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同时评估亲缘关系、分裂次数和表型 通过 造血干细胞与祖细胞的流式细胞术

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DOI：

10.3791/64918

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2023年3月24日

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1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于流式细胞术的技术，可同时测量细胞分裂次数、细胞表面表型以及细胞间的亲缘关系。这些特性可通过基于置换的统计框架进行检验。

摘要

很少有技术能够同时评估单个细胞的表型和命运。目前用于表征表型的大多数方案虽然能够生成大量数据，但需要破坏目标细胞，从而无法进一步评估其功能命运。因此，对于造血等具有异质性的生物分化系统，其动态过程难以准确描述。基于细胞分裂示踪染料，我们进一步开发了一种实验方案，可同时确定大量单个造血祖细胞的亲缘关系、分裂次数和分化状态。该方案能够实现对 离体 小鼠和人类造血祖细胞的分化潜能，这些细胞分离自多种生物来源。此外，由于该方法基于流式细胞术并仅需有限数量的试剂，因此能够以相对低廉的成本在单细胞水平上快速生成大量数据。我们还提供了单细胞分析的分析流程，并结合了可靠的统计学框架。由于该方案可在单细胞水平上关联细胞分裂与分化过程，因此可用于定量评估对称性与不对称性命运决定、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所需的分裂次数。总体而言，该方案可用于旨在从单细胞视角揭示不同造血祖细胞之间生物学差异的实验设计。

引言

过去十年见证了单细胞技术在细胞与分子生物学领域的全球性普及。继单细胞基因组学1,2之后，如今已能够利用每年不断涌现的新型单细胞组学技术，对单个细胞的多种组分（如DNA、RNA、蛋白质）进行研究。这些技术在免疫学、神经生物学、肿瘤学等领域，无论是使用人类细胞还是模式生物细胞，都为新旧科学问题提供了新的见解3。通过揭示个体细胞之间的差异，单细胞组学推动了造血过程新模型的建立，该模型聚焦于造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的异质性，摒弃了传统上将细胞群体视为离散且均一的模型4,5。

所有组学技术为数不多的缺点之一是会破坏目标细胞，从而无法评估该细胞的功能活性。相比之下，其他单细胞方法，如单细胞移植实验和谱系示踪技术，则可通过追踪单个细胞的命运来反映祖先细胞的功能状态。 体内6,7谱系示踪技术涉及利用可遗传的遗传标记对目标细胞进行标记7 或荧光标记8,9，从而能够同时追踪多个单细胞的命运。然而，对起始细胞的表征通常仅限于少数几个参数，例如通过流式细胞术检测的少数表面蛋白的表达水平10此外，单细胞谱系示踪技术通常需要繁琐的细胞标记检测过程 通过 DNA/RNA测序或成像。尤其是最后一点限制了单次实验中可检测的条件数量。

另一类用于研究单个细胞功能的方法是单个造血干细胞和祖细胞（HSPC）的ex vivo细胞培养系统。这类实验操作简便，是公认的金标准检测方法，其过程包括将单个细胞分选至96孔细胞培养板中，经过培养后，通常通过流式细胞术或形态学分析来鉴定子代细胞的表型。这些检测方法主要用于表征HSPC在体外培养2-3周后向成熟细胞的长期分化能力11,12。此外，这些方法也被用于尝试在ex vivo条件下维持和扩增HSPC13,14,15,16,17,18，有望为人类干细胞移植带来临床应用价值19。最后，这些方法还被用于通过短期培养研究HSPC的早期命运决定20，但此类培养产生的细胞数量较少，是其主要局限性。上述各类ex vivo检测方法的一个缺点是只能部分反映in vivo的复杂性；尽管如此，它们仍是目前为数不多可用于研究人类HSPC分化的实验手段之一。

现有单细胞方法（单细胞组学、谱系示踪和 离体 准确检测细胞分裂是研究造血干祖细胞（HSPC）动态时需要考虑的一个关键参数21一种评估分裂次数的简单方法 通过 流式细胞术是利用可溶性 "蛋白质染料"，类似于5-(和6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）22这些分裂染料会扩散至染色细胞的胞质内，在每次细胞分裂时被稀释一半，并平均分配至两个子代细胞，从而可追踪多达10次细胞分裂。通过联合使用多种分裂染料，可在同一孔中接种多个独立的前体细胞，因为每种染料均可独立区分各自的子代细胞。这一原理即为细胞染料用于多重克隆及分裂追踪技术的基础，最早应用于小鼠淋巴细胞。23,24.

