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同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

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DOI：

10.3791/64918

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2023年3月24日

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1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。

摘要

很少有技术能够同时评估单个细胞的表型和命运。目前用于表征表型的大多数方案虽然能够生成大量数据，但需要破坏目标细胞，从而无法进一步评估其功能命运。因此，对于造血等具有异质性的生物分化系统，其动态过程难以准确描述。基于细胞分裂示踪染料，我们进一步开发了一种实验方案，可同时确定大量单个造血祖细胞的亲缘关系、分裂次数和分化状态。该方案能够实现对 离体 小鼠和人类造血祖细胞的分化潜能，这些细胞分离自多种生物来源。此外，由于该方法基于流式细胞术并仅需有限数量的试剂，因此能够以相对低廉的成本在单细胞水平上快速生成大量数据。我们还提供了单细胞分析的分析流程，并结合了可靠的统计学框架。由于该方案可在单细胞水平上关联细胞分裂与分化过程，因此可用于定量评估对称性与不对称性命运决定、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所需的分裂次数。总体而言，该方案可用于旨在从单细胞视角揭示不同造血祖细胞之间生物学差异的实验设计。

引言

过去十年见证了单细胞技术在细胞与分子生物学领域的全球性普及。继单细胞基因组学1,2之后，如今已能够利用每年不断涌现的新型单细胞组学技术，对单个细胞的多种组分（如DNA、RNA、蛋白质）进行研究。这些技术在免疫学、神经生物学、肿瘤学等领域，无论是使用人类细胞还是模式生物细胞，都为新旧科学问题提供了新的见解3。通过揭示个体细胞之间的差异，单细胞组学推动了造血过程新模型的建立，该模型聚焦于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的异质性，摒弃了传统上将细胞群体视为离散且均一的模型4,5。

所有组学技术为数不多的缺点之一是会破坏目标细胞，从而无法评估该细胞的功能活性。相比之下，其他单细胞方法，如单细胞移植实验和谱系示踪技术，则可通过追踪单个细胞的命运来反映祖先细胞的功能状态。 体内6,7谱系示踪技术涉及利用可遗传的遗传标记对目标细胞进行标记7 或荧光标记8,9，从而能够同时追踪多个单细胞的命运。然而，对起始细胞的表征通常仅限于少数几个参数，例如通过流式细胞术检测的少数表面蛋白的表达水平10此外，单细胞谱系示踪技术通常需要繁琐的细胞标记检测过程 通过 DNA/RNA测序或成像。尤其是最后一点限制了单次实验中可检测的条件数量。

另一类用于研究单个细胞功能的方法是单个造血干细胞和祖细胞（HSPC）的ex vivo细胞培养系统。这类实验操作简便，是公认的金标准检测方法，其过程包括将单个细胞分选至96孔细胞培养板中，经过培养后，通常通过流式细胞术或形态学分析来鉴定子代细胞的表型。这些检测方法主要用于表征HSPC在体外培养2-3周后向成熟细胞的长期分化能力11,12。此外，这些方法也被用于尝试在ex vivo条件下维持和扩增HSPC13,14,15,16,17,18，有望为人类干细胞移植带来临床应用价值19。最后，这些方法还被用于通过短期培养研究HSPC的早期命运决定20，但此类培养产生的细胞数量较少，是其主要局限性。上述各类ex vivo检测方法的一个缺点是只能部分反映in vivo的复杂性；尽管如此，它们仍是目前为数不多可用于研究人类HSPC分化的实验手段之一。

现有单细胞方法（单细胞组学、谱系示踪和 离体 准确检测细胞分裂是研究造血干祖细胞（HSPC）动态时需要考虑的一个关键参数21一种评估分裂次数的简单方法 通过 流式细胞术是利用可溶性 "蛋白质染料"，类似于5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）22这些分裂染料会扩散至染色细胞的胞质内，在每次细胞分裂时被稀释一半，并平均分配至两个子代细胞，从而可追踪多达10次细胞分裂。通过联合使用多种分裂染料，可在同一孔中接种多个独立的前体细胞，因为每种染料均可独立区分各自的子代细胞。这一原理即为细胞染料用于多重克隆及分裂追踪技术的基础，最早应用于小鼠淋巴细胞。23,24.

在此，我们介绍了用于小鼠和人类造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的MultiGen检测方法的开发。该方法可同时对大量单细胞进行检测，评估其分化潜能、分裂能力及谱系亲缘关系。 离体该高通量、操作简便且成本低廉的检测方法可同时测量细胞表型、细胞分裂次数以及孔内细胞之间的亲缘关系和克隆关联性。可用于定量评估命运决定的对称性与不对称性、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所需的分裂次数。本实验方案需要配备平板读取功能的荧光激活细胞分选仪（FACS）和流式细胞仪，以及进行细胞培养所需的常规设备。除针对人HSPC执行该检测的技术流程外，我们还提供了详细的分析框架，包括评估与细胞家族概念相关的细胞特性所必需的统计检验方法。25该方案已成功用于描述小鼠HSPC区室26,27.

以下方案以磁珠富集的CD34+细胞作为起始材料28。通过该方法，可高效地对来自不同血液来源（例如脐带血、骨髓、外周血）的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行染色和分离。注意不要丢弃CD34-组分，因其将在本方案中用于设置多种实验对照。所述的细胞数量和体积可根据实验流程和实际需求进行相应放大或缩小。同样，通过调整细胞分选和流式细胞术步骤中所使用的抗体，该方案也可适用于不同类型前体细胞的研究。

方案

以下实验方案使用去身份识别的脐带血作为造血干细胞和祖细胞（HSPC）来源，脐带血的采集遵循圣路易医院脐带血生物样本库指南（授权号 AC-2016-2759）以及《赫尔辛基宣言》的规定。

注意：在开始之前，请确保本方案所需的所有试剂和设备均已备齐，具体请参见材料表及方案中提及的内容。相关试剂应新鲜配制，除非明确说明，否则不应储存。

1. 细胞染料染色

注意：本节描述使用四种不同组合的CFSE与紫染料（CTV）细胞分裂染料进行染色。所有离心管需同时处理，即使未添加细胞染料溶液亦然。所有步骤均需在无菌条件下操作，以便后续进行细胞培养。所需时间：约100分钟。

