器官中，上皮细胞的顶端朝向腔内（图5A）。接种于培养插入物中的类器官细胞形成汇合的单层上皮细胞，其顶端朝向上室（图4B、C）。闭合蛋白染色揭示了在三维类器官及细胞单层中，上皮细胞顶端存在紧密连接（图5A–C）。

猪肠道3D类器官示意图：分离、培养、冷冻保存及细胞单层构建。
图1：猪肠道3D类器官及由类器官衍生的细胞单层培养方法的示意图。从仔猪肠道中分离上皮隐窝。这些隐窝可 i) 直接用于培养3D类器官，或 ii) 冷冻后储存在液氮中的生物样本库中。冷冻保存的隐窝可解冻后用于培养3D类器官。3D类器官培养物可通过连续传代维持，或再次冷冻并储存在生物样本库中。可将3D类器官培养物用于建立细胞单层，以便接触细胞的顶侧并研究上皮屏障功能。请点击此处查看此图的放大版本。

隐窝类器官生长进程；显微镜图像；分离的隐窝；第4-10天观察
图2：由冻存的肠上皮隐窝培养猪小肠三维类器官。（A）新分离的空肠隐窝的代表性显微图像。（B）空肠隐窝解冻后获得的三维类器官的代表性显微图像。类器官在48孔板中以25 µL ECM胶滴形式进行培养。图中显示了接种后第4、7、8、9和10天的三维类器官图像。比例尺代表500 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

4天内的细胞生长阶段；显微镜图像；细胞形态学研究，培养时间线比较。
图3：冻存肠上皮隐窝来源的猪肠道三维类器官在首次传代后的形态学特征。 代表性显微图像显示了自冻存的空肠隐窝分离并在首次传代后第4天至第7天期间类器官的发育情况。绿色箭头指示适合传代或单层接种的清晰类器官。红色箭头指示已成熟的类器官，不适合进行分传或单层接种；因此，应在出现此类形态前使用相应孔板。标尺为500 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

使用TEER结果进行细胞生长分析；4天内的显微镜图像；图表显示TEER随时间变化。
图4：源自猪小肠3D类器官的细胞单层特性。（A）培养3天内单层细胞形态的代表性显微图像。将空肠类器官细胞以每0.33 cm2细胞培养插件2.5 × 105个细胞的密度接种于涂有50 ng/mL IV型胶原蛋白的插件中。比例尺为500 µm。（B）类器官细胞单层在3天内的跨上皮电阻（TEER）值。由连线连接的点代表同一孔在不同时间点的测量值。请点击此处查看该图的放大版本。

用于蛋白质定位研究的上皮细胞中DNA、肌动蛋白和闭合蛋白的共聚焦显微镜图像。
图5：猪空肠类器官在3D或2D条件下培养的成像结果。 共聚焦显微镜成像显示（A）类器官在传代后第5天的3D结构，以及（B、C）接种后第3天的类器官单层细胞（B：XZ截面；C：XY截面）。DNA（蓝色）用DAPI染色，肌动蛋白（红色）用鬼笔环肽染色，闭合蛋白（绿色）用多克隆抗体染色。白色箭头指示定位于紧密连接处的闭合蛋白。比例尺为20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本方案描述了一种用于冷冻保存仔猪肠道上皮隐窝的方法，以实现3D类器官的长期储存及后续培养。该方案采用含有DMSO、FBS、Y27632 ROCK抑制剂、DMEM和抗生素的冷冻保存液。另一项针对猪的研究曾使用类似的冷冻液（不含ROCK抑制剂）冻存隐窝并成功获得类器官15。本方案中加入Y27632 ROCK抑制剂的目的是防止细胞凋亡并维持干细胞库，因为在解冻后上皮隐窝细胞会发生解离，可能导致细胞死亡（即“失巢凋亡”）27,28。有趣的是，已有研究从仅含DMEM和DMSO的培养基中冷冻保存的马肠上皮隐窝成功获得了肠类器官16；然而，这种简单方法尚未在猪上皮隐窝中进行测试。此外，已有其他方法报道可直接从冷冻组织或活检样本（而非上皮隐窝）培养人和猪的类器官4,17。该方法的优势在于可直接对肠道组织进行冷冻保存，而无需先行完成隐窝分离操作——后者耗时且需要特定实验设备。当组织采集地点远离实验室时，此方法尤为便利。然而，在屠宰后立即分离隐窝的情况下，可处理较大肠段以获得大量隐窝，而从小块冷冻组织片段起始则无法达到相同产量。在上皮隐窝解冻后，类器官通常于接种后3–4天开始出现，并在10天后进行传代 。相较于使用新鲜上皮隐窝起始培养的情况，其生长速度较慢——后者通常在接种后第1天即可观察到类器官形成，且一般在第5天左右即可传代11。Khalil等人也报道了从冷冻隐窝起始培养猪肠类器官时存在生长延迟现象15，提示干细胞可能需要一定时间恢复其增殖能力。我们还发现，从冷冻隐窝起始所获得的类器官数量低于新鲜隐窝，这可能是由于冷冻过程中部分干细胞死亡所致。在部分隐窝解冻尝试中（<20%），未能成功获得类器官，可能原因是冷冻保存操作未达最佳状态（例如，隐窝分离后延迟冷冻超过1小时）。因此，我们建议在隐窝计数前始终将其置于冰上，并尽快完成冷冻。