在此，我们介绍了用于小鼠和人类造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的MultiGen检测方法的开发。该方法可同时对大量单细胞进行检测，评估其分化潜能、分裂能力及谱系亲缘关系。 离体该高通量、操作简便且成本低廉的检测方法可同时测量细胞表型、细胞分裂次数以及孔内细胞之间的亲缘关系和克隆关联性。可用于定量评估命运决定的对称性与不对称性、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所需的分裂次数。本实验方案需要配备平板读取功能的荧光激活细胞分选仪（FACS）和流式细胞仪，以及进行细胞培养所需的常规设备。除针对人HSPC执行该检测的技术流程外，我们还提供了详细的分析框架，包括评估与细胞家族概念相关的细胞特性所必需的统计检验方法。25该方案已成功用于描述小鼠HSPC区室26,27.

以下方案以磁珠富集的CD34+细胞作为起始材料28。通过该方法，可高效地对来自不同血液来源（例如脐带血、骨髓、外周血）的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）进行染色和分离。注意不要丢弃CD34-组分，因其将在本方案中用于设置多种实验对照。所述的细胞数量和体积可根据实验流程和实际需求进行相应放大或缩小。同样，通过调整细胞分选和流式细胞术步骤中所使用的抗体，该方案也可适用于不同类型前体细胞的研究。

方案

以下实验方案使用去身份化的脐带血作为造血干细胞和祖细胞（HSPC）来源，脐带血的采集遵循圣路易医院脐带血生物样本库的规定（授权号 AC-2016-2759）以及《赫尔辛基宣言》的指导原则。

注意：在开始之前，请确保本方案所需的所有试剂和设备均已备齐，具体清单见下文 材料清单 并在方案中注明。相关试剂需新鲜配制，除非明确说明，否则不得储存。

1. 细胞染料染色

注意：本部分描述使用四种不同组合的CFSE与紫染料（CTV）细胞分裂染料进行染色。所有离心管需同时处理，即使不添加细胞染料溶液也需如此。所有步骤均需在无菌条件下操作，以便后续进行细胞培养。所需时间：约100分钟。

  1. 根据磁性分选方案处理脐带血单位29确保获得两个组分：大量 CD34- 组分以及较小的CD34+ 组分。将两个管在300 x g下离心5分钟 g吸弃上清液，注意不要扰动沉淀。
  2. 对于CD34+ 组分，用1 mL不含胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）重悬；用血细胞计数板计数细胞，细胞密度不应高于3 x 106 个/mL。如果出现这种情况，应相应调整体积。对于CD34- 组分，用不含FBS的DMEM重悬，并调整体积至最多6 x 106 cells/mL
  3. 等分试样 250 µL CD34的+ 将悬液分装至四个15 mL聚丙烯管中。将各管标记如下：CD34+/CF（仅CFSE）、CD34+/CV（CFSE_high CTV_low），CD34+/VC（CFSE_low CTV_high）和 CD34+/VI（CTV_high）。分装 250 µL CD34的- 分装至另外四个15 mL聚丙烯管中。将各管标记如下：CD34-/CF（CFSE_only），CD34-/CV（CFSE高 CTV低），CD34-/VC（CFSE_low CTV_high）和 CD34-/VI（CTV_high）。从CD34中剩余的细胞- 可弃去该组分。
  4. 配制两种CFSE溶液，分别命名为CFSE_high和CFSE_low。对于CFSE_high（10 µM)，将 1.1 mL 不含 FBS 的 DMEM 与 2.2 µL CFSE 储存液（5 mM）溶液。用于 CFSE_low（5 µM），混合 550 µL 不含 FBS 的 DMEM 0.55 µL CFSE 储存液（5 mM）溶液。
  5. 添加 250 µL 将CFSE_high溶液加入CF和CV管中， 250 µL 将CFSE_low溶液加入VC管中， 250 µL 将不含FBS的DMEM加入VI管中。为确保细胞悬液与细胞染料充分混合，将试管倾斜至接近90度，将CFSE溶液沿试管壁加入。随后将试管垂直持握，使两种溶液混合，并用移液器吹打三至四次，以确保CFSE溶液与重悬细胞迅速混匀。孵育于 37 °C 精确持续8分钟。
  6. 孵育后，加入 5 mL DMEM + 10% FBS。将试管置于 37 °C 5 分钟。
  7. 将离心管以 300 x 转速离心 5 分钟 g. 移除上清液 通过 轻柔吸除上清液，避免扰动沉淀，随后用 5 mL 磷酸盐缓冲液 1x/乙二胺四乙酸（PBS 1x/EDTA）洗涤沉淀。再次以 300 x g 离心 5 分钟 g弃去上清液，不要扰动沉淀，将细胞沉淀重悬于 250 µL 1× PBS/EDTA
  8. 配制两种CTV溶液，分别命名为CTV_high和CTV_low。对于CTV_high（10 µM），加入1.1 mL PBS 1×/EDTA并混匀 2.2 µL 5 mM CTV 储液。对于 CTV_low（5 µM），混合 550 µL PBS 1x/EDTA 溶液 0.55 µL 5 mM CTV 储存液
  9. 添加 250 µL 将CTV_high溶液分别加入VC和VI管中， 250 µL 将CTV_low溶液加入CV管中，并 250 µL 向CF管中加入1× PBS/EDTA。采用与步骤1.5中所述相同的技术。于指定条件下孵育 37 °C 精确持续8分钟。
  10. 孵育后，加入 5 mL DMEM + 10% FBS。保持在 37 °C 5 分钟。
  11. 将离心管在300 x g下离心5分钟 g，弃去上清液，不要扰动沉淀，然后用 5 mL 1x PBS/EDTA 洗涤沉淀。再次以 300 x g 离心 5 分钟 g.
  12. 弃去上清液，避免扰动沉淀物，重悬 CD34- 1× PBS/EDTA 中的组分，终浓度为 1.5 × 106 cells/mL。重悬CD34+ 组分在 40 µL 加入染色缓冲液，并将细胞转移至1.5 mL离心管中。