  1. 根据磁性分选方案处理脐带血单位29确保获得两个组分：大量CD34- 组分以及较小的CD34+ 组分。将两个管在300 x g下离心5分钟 g吸除上清液，避免扰动沉淀。
  2. 对于CD34+ 组分，用不含胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）重悬至1 mL。使用血细胞计数板对细胞进行计数；细胞密度不应高于3 x 106 个/mL。如果出现这种情况，应相应调整体积。对于CD34- 组分，用不含FBS的DMEM重悬，并调整体积至最多6 x 106 cells/mL
  3. 分装250 µL CD34+ 分装至四个15 mL聚丙烯管中。将试管标记如下：CD34+/CF（仅CFSE）、CD34+/CV（CFSE高 CTV低），CD34+/VC（CFSE_low CTV_high）和 CD34+/VI（CTV_high）。取250 µL的CD34- 分装到另外四个15 mL聚丙烯管中。将这些管子标记如下：CD34-/CF（仅CFSE）、CD34-/CV（CFSE_high CTV_low），CD34-/VC（CFSE_low CTV_high）和 CD34-/VI（CTV_high）。从CD34中剩余的细胞- 可弃去该组分。
  4. 配制两种CFSE溶液，分别命名为CFSE_high和CFSE_low。对于CFSE_high（10 µM），将1.1 mL不含FBS的DMEM与2.2 µL CFSE储备液（5 mM）混合。对于CFSE_low（5 µM），将550 µL不含FBS的DMEM与0.55 µL CFSE储备液（5 mM）混合。
  5. 向 CF 和 CV 管中各加入 250 µL CFSE_high 溶液，向 VC 管中加入 250 µL CFSE_low 溶液，向 VI 管中加入 250 µL 不含 FBS 的 DMEM。为确保细胞悬液与细胞染料充分混合，将离心管倾斜近 90 度，沿管壁加入 CFSE 溶液。随后将离心管垂直放置，轻轻颠倒混匀，并用移液器吹打三至四次，以确保 CFSE 溶液与重悬细胞迅速混合。在 37 °C 下准确孵育 8 分钟。
  6. 孵育后，加入5 mL DMEM + 10% FBS。将试管置于37 °C环境中5分钟。
  7. 将离心管在300 × g下离心5分钟 g. 去除上清液 通过 用5 mL 1×磷酸盐缓冲液/乙二胺四乙酸（PBS 1×/EDTA）重悬沉淀，注意吸液时勿扰动沉淀；再次于300 × g离心5分钟 g弃去上清液，注意不要扰动沉淀，将细胞沉淀重悬于250 µL 1x PBS/EDTA中。
  8. 配制两种CTV溶液，分别命名为CTV_high和CTV_low。对于CTV_high（10 µM），将1.1 mL的PBS 1x/EDTA与2.2 µL的CTV储备液（5 mM）混合。对于CTV_low（5 µM），将550 µL的PBS 1x/EDTA与0.55 µL的CTV储备液（5 mM）混合。
  9. 向 VC 和 VI 管中各加入 250 µL CTV_high 溶液，向 CV 管中加入 250 µL CTV_low 溶液，向 CF 管中加入 250 µL 1x PBS/EDTA。操作方法同步骤 1.5 所述。精确在 37 °C 孵育 8 分钟。
  10. 孵育后，加入5 mL DMEM + 10% FBS，37 °C孵育5 min。
  11. 将离心管以300 x g离心5分钟 g，弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后用 5 mL 1x PBS/EDTA 洗涤沉淀。再次以 300 x g 离心 5 分钟 g.
  12. 弃去上清液，避免扰动沉淀物，重悬 CD34- 1× PBS/EDTA 中的组分，终浓度为 1.5 × 106 细胞/mL。重悬CD34+ 在40 µL染色缓冲液中重悬细胞，然后转移至1.5 mL离心管中。

2. 抗体染色

注意：抗体染色可根据实验需求进行定制。仅 CD34+ 组分进行抗体染色；CD34- 组分则作为细胞分裂染料组合（CV、VC、CF 和 VI 组分）的单染对照。以下方案专为检测四种类型的造血干细胞和祖细胞（HSPC）而设计：造血干细胞（HSC）、多能祖细胞（MPP）、淋巴系偏向性多能祖细胞（LMPP）以及造血祖细胞（HPC）12。但本文仅展示 HSC 和 MPP 的鉴定方法。所需时间：75 分钟。

  1. 使用补偿微珠制备用于表面染色的单染样本。将阴性微珠与免疫球蛋白G（IgG）微珠按1:1比例混合，总体积为20 µL乘以表面标记物的数量（例如，若染色方案包含六种抗体，则总体积为120 µL）。
  2. 将20 µL磁珠分别加入每个标记物对应的1.5 mL离心管中。向各对应管中加入与抗体稀释倍数相对应体积的抗体（例如，若稀释倍数为1:20，则加入1 µL）。
  3. 为了染色CD34+ 细胞，制备抗体主混合液12，基于 表1将抗体混合至一个0.5 mL离心管中。从抗体主混合液中取7 µL，分别加入四个CD34+条件样本中。
  4. 孵育补偿微珠与 CD34+ 4°C 下孵育至少 30 分钟
    注意：孵育时间必须根据所用染色抗体的技术参数进行调整。
  5. 孵育期间，使用多通道移液器向96孔圆底板的每个孔中加入100 µL细胞培养基，用于后续分选。
    注意：H8-H12 孔保持空置。
  6. 标记5 mL聚丙烯管，用于表面染色对照（5管，使用微珠）和细胞分裂染料对照（4管，使用CD34- 组分）以及 CD34+ 样本（4）
  7. 孵育结束后，用1 mL染色缓冲液洗涤细胞和磁珠，将全部液体转移至5 mL聚丙烯管中，以300 × g离心5分钟。 g然后小心吸走上清液，切勿扰动沉淀。
  8. 将细胞重悬于染色缓冲液中， beads 和 CD34 各使用约 500 µL+ 细胞，以及1 mL用于CD34- 管