对于3D类器官，我们选择使用一种针对人类配制的商用类器官培养基。事实上，先前已有报道称，猪肠道类器官在此培养基中能够高效生长8,11,14,19,25,26,29,30。该培养基的优势在于即用型设计，并且同一批次内生长因子的浓度标准化。然而，这种培养基成本较高，其成分未公开，因此无法对其组成进行调节。相比之下，其他研究采用含有药理学抑制剂、重组生长因子和/或条件培养基的定制化培养基来培养猪肠道类器官5,6,7,21。尽管这种方法灵活性高且成本较低，但条件培养基的制备过程耗时，并且由于条件培养基中生长因子浓度可能存在差异，可能导致实验重复性不佳。因此，每批次条件培养基的质量应通过检测类器官生长情况或标志基因表达水平进行验证31。

一项研究表明，使用本文所述的相同商业类器官培养基培养的猪空肠类器官，其生长速度更快，且分化程度似乎低于使用含有重组生长因子和/或条件培养基的培养基培养的肠类器官23。较高的增殖状态有利于三维类器官的培养，但可能需要诱导其分化，以更真实地模拟肠道的生理特征。在本实验方案中，对三维类器官进行传代时，细胞被完全解离后进行计数，从而可精确控制接种至细胞外基质（ECM）中的细胞数量。这提高了类器官表型的可重复性，因为类器官的表型受其密度影响显著。此外，细胞计数可避免获得过低密度或过度拥挤的培养物，从而无需频繁调整培养周期。大多数其他研究采用未完全解离为单细胞的类器官片段，并以稀释比例进行传代。该方法更为简便，但可能因类器官培养密度不同而引入实验变异性。

对于单层培养，将类器官细胞接种到预先包被有薄层细胞外基质（ECM）的培养插件中，该基质允许细胞贴壁，但避免类器官形成三维结构。本方案采用IV型胶原蛋白作为ECM蛋白，如先前在猪中所描述的那样23。其他关于猪类器官单层培养的研究则使用了与本研究中相同的肿瘤来源ECM来培养三维类器官6,8,9,21,25,30。使用胶原蛋白的优势在于能够以完全明确的组分标准化蛋白浓度，而肿瘤来源ECM则无法做到这一点。成功进行单层细胞培养的关键步骤之一是注意前体三维类器官的形态特征，其应具有清晰的边缘和无黑色碎片的空腔。事实上，成熟度高且增殖率低的类器官不适合作为二维培养的细胞来源。因此，将三维类器官解离为单个细胞的时机对这一步骤的成功至关重要。