2. 抗体染色

注意：抗体染色可根据实验需求进行定制。仅 CD34+ 组分进行抗体染色；CD34- 组分则作为细胞分裂染料组合（CV、VC、CF 和 VI 组分）的单染对照。以下方案专为检测四种类型的造血干细胞和祖细胞（HSPC）而设计：造血干细胞（HSC）、多能祖细胞（MPP）、淋巴系偏向性多能祖细胞（LMPP）以及造血祖细胞（HPC）12。但本文仅展示 HSC 和 MPP 的鉴定方法。所需时间：75 分钟。

  1. 使用补偿微珠制备用于表面染色的单染样本。将阴性微珠与免疫球蛋白G（IgG）微珠按1:1比例混合，总体积相当于 20 µL 表面标记物的数量（例如， 120 µL 如果染色面板包含六种抗体）。
  2. 分发 20 µL 将珠子按每种标记物分别加入到各个1.5 mL离心管中。根据每种抗体的稀释倍数，在对应的管中加入相应体积的抗体（例如，若稀释倍数为1:20，则加入相应体积的抗体） 1 µL).
  3. 为了染色CD34+ 细胞，制备抗体主混合液12，基于 表1将抗体混合至一个 0.5 mL 离心管中。加入 7 µL 向四个CD34+条件的每个样本中加入抗体主混合液。
  4. 孵育补偿微珠与 CD34+ 样品在 4° C 至少 30 分钟。
    注意：孵育时间必须根据所用染色抗体的技术细节进行调整。
  5. 孵育期间，准备用于分选的96孔圆底板，并加入 100 µL 使用多通道移液器向每个孔中加入细胞培养基。
    注意：H8-H12孔不加样。
  6. 标记5 mL聚丙烯管，用于表面染色对照（5管，使用微珠）和细胞增殖染料对照（4管，使用CD34- 组分）以及 CD34+ 样本（4）
  7. 孵育结束后，用1 mL染色缓冲液洗涤细胞和磁珠，将全部体积转移至5 mL聚丙烯管中，在300 × g下离心5 min g，然后小心吸取上清液，勿扰动沉淀。
  8. 用约 staining buffer 重悬细胞 500 µL 分别针对珠粒和CD34+ 细胞，CD34 为 1 mL- 管