表1：细胞分选实验中抗体预混液的配制模板。 请点击此处下载该表格。

3. 细胞分选

注意：分选的细胞数量可能根据可用细胞的总量而有所不同。本方案中提供了每个对照的最低细胞数量。所需时间（单个培养板）：100 分钟。

  1. 打开模板实验或设置新实验。创建一个样本和多个试管，每个条件对应一个试管。
  2. 按照图1中详述的设门策略，创建六个散点图。首先，在FSC-A/SSC-A散点图上显示细胞，双击多边形设门工具，选择侧向散射较低的细胞群体（图1A）。在下一个散点图（FSC-A/FSC-H）中，右键单击图谱，从下拉菜单中点击选择“Cells”门。使用相同的设门工具，在两轴之间的对角线上选择一个紧密的细胞群体（图1B）。
  3. 在第三个散点图（APC vs. FSC-H）中，显示“Single Cells”群体，并对APC谱系（Lin）不表达的细胞进行设门（图1C）。在第四个图（CFSE vs. CTV）中，显示“Lin-”群体，并创建四个独立的门，每个染料组合对应一个门（图1D）。
    注意：这些门必须设得较紧，以仅选择少量染色均一的细胞。
  4. 使用第五和第六个图（APC-Cy7 vs. BV650 和 PE-Cy7 vs. PE）来识别目标前体细胞。在第五个图中，宽泛地圈选CD34+CD38-群体和CD34+CD38+群体（图1E）。然后在第六个图中选择CD34+CD38-群体，并根据图1F绘制三个门。
  5. 运行含有补偿微珠的单染试管，点击Acquire按钮。通过Parameters下拉菜单调整光电倍增管（PMT）电压，特别是细胞分裂染料的电压（在双指数尺度上介于104至105之间）。
  6. 根据用于分选的抗体组合，使用Compensation选项卡优化补偿矩阵。点击Record按钮，在微珠门中至少记录5,000个事件。
  7. 运行CD34-组分，并再次检查补偿矩阵。Record单细胞门中至少10,000个事件。
  8. 运行CD34+组分，在单细胞门中至少记录5,000个事件。调整每个染料组合的门，设置紧密的门以选择均一的细胞群体（图1D）。类似地，调整设门以选择HSCs和MPPs。
  9. 当分析完成后且所有试管均已记录，执行标准Aria校准以在96孔板上进行分选，随后将板放入合适的支架中。建议对板进行冷却处理。
  10. 根据表2所示方案，使用实验sort layout准备板式分选模板。“CD34-”命名的孔包含5,000–10,000个细胞，基于CF/CV/VC/VI门进行分选。“Bulk”孔包含至少500个细胞，基于CD34+CD38-门进行分选。最后，单细胞孔每孔仅包含每种细胞分裂染料组合的一个事件，即每孔共四个事件。
    注意：“Bulk”群体可根据特定前体细胞亚群进行调整；分选细胞数不得少于500个。
  11. 进行分选时，按顺序操作，完成每种细胞分裂染料组合后再进入下一个。例如，首先以yield纯度模式分选CD34- CF。点击Acquire按钮，然后点击Sort按钮。
  12. 完成CD34-分选后，插入CF CD34+试管。Acquire后点击Sort按钮，确保已选择0/16/0作为纯度等级。最后，以single-cell纯度模式进行目标细胞的分选，每孔一个细胞，并确保勾选Index Sorting选项。
  13. 进入下一个细胞分裂染料组合，重复相同顺序。作为参考，表2提供了一个已分选板的示例。
    注意：索引分选功能会为每种分选条件生成单独的文件。
  14. 分选结束后，将文件导出为.fcs 3.0格式。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中。根据实验设计，细胞需培养多天，至少24 h26。

表2：基于后续流式细胞术分析特定要求的细胞分选96孔板模板。 请点击此处下载该表格。

4. 细胞分选数据分析

注意：在进行后续操作之前，必须通过流式细胞术（FACS）数据分析来验证细胞分选的质量。此步骤的主要结果是生成一个电子表格，其中包含每个已分选单个细胞的标志物强度数据。

  1. 在分析软件中上传 .fcs 3.0 文件。
  2. 使用实际分选前记录的单染色文件，验证细胞分选过程中所用的补偿设置。
  3. 根据对应不同群体的文件设定修订后的设门策略，并将这些门复制粘贴到索引分选文件中。
  4. 检查索引分选的细胞是否落入设定的门内。若存在分选细胞被错误设门的情况，可通过导出索引分选期间记录的孔板坐标进行识别，并在后续分析中予以剔除。
  5. 导出索引分选文件中的事件作为补偿后的参数，选择“缩放数值”和“补偿参数”选项，将其导出为 .csv 文件。这些文件应导出至名为“导出文件”的文件夹中。
  6. 使用补充文件1中的脚本将所有文件合并为一个 .csv 文件。通过“setwd”函数设置正确的路径。该脚本的输出结果为一个电子表格，包含所有不同设门的事件及其各参数的相对强度。

培养后抗体染色

注意：本实验步骤需在无菌条件下操作；多种试剂与前期步骤共用，必须保持无菌。进行流式细胞术分析时，使用配备微孔板读取功能的流式细胞仪。该配置可直接在组织培养板中完成染色，通过减少移液和离心步骤，将细胞损失降至最低。使用补偿微珠制备表面标志物的单色染色，但 A1-A4 孔除外，这些孔已包含 CF/CV/VC/VI 颜色的单染对照，且已存在于 96 孔板中。根据细胞染料分选的群体可用于确定细胞分裂次数及整体设门策略。所需时间：120 分钟。