单细胞来源的二维单层培养可标准化接种细胞数量，而若从类器官片段开始培养（如某些其他方法所采用），则较难实现细胞数量的标准化。我们接种了7.6 x 105 每平方厘米细胞数2，这一数值相较于大多数其他研究较高21,22,23 在细胞密度较低（范围为 0.25 x 10）的猪中5 每平方厘米细胞数2 至 1.78 x 105 每平方厘米细胞数2大量类器官细胞的需求是本方案的一个局限性，但这种方法使我们能够在1天后快速获得一个完全覆盖培养插件的融合单层。相比之下，Vermeire 等人23 4-7 天后达到汇合，接种细胞密度较低（从 0.25 x 10）5 细胞/厘米²2 至 0.4 × 105 细胞/厘米²2一些研究还使用了未完全覆盖培养表面的猪类器官细胞单层进行病毒感染实验8,30在这些条件下，上皮细胞的顶侧可接受处理，但如果目的是研究营养吸收或上皮通透性，则需要完全汇合的单层细胞。

对于类器官细胞单层培养，采用一种商业化的类器官培养基，并添加20%胎牛血清（FBS），该方案基于近期一项关于牛肠类器官来源单层细胞的研究32。在我们的实验中，添加20% FBS对于获得完全汇合的单层细胞是必需的，这可能与细胞对高浓度生长因子的需求有关。相反，其他使用相同商业培养基的研究在未额外添加FBS的情况下建立了单层细胞8,25,30，但未能达到完全汇合状态。此外，也有研究在定制培养基中添加20% FBS用于猪类器官细胞单层的培养21,22。在我们的实验中，接种后1天跨上皮电阻（TEER）即达到较高水平（约700 Ω·cm2），并在第3天仍维持在高水平（约1,500 Ω·cm2）；这与紧密连接的形成一致，可通过闭合蛋白（occludin）的表达得以证实。Van der Hee 等人对空肠类器官细胞单层的研究也获得了在72小时内相似的TEER值21，并进一步证明通过每日更换培养基，单层细胞可维持培养至第12–15天。相比之下，其他研究报道猪类器官细胞单层的TEER值显著较低（约200 Ω·cm2）6,22。这些研究间的差异可能与所研究的肠道节段不同，或与影响上皮细胞分化的培养基成分有关。