表1：用于细胞分选实验的抗体主混合液配制模板。 请点击此处下载该表格。

3. 细胞分选

注意：分选的细胞数量可能根据可获得的细胞总数而变化。本方案中提供了每个对照的最低细胞数量。所需时间（单个培养板）：100 分钟。

  1. 打开模板实验或新建实验。创建一个样本和多个试管，每个条件对应一个试管。
  2. 按照图1中详述的设门策略，建立六个点图。首先，在FSC-A/SSC-A点图上显示细胞，双击多边形设门工具，选择侧向散射较低的细胞群体（图1A）。在下一个点图（FSC-A/FSC-H）中，右键单击点图，从下拉菜单中选择“Cells”门。使用相同的设门工具，在两个坐标轴之间的对角线上选择一个紧凑的细胞群体（图1B）。
  3. 在第三个点图（APC vs. FSH-H）中，显示“Single Cells”群体，并对APC谱系（Lin）不表达的细胞进行设门（图1C）。在第四个点图（CFSE vs. CTV）中，显示“Lin-”群体，并建立四个独立的门，每个门对应一种染料组合（图1D）。
    注意：这些门必须设得紧凑，以仅选择少量染色均一的细胞。
  4. 使用第五和第六个点图（APC-Cy7 vs. BV650 和 PE-Cy7 vs. PE）识别目标前体细胞。在第五个点图中，较宽松地设门选择CD34+CD38-和CD34+CD38+细胞群体（图1E）。然后在第六个点图中选择CD34+CD38-群体，并根据图1F绘制三个门。
  5. 运行含有补偿微珠的单染试管，点击Acquire按钮。通过Parameters下拉菜单调整光电倍增管（PMT）电压，特别是细胞分裂染料的电压（在双指数尺度上介于104至105之间）。
  6. 根据用于分选的抗体组合，使用Compensation选项卡优化补偿矩阵。点击Record按钮，在微珠门中至少记录5,000个事件。
  7. 运行CD34-组分，并再次检查补偿矩阵。在单细胞门中Record至少10,000个事件。
  8. 运行CD34+组分，在单细胞门中记录至少5,000个事件。针对每种染料组合调整设门，设置紧凑的门以选择均一的细胞群体（图1D）。同样地，调整设门以选择HSCs和MPPs。
  9. 完成分析并记录所有试管后，执行标准Aria校准程序，将样品板放入适用于96孔板分选的相应支架中。建议对样品板进行冷却。
  10. 根据表2所示方案，使用实验的sort layout准备板式分选模板。“CD34-”命名的孔中分选5,000–10,000个细胞，分选门为CF/CV/VC/VI；“Bulk”孔中分选至少500个细胞，分选门为CD34+CD38-；单细胞孔中每种细胞分裂染料组合每孔仅分选一个事件，即每孔共四个事件。
    注意：“Bulk”群体可根据特定前体细胞亚群进行调整；分选细胞数不得少于500个。
  11. 进行分选时，按顺序操作，完成每种细胞分裂染料组合的分选后再进入下一个。例如，首先以yield纯度模式分选CD34- CF。点击Acquire按钮，然后点击Sort按钮。
  12. 完成CD34-分选后，插入CF CD34+试管。Acquire后点击Sort按钮，并确保选择0/16/0作为纯度等级。最后，以single-cell纯度模式分选目标细胞，每孔一个细胞，并确保勾选Index Sorting选项。
  13. 进入下一个细胞分裂染料组合，重复相同的顺序。作为参考，Table 2提供了一个已分选样品板的示例。
    注意：索引分选功能会为每种分选条件生成独立的文件。
  14. 分选结束后，将文件导出为.fcs 3.0格式。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中。根据实验设计，细胞需培养多天，至少24小时26。

表2：基于后续流式细胞术分析特定要求的细胞分选96孔板模板。 请点击此处下载该表格。

4. 细胞分选数据分析

注意：在继续下一步之前，必须进行流式细胞术数据分析以验证细胞分选的质量。此步骤的主要结果是生成一个电子表格，其中包含每个已分选单个细胞的标记物强度数据。

  1. 将 .fcs 3.0 文件上传至分析软件中。
  2. 使用实际分选前记录的单染色文件，验证细胞分选过程中所用的补偿设置。
  3. 根据对应不同总体样本的文件设定修订后的设门策略。将这些门复制并粘贴到索引分选文件中。
  4. 检查索引分选的细胞是否落入设定的门内。若存在分选错误的细胞，可通过导出分选过程中记录的孔板坐标进行识别，并在后续分析中予以剔除。
  5. 导出索引分选文件中的事件作为补偿后的参数。勾选"scale values"和"compensated parameters"选项，将其导出为 .csv 文件。这些文件应导出至名为"Exported files"的文件夹中。
  6. 使用补充文件1中的脚本将所有文件合并为一个 .csv 文件。通过函数 "setwd" 设置正确的路径。该脚本的输出结果为一个电子表格，包含所有不同设门的事件及其各参数的相对强度。