  1. 在开始实验方案之前，使用倒置显微镜观察培养板，标记出含有至少一个细胞的孔。此步骤有助于优化染色过程中抗体的使用量，并加快实验进程。
  2. 根据说明书配制抗体预混液， 表3由于涉及大量移液操作，表格中已考虑移液带来的技术误差，并额外增加5%的体积。表中所述抗体可用于表征人脐血样本中的多种造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。12.
  3. 将培养板在300 × g条件下离心5分钟 g在生物安全柜中迅速将培养板倒置在纸巾上方，以去除上清液。
  4. 向 A1-A4 孔中各加入 8 µL 染色缓冲液。向其余各孔中各加入 8 µL 混合液。
  5. 将阴性磁珠与IgG补偿磁珠按1:1比例混合，总体积为120 µL。每种标志物分别取20 µL分装至一个1.5 mL离心管中。加入对应稀释倍数的抗体体积（例如，若稀释倍数为1:20，则加入1 µL）。
    注意：根据染色所用标记物的数量调整总体积（例如，若染色方案包含五种抗体，则总体积为 100 µL）。
  6. 将培养板和单染补偿对照置于 +4 °C 孵育，至少 30 分钟。
    注意：孵育时间必须根据所用染色抗体的技术参数进行调整。
  7. 用1 mL染色缓冲液洗涤磁珠。将全部体积转移至先前已标记的5 mL聚丙烯管中。以300 × g离心5分钟。 g，然后移除上清液 通过 吸取
  8. 用多通道移液器向每孔加入 100 µL 染色缓冲液，洗涤细胞。将板在 300 x g 孵育5分钟，然后在生物安全柜中迅速将培养板倒置于纸巾上，以去除上清液。
  9. 用多通道移液器将细胞重悬于85 µL染色缓冲液中。
  10. 在流式细胞仪上开始分析（采集模式），使用专用模板并点击 定制该定制模板考虑了96孔圆底板的技术特性，特别是每个孔的尺寸（直径、深度和厚度）。探针必须到达孔底，因此应将其置于A1和H12孔的正中心。
  11. 选择后 荧光基团 从软件提供的列表中选择感兴趣的目标，设置 平板设置 根据表2的孔板模板，校正含有至少一个细胞的孔的数量。
  12. 选择 100 µL 作为 采集体积限制. 勾选 振荡 选项。设置 采集速率 至多1 µL/s，较低速度可提高每孔分析的总体积。
  13. 向 H8-H12 孔中加入适当的清洗和洗涤溶液。模板在 表2 特别留空H8-H12孔，因为流式细胞仪在分析结束时需要运行一系列洗涤条件。
    注意：此步骤根据所用流式细胞仪的具体特性进行调整。
  14. 在图示与门控部分，首先使用FSC-A/SSC-A散点图设置单细胞门，然后使用FSC-H/FSC-A散点图。创建一个 直方图 针对每个目标标志物。
  15. 确认设置后，继续进行下一步 分析 先分析单染色样本， 记录 不少于 5,000 个事件（最佳范围：5,000–15,000 个事件），补偿微珠和 CD34 染色组分均需如此。如有需要，调整电压。
  16. 单染样本全部记录完毕后，即可通过点击开始实际的采集过程 采集 功能。

表3：用于流式细胞术实验的抗体预混液，专门用于从人脐带血中鉴定造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。 请点击此处下载该表格。

6. 培养后流式细胞术数据分析

注意：所述的数据分析针对材料表中提到的软件。主要输出结果是生成一个电子表格，其中包含每个被分析细胞的表面标志物强度、分裂次数以及亲缘关系信息。本实验方案的此部分包含一个用R语言编写的脚本，该脚本对于生成最终分析电子表格的工作流程是必需的。

  1. 导出 将流式细胞仪的文件保存为 .fcs 文件，上传至分析软件，并将其分组为“单染色”、“群体”和“单细胞”。
  2. 使用单染色文件制备补偿矩阵，并将其应用于其他两组 拖放.
    注意：如果使用自动补偿工具，应在继续操作前手动检查其补偿质量。
  3. 为获得具有代表性的设门结果，将不同批量样本孔的数据合并为单个文件。此步骤可快速识别两种荧光颜色是否存在重叠（通常为CV与VC）或其他异常情况，从而确定需要排除的样本。点击后 合并种群 选项，全选 未补偿参数 从“参数”菜单中，然后单击 连接.
  4. 将拼接后的文件上传至工作区，然后应用补偿矩阵 通过 拖拽.
  5. 制备在以下定义的设门策略 图2 使用合并后的文件。在单细胞门控中，于散点图上显示CFSE与CTV的事件。创建第一个门控，命名为“已标记”（Labeled），包含所有四种荧光颜色，并排除可能的自发荧光。图2C然后，分别对每种颜色进行设门。
  6. 用CV和VC标记的细胞需要进行转换值处理，因为颜色是CFSE和CTV信号的结果。因此，将这两个协调信号在对数尺度上旋转45°，以使分裂稀释过程与x轴平行。该转换值通过手动方式获得，点击Tools，然后 推导参数. 将以下公式粘贴到 公式 盒子
    Static equilibrium formula: sqrt(2)/2 * (log param) + log param; mathematical equation.
    注意：该方程26 假设 CFSE 和 CTV 分别为参数 03 和 17。
  7. 为了正确显示名为衍生参数的新参数，设置一个约3-7范围的线性坐标轴，点击 轴 参数选项并选择 自定义坐标轴.
  8. 将门控分别应用于每种颜色的直方图：对于 CF 和 VI，设置 CFSE-A 和 CTV-A 横轴上，分别设置 CV 和 VC 的新值 衍生参数 横轴上。根据显示的每个峰设置相应的门控 图3.
  9. 将门控应用于每个单独的单细胞孔。确保将推导出的参数添加到每一个被分析的孔中。手动验证每个孔的每种颜色门控，以检测被错误分配到特定峰的事件。门控示例如下所示 图4.
  10. 分析完成后，在确认所有孔均已核实的情况下，选择所有包含至少一个细胞的CF/CV/VC/VI门。 导出 将它们另存为 .csv 文件，并勾选选项“尺度值“和”补偿参数这些文件将导出到一个名为“导出的文件".
  11. 将所有文件合并为一个 .csv 文件，使用其中的 R 脚本 补充文件 1请记得使用“setwd”函数设置正确的路径。该脚本的输出为一个电子表格，包含所有不同设门事件及所有参数的相对强度。
  12. 打开电子表格，为每个参数重命名相应的列，例如使用以下名称：CFSE、CTV、CD90、CD123、CD45RA、CD34、CD38。这些名称将用于确定设门阈值，以便正确分配每个细胞的身份。
  13. 添加六列，列名分别为“孔”、“条件”、“颜色”、“代数”、“原始细胞”和“培养时间”。这些变量为实验中定义的变量，并从每一行数据中推断得出：
    A10 CD34 转出 + PBS_CV_峰1.csv.1 A10（孔），CD34+ (原始细胞)，PBS（处理条件），CV（颜色），Peak_1（代次）
  14. 将大量细胞孔导出以确定设门的阈值：导出已补偿的目标细胞群（例如，CD34+CD38-）作为 .csv 文件，勾选选项“比例值“和”补偿参数。将这些文件导出到名为“导出的文件".
  15. 确定CD38的阈值时，需找出该参数的最大数值；相反，确定CD34的阈值时，需找出该参数的最小数值。对所有关注的参数重复此过程。
    注意：在本方案所呈现的分析中，标记物 CD45RA 被用于在 CD34 阳性细胞中鉴定 LMPPs+CD38- 门控及CD34中的CMP/GMP+CD38+ 门控。这意味着需要为此标记物提取两个不同的阈值。
  16. 将阈值复制并粘贴到名为“gating_matrix”的Excel文件中。该文件按以下方式组织 表 4，并允许对多个独立实验进行分析。每列必须严格按照以下格式命名：XXYYMMDD_xxh，其中XX代表操作者的两个首字母，YY代表年份的后两位数字，MM代表月份，DD代表日期，xx代表分析时间点。