综上所述，上述从冻存的猪肠上皮隐窝培养三维类器官的方案有助于优化实验流程，减少了对活体动物新鲜组织的需求。我们还阐述了如何在不到3天的时间内建立源自猪类器官的完全汇合的细胞单层。因此，本方案可为从事兽医学或生物医学研究的科研人员提供有价值的技术资源。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由 Institut Carnot France Futur Elevage 资助（"OrganoPig" 项目）以及 INRAE HOLOFLUX（"全色素" 项目）。作者感谢 Genotoul 核心设施（TRI）。我们感谢图卢兹国立农业研究院（INRAE）基因与生理学研究所（GenPhySE）的 Christelle Knudsen  仔细校对。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTA，pH 8.0赛默飞世尔科技AM9260G室温保存。
15 mL 一次性离心管Sarstedt62.554.502
24孔细胞培养板 康宁003526
48孔细胞培养板 康宁003548
50 mL 聚丙烯锥形管Falcon352070
牛血清白蛋白（BSA）EuromedexA60034°C 下保存 °C.
Centrifuge Universal 320 RHettich1406
人胎盘IV型胶原蛋白SigmaC5533根据制造商的建议，用乙酸配制浓度为 1 mg/mL 的储备液。分装（500 µL）并于 -20 保存 °C.
CoolCell LX 细胞冻存容器康宁432003用于类器官和隐窝的冷冻保存。
Countess 3 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技16842556
盖玻片，22 mm × 50 mmVWR630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL清晰的线条 390706用于类器官和隐窝的低温保存。
DAPIInvitrogenD1306根据制造商说明，用水配制5 mg/mL的储备液’s 的建议。分装（20 µL）并于 -20 保存 °C
二硫苏糖醇（DTT） 默克101977770014°C 下保存 °C.
DMEM，高糖，GlutaMAX添加剂，丙酮酸盐赛默飞世尔科技319660474°C 下保存 °C.
DMSO（二甲基亚砜）康宁25-950-CQC室温保存。
Epredia Superfrost Plus 防脱载玻片VWR631-9483
胎牛血清（FBS）赛默飞世尔科技10270-106将5 mL等分试样于-20℃保存 °C.
Fisherbrand 无菌细胞筛赛默飞世尔科技22363549用于隐窝分离。
固定倾角三维平台旋转器 VWR 97025-564 用于免疫染色方案中的孵育步骤。
Gibco PBS，pH 7.4赛默飞世尔科技100100154°C 下保存 °C.
Gibco TrypLE Express 酶（1 倍浓度），酚红赛默飞世尔科技12605-010酶解离试剂。室温保存。
山羊抗兔IgG，Alexa Fluor 488赛默飞世尔科技A-11008二抗。4℃保存。 °C. 工作稀释度 1:1000。
IntestiCult 类器官生长培养基（人源）干细胞技术6010类器官培养基。-20℃保存 °C. 将基础培养基和类器官补充剂在室温下解冻并混合（1:1），将混合液储存于4℃ °最多可于 C 保存 1 周。
带透明PET膜的Falcon 24孔板插件康宁353095
倒置显微镜尼康 Eclipse TS2
Matrigel 基底膜基质康宁354234肿瘤来源的细胞外基质用于类器官的三维培养。Matrigel 在室温下发生聚合。使用预冷的枪头吸取 Matrigel。准备 500 µL 等分试样，于 -20 保存 °C.
含DAPI的荧光封片剂VectashieldH1250 4°C 保存 °C.
紧密连接蛋白occludin多克隆抗体赛默飞世尔科技71-1500一抗。于 -20 ℃ 保存 °C. 工作稀释度 1:200。
32% 多聚甲醛电子显微镜科学15714在通风橱中，将 5 mL 的 32% 多聚甲醛（PFA）加入 35 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液。分装为每管 10 mL，于 -20 ℃ 保存 °C.
青霉素-链霉素SigmaP4333抗菌。将5 mL等分试样于-20℃保存 °C.
鬼笔环肽 TRITCSigmaP1951用于肌动蛋白染色的探针。1 mg/mL 储存液。4℃保存。 °C.
PrimocinInvivoGenant-pm-05用于原代细胞的抗菌剂，可作用于细菌、支原体和真菌。-20℃保存 °C.
ROCK抑制剂（Y27632）ATCCACS-3030用于维持干细胞。根据制造商的建议，用无菌水配制10 mM的储存液，并将分装（50 µL）于 -20 °C.
旋转摇床混合 XL清晰的线条 062646CL用于隐窝分离。
Stripette 血清移液管 10 mL康宁4488
组织培养皿 TPP93100
Triton X100Sigma8787室温保存。
0.4% 台盼蓝染液 赛默飞世尔科技T10282室温保存。
真空系统 VacusipIntegra159000用于移除类器官孔中的培养基。

参考文献

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).
  5. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465(2013).
  6. Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368(2021).
  7. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  8. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682(2019).
  9. vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375(2020).
  10. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
  11. Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031(2022).
  12. Zhu, M., Qin, Y. -C., Gao, C. -Q., Yan, H. -C., Wang, X. -Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  13. Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
  14. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  15. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
  16. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
  17. Tsai, Y. -H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  18. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  19. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  20. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  21. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  22. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143(2021).
  23. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94(2021).
  24. Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821(2020).
  25. Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011(2020).
  26. Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
  29. Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196(2018).
  30. Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394(2019).
  31. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430(2019).
  32. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).

重印与许可

探索更多文章

猪肠道类器官类器官冷冻保存屏障功能宿主-微生物相互作用跨上皮电阻紧密连接营养物质转运类器官传代
从冷冻保存的肠上皮隐窝培养仔猪肠道三维类器官及建立单层细胞模型
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。