5. 培养后抗体染色

注意：本实验步骤需在无菌条件下操作；多种试剂与前期步骤共用，必须保持无菌状态。进行流式细胞术分析时，使用配备微孔板读板器的流式细胞仪。该配置允许直接在细胞培养板中完成染色，通过减少移液和离心操作，将细胞损失降至最低。使用补偿微珠制备表面标志物单色染色样本，但 A1-A4 孔除外，这些孔已含有 CF/CV/VC/VI 颜色的单染样本，并存在于 96 孔板中。根据细胞染料分选的大量细胞群体可用于确定细胞分裂次数及整体设门策略的参考依据。所需时间：120 分钟。

  1. 在开始实验方案之前，使用倒置显微镜观察培养板，标记出含有至少一个细胞的孔。此步骤有助于优化染色过程中抗体的使用量，并加快实验进程。
  2. 根据说明书配制抗体主混合液， 表3由于涉及大量移液操作，表格中已考虑移液带来的技术误差，并额外增加5%的体积。表中所述抗体可用于表征人脐血样本中的多种造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。12.
  3. 将培养板在300 × g 条件下离心5分钟 g在生物安全柜中迅速将培养板倒置在纸巾上方，以去除上清液。
  4. 添加 8 µL 向 A1-A4 孔中加入染色缓冲液。添加 8 µL 将混合液加入其他孔中。
  5. 将阴性磁珠与IgG补偿磁珠按1:1比例混合，总体积相当于 120 µL. 发送 20 µL 每个标记物分别加入一个1.5 mL离心管中。加入对应稀释倍数的抗体体积（例如，若稀释倍数为1:20，则加入） 1 µL).
    注意：根据染色所用标记物的数量调整总体积（例如， 100 µL 如果染色面板包含五种抗体）。
  6. 将培养板和单染色补偿对照在 +4 °C，至少 30 分钟。
    注意：孵育时间必须根据所用染色抗体的技术细节进行调整。
  7. 用 1 mL 染色缓冲液洗涤磁珠。将全部体积转移至先前标记好的 5 mL 聚丙烯管中。在 300 x g 条件下离心 5 分钟 g，然后移除上清液 通过 吸取
  8. 用 PBS 洗涤培养板中的细胞，加入 100 µL 每孔加入染色缓冲液，使用多通道移液器操作。以 300 x g 孵育5分钟，然后在生物安全柜中迅速将培养板倒置于纸巾上，以去除上清液。
  9. 重悬细胞于 85 µL 使用多通道移液器加入染色缓冲液。
  10. 在流式细胞仪上开始分析（采集模式），使用专用模板并点击 定制该定制模板考虑了96孔圆底板的技术特性，特别是每个孔的尺寸（直径、深度和厚度）。探针必须到达孔底，因此应将其置于A1和H12孔的正中心。
  11. 选择之后 荧光染料 从软件提供的列表中选择感兴趣的目标，设置 平板设置 根据表2的孔板模板，校正含有至少一个细胞的孔的数量。
  12. 选择 100 µL 作为 采集体积限制. 勾选 振荡 选项。设置 采集速率 到 1 µL/s 最大值，因为较低的速度可提高每孔分析的总体积。
  13. 向 H8-H12 孔中加入适当的清洗和洗涤溶液。模板在 表2 特别留空 H8-H12 孔，因为流式细胞仪在分析结束时需要运行一系列洗涤条件。
    注意：此步骤根据所用流式细胞仪的具体特性进行调整。
  14. 在图示与门控部分，首先使用FSC-A/SSC-A散点图设置单细胞门，然后使用FSC-H/FSC-A散点图。创建一个 直方图 针对每个感兴趣的标记物。
  15. 确认设置后，继续执行以下步骤 分析 先分析单染色样本， 记录 不少于 5,000 个事件（最佳范围：5,000–15,000 个事件），补偿微珠和 CD34 染色组分均需如此。必要时调整电压。
  16. 单染样本全部记录完毕后，即可通过单击开始实际的采集过程 采集 功能