表4：在统计分析之前的细胞命运分配门控矩阵。 CD45h 指的是HPC亚群门控中CD45RA的强度，而CD45l指的是CD34+CD38-亚群中CD45RA的强度。请点击此处下载该表格。

7. 统计分析

注意：生成数据的统计检验涉及一个使用编程语言 Python 编写的自定义分析流程（补充文件 2、补充文件 3 和 补充文件 4）。该脚本分为三个部分：第一部分用于处理电子表格，第二部分用于生成热图以实现数据可视化，第三部分用于生成多个直方图，以分析和检验细胞分化与分裂特性。

  1. 从“0_process_data”模块开始（补充文件 2），确保在脚本中正确定义了gating_matrix和数据电子表格的路径。
  2. 定义“cell_cols”字典，以将相应的细胞命运分配给每个细胞。在本例中，这些命运包括HSCs、MPPs、LMPPs、共同髓系祖细胞（CMPs）、粒单核祖细胞（GMPs）、巨核红系祖细胞（MEPs）以及CD34-。
  3. 利用从bulk wells中确定的阈值（步骤6.16），定义“cell_class_exp_time”函数。在列命名时必须保持一致，以便正确设定这些阈值，应使用与步骤6.12中定义各列时相同的名称。
  4. 脚本中通过一系列“if-else”语句来定义细胞表型，这些语句基于流式细胞术分析期间检测到的阈值。
    注意：可通过修改这些语句以适配其他标志物组合，从而显示不同的表型。
  5. 使用“cond_rule”函数指定实验特异性条件（例如不同的实验处理）。对于所提供的数据集，条件命名为“GT”和“Diff”，用于描述培养细胞所用的两种不同细胞培养基。该信息将由“1_dot_plot”模块（补充文件 3）用于绘制热图。
  6. 在“2_bar_plot”模块中（补充文件 4），定义字典“class_dct”，包含感兴趣的离散细胞命运。对于所提供的数据集，感兴趣的细胞命运与“cell_cols”字典中描述的相同。
  7. 定义“conds”（条件）、“or_cells”（原始细胞）、“sym_labs”（对称性标签）和“times”（实验时间点）。这些是绘图所需的重复筛选条件。“conds”再次引用在“cond_rule”中定义的条件，“or_cells”为HSCs和MPPs，“sym_labs”描述分裂类型。
  8. 在“2_bar_plot”模块中，可绘制进展至第6次分裂的细胞。
    注意：所提供的数据集仅包含至第4次分裂的细胞，因此会弹出错误提示，但这不会影响脚本的正常运行。
  9. 脚本生成的图像可作为PDF文件在名为“figures”的文件夹中获取。文件名包含“Test”的文件表示针对相应直方图执行的不同统计检验。

结果

FACS 分选
本方案中呈现的分选门控策略基于广泛认可的策略12,30,31. 对于所示的设门策略 图1起始材料为先前纯化的脐带血前体细胞 通过 CD34+ 磁性富集，这解释了谱系阳性细胞比例极低的原因。必须对四种细胞内染料组合（例如图中的CTV）设置严格的门控，以提高后续分析中峰的分辨率，并准确圈选目标细胞群图1D）。如图所示，设门选择的是最大且边界更清晰的细胞群。根据我们的经验，每种细胞分裂染料组合出现多个且彼此接近的细胞群，并不能代表真实的生物学差异，反而可能提示：a）染色步骤未达到最佳状态，或 b）起始细胞群体存在较大异质性（尤其是细胞大小方面的异质性）。当起始材料为脐带血或其他复杂的生物来源（如骨髓穿刺液、外周血）时，这种情况并不罕见。如果设门范围不够严格，不同染料组合的信号在连续稀释过程中可能导致后期峰的重叠，尤其是在 CV 和 VC 条件下图2D次优设门的另一个负面影响是在细胞培养后无法有效区分不同的峰，因为起始细胞群体的异质性可能导致峰形浅平。

显示使用FSC、SSC、CD标记物的细胞分化流式细胞术分析示意图。
图1：细胞分选的设门策略。（A）FSC-A 对 SSC-A，用于排除碎片和污染细胞。（B）FSC-A 对 FSC-H，用于排除双联体和细胞团块。（C）Lin 对 FSC-H，用于排除 Lin+ 细胞。（D）CTV 对 CFSE，用于明确鉴定经染料组合 CF、CV、VC 和 VI 染色的细胞。设门应足够严格，以确保包含均一的细胞群体。（E）CD34 对 CD38，用于将限制性祖细胞 CD34+CD38+（也称为 HPCs）与多能性细胞群 CD34+CD38- 分离开。（F）从 CD34+CD38- 群体中分析 CD45RA 对 CD90，以区分最原始的祖细胞（HSC 富集群，CD90+CD45RA-）、LMPP（CD90midCD45RA+）以及更定向的 MPP（CD90-CD45RA-）。（G）索引分选事件，此处显示其细胞染料组合染色情况，以及（H）表面标记物 CD90 和 CD45RA 的表达。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞培养后的流式细胞术分析
图2 中的数据代表了人脐带血造血干细胞在多种细胞因子存在的条件下培养72小时后的结果，这些细胞因子能够支持多种髓系祖细胞和前体细胞的生长。图中2A至2D展示了确定各个细胞谱系关系所需的设门策略，而2E至2G则用于细胞表型鉴定。图中巨核细胞-红细胞祖细胞（MEPs）比例较低，可能是本代表性实验所采用的培养条件所致（图2F）。使用不同的细胞因子和培养条件会改变各细胞亚群的相对比例，这与选择不同的起始细胞进行实验具有类似效果。

流式细胞术散点图；细胞群体，CD34/CD38标志物，造血分化。
图2：流式细胞术分析的设门策略。（A）FSC-A 与 SSC-A，用于排除碎片和污染细胞。（B）FSC-A 与 FSC-H，用于排除双联体和细胞团块。（C）CTV 与 CFSE，标记门（Labeled）可用于排除可能影响数据分辨率的自发荧光事件。（D）CTV 与 CFSE。根据细胞分裂染料的稀释情况，严格设门区分四个细胞群体至关重要。（E）CD34 与 CD38，用于区分定向前体细胞（CD34-）、受限祖细胞（HPC）（CD34+CD38+）和未成熟祖细胞（CD34+CD38-）。（F）CD45RA 与 CD123，用于区分三种类型的受限祖细胞：CMP（CD123+CD45RA-）、MEP（CD123-CD45RA-）和 GMP（CD123+CD45RA+）。（G）CD45RA 与 CD90，从 CD34+CD38- 群体中鉴定 HSCs、LMPPs 和 MPPs。请点击此处查看该图的放大版本。