表3：用于流式细胞术实验的抗体预混液，专门用于从人脐带血中鉴定造血干细胞和祖细胞（HSPCs）。 请点击此处下载该表格。

6. 培养后流式细胞术数据分析

注意：此处描述的数据分析仅适用于材料表中提到的软件。主要输出结果是生成一个电子表格，其中包含每个被分析细胞的表面标志物强度、分裂次数以及亲缘关系信息。本实验方案的此部分包含一个用 R 编写的脚本，该脚本对于生成最终分析电子表格的工作流程至关重要。

  1. 导出 将流式细胞仪的文件保存为 .fcs 文件，上传至分析软件中，并将其分组为“单染”、“总体”和“单细胞”。
  2. 使用单染色文件制备补偿矩阵，并将其应用于其他两组 拖放.
    注意：如果使用自动补偿工具，应在继续操作前手动检查其质量。
  3. 为获得具有代表性的设门结果，将不同混样孔的数据合并至单个文件中。此步骤可快速识别两种荧光颜色是否存在重叠（通常为CV与VC）或其他异常情况，从而确定需排除的样本。点击后 合并种群 选项，全选 未补偿参数 从“参数”菜单中，然后单击 连接.
  4. 将拼接后的文件上传至工作区，然后应用补偿矩阵 通过 拖放.
  5. 制备在门控策略中定义的 图2 使用合并后的文件。在单细胞门控中，于散点图上显示CFSE与CTV的事件。创建第一个名为“已标记”的门控，包含全部四种荧光颜色，并排除可能的自发荧光（图2C。然后，分别对每种颜色设门。
  6. 经CV和VC标记的细胞需要进行转换值处理，因为颜色是CFSE和CTV信号的结果。因此，这两个协同信号在对数尺度上进行旋转 45°，以允许分裂稀释沿x轴平行进行。该转换值通过手动获取，点击“Tools”，然后 推导参数. 将以下公式粘贴到 公式 盒
    使用 \(\sqrt{2}/2\) 的对数参数方程；数学表达式分析
    注意：该方程26 假设 CFSE 和 CTV 分别为参数 03 和 17。
  7. 为了正确显示名为 Derived Parameter 的这一新参数，需设置线性坐标轴范围约为 3-7，并单击 轴 参数选项并选择 自定义坐标轴.
  8. 将门控分别应用于每种颜色的直方图：对于 CF 和 VI，设置 CFSE-A 和 CTV-A 横轴上。对于CV和VC，设置新 衍生参数 横轴上。根据显示的每个峰设置相应的门控。 图3.
  9. 对每个单细胞孔进行设门处理。确保将衍生参数添加到每个被分析的孔中。手动检查每个孔的各颜色门，以发现被错误分配至特定峰的事件。设门示例如下所示： 图4.
  10. 分析完成后，在确认所有孔均无误后，选择所有包含至少一个细胞的CF/CV/VC/VI门。 导出 将它们另存为 .csv 文件，并勾选选项“量程数值“和”补偿参数这些文件将导出到一个名为“导出的文件".
  11. 将所有文件合并为一个 .csv 文件，使用其中的 R 脚本 补充文件 1请记得使用“setwd”函数设置正确的路径。该脚本的输出结果为一个电子表格，其中包含所有不同设门事件及其对应各参数的相对强度。
  12. 打开电子表格，并为每个参数重命名相应的列，例如使用以下名称：CFSE、CTV、CD90、CD123、CD45RA、CD34、CD38。这些名称将用于确定设门阈值，以便正确分配每个细胞的身份。
  13. 添加六列，列名分别为“孔”、“条件”、“颜色”、“代数”、“原始细胞”和“培养时间”。这些变量为实验中定义的变量，由每一行数据推断得出：
    export_A10 CD34 + PBS_CV_峰 1.csv.1 A10（孔），CD34+ (原始细胞)，PBS（条件），CV（颜色），峰1（代次）
  14. 将大量孔导出以确定设门的阈值：导出已补偿的目标群体（如 CD34+CD38-）作为 .csv 文件，勾选选项“量程数值“和”补偿参数将这些文件导出到名为“导出的文件".
  15. 确定 CD38 的阈值时，需找出该参数的最大数值；相反，确定 CD34 的阈值时，需找出该参数的最小数值。对所有关注的参数重复此过程。
    注意：在本方案所呈现的分析中，标记物 CD45RA 既用于在 CD34+CD38- 门控及CD34中的CMP/GMP+CD38+ 门控。这意味着需要为此标记物提取两个不同的阈值。
  16. 将阈值复制并粘贴到名为“gating_matrix”的 Excel 文件中。该文件的组织方式依据 表4，并允许对多个独立实验进行分析。每一列必须严格按照以下格式命名：XXYYMMDD_xxh，其中XX代表操作者的两个首字母，YY代表年份的最后两位数字，MM代表月份，DD代表日期，xx代表分析时间点。

表4：在统计分析之前的细胞命运分配门控矩阵。 CD45h 指的是HPC亚群门控中CD45RA的强度，而CD45l指的是CD34+CD38-亚群中CD45RA的强度。请点击此处下载该表格。

7. 统计学分析

注意：对生成数据的统计检验采用使用编程语言 Python 编写的自定义分析流程（补充文件 2、补充文件 3 和 补充文件 4）。该脚本分为三个模块：第一个模块用于处理电子表格，第二个模块用于生成热图以实现数据可视化，最后一个模块用于生成多个直方图，以分析和检验细胞分化与分裂特性。

  1. 从模块“0_process_data”（补充文件 2）开始，确保脚本中正确定义了gating_matrix和数据电子表格的路径。
  2. 定义“cell_cols”字典，以将相应的细胞命运分配给每个细胞。在本例中，这些命运包括HSCs、MPPs、LMPPs、共同髓系祖细胞（CMPs）、粒单核祖细胞（GMPs）、巨核红系祖细胞（MEPs）以及CD34-。
  3. 利用从bulk wells中确定的阈值（步骤6.16），定义“cell_class_exp_time”函数。在列命名时必须保持一致，以便正确设定这些阈值，应使用与步骤6.12中定义各列时相同的名称。
  4. 脚本中通过一系列“if-else”语句来定义细胞表型，这些语句基于流式细胞术分析期间检测到的阈值。
    注意：可通过修改这些语句以适应其他标志物组合，从而显示不同的表型。
  5. 使用“cond_rule”函数指定实验特异性条件（例如不同的实验处理）。对于所提供的数据集，条件命名为“GT”和“Diff”，用于描述培养细胞所用的两种不同细胞培养基。该信息将由模块“1_dot_plot”（补充文件 3）用于绘制热图。
  6. 在模块“2_bar_plot”（补充文件 4）中，定义字典“class_dct”，包含感兴趣的离散细胞命运。对于所提供的数据集，感兴趣的细胞命运与“cell_cols”字典中描述的相同。
  7. 定义“conds”（条件）、“or_cells”（原始细胞）、“sym_labs”（对称性标签）和“times”（实验时间点）。这些是绘图所需的重复筛选条件。“conds”再次采用在“cond_rule”中定义的条件，“or_cells”为HSCs和MPPs，“sym_labs”描述分裂类型。
  8. 在模块“2_bar_plot”中，可绘制进展至第6次分裂的细胞。
    注意：所提供的数据集仅包含至第4次分裂的细胞，因此会出现错误提示，但这并不影响脚本的正常运行。
  9. 脚本生成的图像可作为pdf文件在名为“figures”的文件夹中获取。名称为“Test”的文件表示针对相应直方图执行的不同统计检验。

结果

FACS 分选
本方案中呈现的分选设门策略基于广泛认可的策略12,30,31. 对于所示的设门策略 图1，起始材料为先前纯化的脐带血前体细胞 通过 CD34+ 磁性富集，这解释了Lineage阳性细胞比例极低的原因。必须对四种细胞内染料组合（如图中CTV）设置严格的设门，以提高后续分析中峰的分辨率，并准确圈定目标细胞群体。图1D）。如图所示，设门选择的是最大且轮廓更清晰的细胞群。根据我们的经验，每种细胞分裂染料组合出现多个且彼此接近的细胞群，并不反映真实的生物学差异，而可能提示：a）染色步骤未达到最佳状态，或 b）起始细胞群体具有较大的异质性（尤其是细胞大小方面的异质性）。当起始材料为脐带血或其他复杂的生物来源（如骨髓穿刺液、外周血）时，这种情况并不罕见。如果设门范围不够精确，不同染料组合的逐步稀释可能导致后期峰的重叠，尤其是在 CV 和 VC 条件下图 2D次优门控的另一个负面影响是，在细胞培养后无法有效区分不同的峰，因为起始细胞群体的异质性可能导致峰形浅平。