峰的定义与归属步骤（图3 和 图4）是本实验方案中的关键环节，需要设定严格的门控。在进行峰的定义时（图3），至少需要1,000个事件才能实现可靠的识别。因此，在“Bulk”孔的细胞分选步骤中分离更多的细胞可能是有益的。图4 展示了四个单孔中包含多个家族的示例，该图阐明了 图2D 和 图3 门控的重要性，尤其是在识别每个家族及每个峰时。图4A 展示了一个简单的示例，其中CF门内的所有细胞彼此非常接近，可明确归属于单一峰。图4C 显示了另一个家族明确分布在两个明显分离的峰上的示例，如 图4D 的直方图中清晰所示。图4E、G 强调了基于大量事件进行严格门控的重要性；这两个图中均显示了少量靠近但位于染料组合门之外的事件，若仅基于单孔分析，这些事件可能被错误地归入VI门和CF门。最后，图4F、H 展示了两个家族分布在多个峰上的不同示例，其中一个为两个强度相似的峰（图4F），另一个为两个强度不等的峰（图4H）。

流式细胞术直方图；CF、CV、VC、VI 峰分析；细胞分裂追踪。
图 3：流式细胞术分析中的峰定义。（A-D）应至少记录 500 个事件来定义峰，以确保每个独立峰具有良好的代表性。（A）CFSE-A 荧光强度的直方图。可识别出多个峰，每个峰对应一个不同的分裂细胞群体。（B,C）衍生参数荧光强度的直方图，分别代表 CFSE-CTV 混合物 CV（B）和 VC（C）。（D）CTV-A 荧光强度的直方图。请点击此处查看该图的放大版本。

显示CFSE与CTV分析的流式细胞术图谱，指示细胞增殖峰。
图4：峰的指认。（A,B）在此孔中，仅可在CF门内检测到一个峰。（C,D）在此孔中，可在VI门内检测到两个强度几乎相等的峰，且峰之间分辨良好。（E,F）在此孔中，可在VI门内检测到两个强度相近的峰。仅考虑了基于总体孔所设定策略的门内事件。（G-H）在此孔中，可在CF门内检测到两个强度不等的峰。请点击此处查看该图的放大版本。

数据呈现与统计检验
图5 显示了两次独立实验的多种数据呈现方式，两次实验均在细胞培养72小时后进行。造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）在两种不同的细胞培养基中培养，旨在改变细胞的分裂和分化特性。这两种培养基分别命名为“Diff”（分化培养基）32 和“GT”33前者促进髓系和红系分化，因其含有促红细胞生成素（EPO）和粒-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）；后者则是在基因治疗临床试验背景下开发的，旨在维持并扩增高比例的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。 图 5A 是“Diff”条件下的代表性热图，展示了多种细胞谱系，涵盖不同的细胞命运和分裂情况。在该热图中，每一行代表一个独立的谱系，每个方格代表一个单独的细胞，各列则按相同世代对细胞进行分组（例如，处于第2代的细胞至少经历了两次分裂）。可以区分出高度均质的谱系，由单一细胞类型组成且具有相同的分裂次数（如谱系#63），以及异质性谱系，包含跨越两个世代的三种细胞类型（如谱系#84）。由于该分析的细胞回收率约为70%，因此完整谱系（定义为所有细胞均被回收，可能处于不同世代，例如第1代1个细胞、第2代2个细胞的谱系）很少被观察到（在其编号旁显示井号标记） 图 5A）。不完全检测的原因有多种，可能为技术性原因（染色问题、因操作步骤导致的细胞丢失）或生物学原因（细胞死亡和/或凋亡）。可通过使用专门设计以减少单个样品死体积的分析仪，以及直接在细胞培养板中进行细胞染色以减少移液体积，来克服技术性局限。相反，可采用正交方法来测定细胞死亡程度（例如， 通过 活细胞成像实验）有助于区分导致检测不完全的技术因素和生物学因素。

图5Bi 展示了如何可视化培养条件对细胞类型组成的影响，仿佛进行了批量检测。在此，Diff 条件促进了更多细胞命运的产生，并提高了 CD34 阳性细胞的比例+ 细胞（定义为除CD34以外的所有细胞类型）-）。置信区间在脚本中计算得出 通过 基础自助法，包含 250,000 个自助抽样数据集34值得注意的是，所有其他直方图均位于 图5 以相同方式计算的置信区间 表5 概括了每一代中家族数量和细胞数量的全部信息。

图5Bii 图示展示了在脚本“2_bar_plot”中执行的统计检验结果。有关统计框架的正式描述可查阅相关文档26简而言之，该框架在统计假设检验中假设来自同一家族的细胞具有相关性（这一假设本身可被检验），这与经典统计学要求所有观测细胞之间相互独立的前提相反。在图中所示的特定案例中，统计检验旨在检验以下假设：多能祖细胞（MPP）的命运选择（通过培养中不同细胞类型的出现频率来衡量）与所使用的细胞培养条件无关。首先，采用G检验统计量评估不同培养基条件下细胞类型频率之间的差异（以图中示例为例， Bii，该统计量以红色条形表示）。随后，对数据进行随机化处理 通过 置换，即在两种细胞培养条件下交换整个细胞家族。目的是在保持每组中家族数量与原始数据一致的同时，保留家族内细胞间的依赖关系。G检验统计量由随机化后的数据集计算得出。图中蓝色数值表示 5Bii 是针对250,000次置换的G检验统计量。最后， p 通过计算该值来评估原始数据集与置换后数据集分布之间的偏离程度。在本示例中，原始统计量与置换分布存在较大偏离，从而产生一个较小的值 p 因此否定了MPPs的细胞命运与培养条件无关的假设。

图5C 表示每个最大代次的细胞家族所占的百分比，用于探究不同条件如何改变每个细胞家族的细胞分裂情况。该数据图显示，在72小时时，Diff条件下培养的细胞完成的分裂次数多于GT条件下的细胞。此处表示的是每个家族的最大代次数，因此，若一个家族包含第1代和第2代的细胞，则被视为第2代。可采用与图5B相同的统计框架，对细胞分裂与培养条件之间的独立性进行统计检验。

图5D 探讨了不同类型祖先细胞（HSCs 或 MPPs）第一次分裂的对称性/不对称性类型。对于第一代的完整细胞家族（这是唯一可以明确将两个子细胞确定为姐妹细胞的一代），可定义四种不同的对称性/不对称性类型：“对称未分化”（Sym Undiff）描述的是两个子代细胞均保留了亲代细胞表型的家族；“对称分化”（Sym Diff）指两个子代细胞具有相同的表型，但该表型不同于亲代细胞；“不对称未分化”（Asym Undiff）表示仅有一个子代细胞保留了亲代细胞的表型；最后，“不对称分化”（Asym Diff）描述的是两个子代细胞具有不同的表型，且均与亲代细胞表型不同。为了在评估这些对称/不对称命运时获得足够的统计效力，建议在较早的时间点进行 MultiGen 分析，以便观察到更多其后代处于第一代的细胞家族。

最后，图5E展示了不同分裂次数下各类细胞所占的百分比，以深入了解细胞分化模式在分裂过程中的演变规律。例如，图中数据显示，细胞会逐渐向CD34-状态转变，仅经过三次分裂后，该类别中检测到的细胞已有超过50%处于此状态。此外，可以推断出多能祖细胞（MPPs）并不倾向于进行自我更新式的分裂，因为仅有少量细胞保留了原始表型。这些结论中的一部分可通过前文图示中所介绍的统计框架加以验证。

Clonal family distribution, cell type percentages, and generation analysis in hematopoiesis chart.
图5：使用脐带血HSPC进行的一次72小时实验的数据表示示例。 (A) 选定数据集（HSC，在“Diff”培养基中培养72小时）的热图。图中每个方块代表单个细胞，按其亲缘关系（行）、经历的分裂次数（列，称为代数）和表型（颜色）进行展示。生物) 比较HSCs和MPPs细胞后代中各类细胞比例在GT条件与Diff条件下的直方图。Bii) 该图展示了在“2_bar_plot”脚本中对培养72小时的MPPs进行的统计学检验结果，比较了“Diff”与“GT”两种细胞因子组合之间的差异。“Diff”组的实验值以红色显示，所生成的数值 通过 250,000 次置换，以蓝色表示。该 p. G检验的值显示在右上角，括号内为用于检验的家系数量。C) 直方图比较了每种培养条件下造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）各世代（以颜色区分）的家族百分比（共314个家族）。置信区间通过250,000次自助法重采样数据集计算得出。D) 直方图显示第一代包含两个子细胞的细胞谱系中子代细胞命运对称性/不对称性的类型：对称未分化（两个子代细胞均保留亲代细胞的表型）、对称分化（两个子代细胞具有相同的表型，且与亲代细胞表型不同）、不对称未分化（仅一个子代细胞保留亲代细胞的表型）以及不对称分化（两个子代细胞具有不同的表型，且均不类似于亲代细胞表型）。E使用“Diff”培养基培养的MPP细胞按代次分类的细胞类型贡献比例直方图；n = 204个细胞，97个家族。 请点击此处查看此图的放大版本。

表5：每种实验条件（细胞来源和细胞培养基）下分析的家庭数量和细胞数量的描述。 请点击此处下载该表格。

补充文件 1： 请点击此处下载该文件。

补充文件 2： 请点击此处下载该文件。

补充文件 3： 请点击此处下载该文件。

补充文件 4： 请点击此处下载该文件。

讨论

MultiGen 检测是一种高通量、操作简便且成本较低的检测方法，已广泛应用于淋巴细胞研究23,24,35 和小鼠造血细胞26,27在此，我们介绍一种新发展的方法，可用来破译 离体 人类HSPC承诺的早期阶段，通过短期培养在单细胞水平上进行研究（图6）。单细胞 离体 培养系统通常用于评估造血干细胞和祖细胞（HSPCs）向成熟细胞的长期分化命运，但某些分化命运会比其他更早发生36，可能导致分析结果偏向于较少的命运类型。此外，这些培养系统通常缺乏命运决定过程中细胞分裂的相关信息。已有研究表明，最初的命运决定步骤可能早在培养初期即已发生，有时甚至不伴随细胞分裂。26,37，因此短期培养并追踪细胞分裂对于研究早期命运决定至关重要。通过同时追踪细胞命运、分裂过程及谱系关系，该检测方法能够揭示人类造血干祖细胞（HSPCs）中首次分裂与命运决定的作用。利用该方法，可推断出细胞在经历多少次分裂后发生命运承诺、早期前体细胞的自我更新与分化之间的平衡，以及这些特性在世代间如何遗传。据我们所知，这是目前唯一可在单细胞分辨率下对人类HSPCs实现上述测量的检测方法。此外，通过使用不同组合的细胞分裂染料，我们提高了分析通量，使该方法成为快速生成大规模数据集的有力工具。染料组合的使用使得在同一孔中可同时追踪多个细胞谱系，从而增加短期培养中可用于分析的细胞数量。未来，染料组合的数量还有望进一步增加。 通过 添加其他染料（例如黄色染料）或调整CFSE与CTV的比例。然而，这会减少可同时分析的其他参数数量。

流式细胞术实验中细胞染色、分选和分析流程的流程图。
图6：实验方案的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

为了成功完成分析，由于孔的数量较多且待分析的细胞数量较少，必须使用配备微孔板读板器的流式细胞仪进行流式细胞术分析。新一代台式分析仪特别适用于该实验，因为其中大多数具有更小的死体积，可减少细胞损失比例。这进而保证了从每个孔中回收细胞的效率更高，回收效率估计可达70%左右26。在流式细胞术检测过程中评估细胞损失对于每个细胞家族的分析至关重要。例如，在假设无细胞死亡的前提下，通过计数细胞分裂次数，即可估算每个家族的细胞数量。然而，建议进行一些验证性实验，特别是在测试的培养条件下对细胞死亡率进行评估，并通过使用已知数量的细胞来实验测定回收率。

该实验方案的关键步骤之一是峰的指认。如前所述，高质量的峰分布结果在很大程度上依赖于细胞分选过程中获得非常狭窄的峰。然而，仅根据峰的分布情况仍难以准确确定细胞分裂次数。由于细胞分选和流式细胞术分析是在两台不同的仪器上进行的，无法直接比较每个信号的强度，因此可能难以判断在直方图右侧观察到的第一个峰是第0峰还是第1峰。针对这一问题，可采取几种解决方案：一种方法是开展正交实验，以精确测量这些细胞所经历的分裂次数（例如，活细胞成像）；另一种方法是在进行流式细胞术分析之前，使用倒置明场显微镜直接计数孔中细胞的数量。这可以推算出平均分裂次数（假设无细胞死亡）。最后，还有一种事后校正峰指认的方法，即检测是否存在异常数量的“不可能家系”；这些家系包含每代细胞数量超出理论可能的情况（例如，第2代中有5个细胞，或第1代中有2个细胞且第2代中有1个细胞）。在统计分析步骤中已编码了排除不可能家系的功能，并会标记出此类家系。如果此类错误出现频率过高，则应合理推断峰的指认需要重新修正。

在本实验方案中，我们列举了该检测数据分析与呈现的若干示例，因为这已成为大规模数据生成与解读中的关键步骤38。第一个示例是热图，展示按细胞家族组织的所有被分析细胞的总体情况。这是一种高效工具，可用于探索数据的整体特征及潜在结论：家族是否由多种细胞类型组成，还是倾向于组成均一？家族是否跨越多个世代，还是主要进行相同次数的分裂？这种探索性分析随后需辅以更具体的图表和统计检验。该方法可用于定量评估对称性与不对称性命运决定、不分裂即分化、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所经历的分裂次数。在实验设计阶段，必须根据所研究问题的类型合理设定细胞培养时长；例如，针对前两个问题（对称/不对称之平衡以及不分裂即分化），设计较短的培养周期可分离出大量仅经历一次或未发生任何分裂的细胞家族26。相反，较长周期的实验则有助于探究特定细胞命运决定所需的分裂次数，因为它能够采集处于不同分化阶段的细胞家族。然而，该方法并不适用于长期培养（2–3周），因为细胞染料稀释无法准确追踪超过七到八次以上的细胞分裂22。因此，该技术主要适用于研究造血祖细胞的早期命运决定，而不适用于对这些细胞长期分化特性的可靠推断。

该统计框架是专门为分析此类数据而开发的，基于置换的概念26。之所以需要这样做，是因为观察到细胞类型分布以及细胞分裂次数存在家族依赖性。换句话说，属于同一家族的细胞更可能表现出相似的表型，并进行相同次数的分裂。尽管深入分析超出了本研究的范围，但在评估不同条件时，所提供的统计检验方法应已足够。

总之，该方案是评估造血干细胞和祖细胞细胞动力学的有力工具 离体以快速且经济的方式进行。由于该方法在分析时间点、培养条件和造血干细胞与祖细胞（HSPCs）类型方面具有高度灵活性和多功能性，因此可适用于多种实验条件的测试。作为一种基于流式细胞术的检测方法，其可在大多数实验室中实施，且无需 extensive 的前期经验，因而非常适合用于筛选实验和预实验。

披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。资助方在研究设计、数据收集与解释，以及决定提交论文发表等过程中均未发挥任何作用。

致谢

我们感谢居里研究所流式平台成员在建立流式细胞术实验过程中提供的帮助。我们还要感谢Perié研究团队其他成员在多次讨论中的贡献。感谢Julia Marchingo博士和Phil Hodgkin教授（Walter and Eliza Hall医学研究所）分享他们在淋巴细胞细胞分裂染料多重标记方面的实验方案。感谢圣路易医院脐带血生物样本库为本实验方案的开发提供了必要的生物资源。本研究获得了法国国家科学研究中心（CNRS）和贝当古-舒勒基金会（Bettencourt-Schueller Foundation）ATIP-Avenir项目资助（授予L.P.），Labex CelTisPhyBio 项目（ANR-10-LBX-0038）（授予L.P.和A.D.），巴黎科学与文学大学（Paris-Science-Lettres）Idex项目（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）（授予L.P.），法国国家癌症研究所（INCA）Canceropole新兴项目（2021-1-EMERG-54b-ICR-1，授予L.P.），以及ITMO MIIC项目（21CM044，授予L.P.）的资助。此外，本研究还获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下“ERC StG 758170-Microbar”项目（授予L.P.）的资助。A.D.获得了法国基金会（Fondation de France）博士后奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL聚丙烯微量离心管vWR87003-294
15 mL聚丙烯管vWR734-0451
50 mL聚丙烯管vWR734-0448
96孔U型底培养板 Falcon353077
抗人 Lin APC赛默飞世尔科技22-7776-72稀释比例 1/40
ARIA IIIBD可替换为任何能够将单个细胞分选至96孔板的FACS分选仪
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）Life TechnologiesC34570
细胞示踪紫（CTV） Life TechnologiesC34571
补偿微珠 BD552843
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Life Technologies11320033
乙二胺四乙酸（EDTA）赛默飞世尔科技J62948-36在无菌水中配制 0.5 M 溶液
FC 封闭 Fc1.3216BD564220稀释比例 1/50
胎牛血清（FBS）DutscherS1900-500CS00CH 批次
FlowJo v10.8.1BD
小鼠抗人 CD10 PerCP-5.5，克隆号 HI10aBiolegend312216稀释比例 1/20
小鼠抗人 CD123 BUV395，克隆 7G3BD564195稀释比例 1/15
小鼠抗人 CD34 APC-Cy7，克隆 581Biolegend343513稀释比例 1/40
小鼠抗人 CD38 BV650，克隆 HB7Biolegend356620稀释比例 1/40
小鼠抗人 CD45RA AF700，克隆号 HI100BD560673稀释比例 1/20
小鼠抗人 CD45RA PE-Cy7，克隆 HI100BD560675稀释比例 1/20
小鼠抗人 CD90 PE，克隆 5E10Biolegend328110稀释 1/20
磷酸盐缓冲液（PBS）1XLife Technologies10010001
Python
R
无菌12x75 mm锥形聚丙烯管Falcon
ZE5 伯乐（Bio-Rad）可替换为任何配备微孔板读取功能的流式细胞仪
<强>实验室制备
细胞培养基根据具体实验而定。每日新鲜配制，并于+4℃保存 °C，直至使用
DMEM + 10% FBS可在无菌条件下于 +4 ℃ 保存 °C 可保存长达 1 年。配制 500 mL 时，将 50 mL FBS 加入 450 mL DMEM 中
PBS 1X + EDTA 0.1%可在无菌条件下于室温保存，最长1年。制备500 mL时，将3.42 mL 0.5 M EDTA加入500 mL 1× PBS中
染色缓冲液可在无菌条件下于 +4 ℃ 保存 °C，最长可保存1年。配制500 mL时，向500 mL 1× PBS中加入2 mL 0.5 M EDTA和1 mL胎牛血清（FBS）。

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