流式细胞术分析；细胞分选示意图；标记的坐标轴 FSC、SSC、APC；CD34、CD38 标记物。
图 1：细胞分选的设门策略。（A）FSC-A 与 SSC-A 图，用于排除碎片和污染细胞。（B）FSC-A 与 FSC-H 图，用于排除双联体和细胞团块。（C）Lin 与 FSC-H 图，用于排除 Lin+ 细胞。（D）CTV 与 CFSE 图，用于明确识别用染料组合 CF、CV、VC 和 VI 染色的细胞。设门应足够严格，以确保包含均一的细胞群体。（E）CD34 与 CD38 图，用于将限制性祖细胞 CD34+CD38+（也称为 HPCs）与多能细胞群 CD34+CD38- 分离开。（F）从 CD34+CD38- 群体中分析 CD45RA 与 CD90，以区分最原始的富集于 HSC（CD90+CD45RA-）的祖细胞、LMPP（CD90midCD45RA+）以及更定向的 MPP（CD90-CD45RA-）。（G）分选索引事件，此处显示其细胞染料组合染色情况，以及（H）表面标记物 CD90 和 CD45RA 的表达。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞培养后的流式细胞术分析
上述数据 图2 代表在多种细胞因子存在下培养 72 小时的人类脐带血造血干细胞（HSCs），这些细胞因子能够支持多种髓系祖细胞和前体细胞的生长。图示各组 2A 至 二维 表示建立各个单细胞之间亲缘关系所需的设门策略，而各图版 2E 至 2G 允许进行细胞表型分析。图中MEPs数量减少可能是由于本代表性实验所用的培养条件所致（图 2F使用不同的细胞因子和培养条件会改变各亚群的相对百分比，这与选择不同的起始细胞进行实验类似。

通过CFSE和CTV标记显示细胞群体的流式细胞术散点图，突出CD34 CD38细胞亚群。
图2：流式细胞术分析的设门策略。（A）FSC-A 对 SSC-A，用于排除碎片和污染细胞。（B）FSC-A 对 FSC-H，用于排除双联体和细胞团块。（C）CTV 对 CFSE，设门“Labeled”可用于排除可能影响数据分辨率的自发荧光事件。（D）CTV 对 CFSE。根据细胞分裂染料的稀释情况，严格设门区分四个细胞群极为重要。（E）CD34 对 CD38，用于区分定向前体细胞（CD34-）、限制性祖细胞（HPC）（CD34+CD38+）和未成熟祖细胞（CD34+CD38-）。（F）CD45RA 对 CD123，用于区分三种类型的限制性祖细胞：CMP（CD123+CD45RA-）、MEP（CD123-CD45RA-）和 GMP（CD123+CD45RA+）。（G）CD45RA 对 CD90，从 CD34+CD38-细胞中识别HSCs、LMPPs和MPPs。请点击此处查看该图的放大版本。

峰的定义与指认步骤（图3 和 图4）是本实验方案中的关键环节，需要设定严格的门控。在进行峰的定义时（图3），至少需要1,000个事件才能实现可靠的识别。因此，在细胞分选步骤中为“Bulk”孔分离更多细胞可能是有益的。图4 展示了四个单孔中包含多个家族的示例。该图阐明了 图2D 和 图3 中门控的重要性，尤其是在识别每个家族及每个峰时。图4A 展示了一个简单的示例，门控CF中的所有细胞彼此非常接近，可轻松归入单一峰。图4C 显示了另一个家族明确分布在两个分离良好的峰上的示例，如 图4D 的直方图中清晰所示。图4E、G 揭示了基于大量事件进行严格门控的重要性；这两个图均显示有少量事件位置接近但位于染料组合门控之外。若仅基于单孔分析，这些事件可能被错误地纳入VI和CF门控中。最后，图4F、H 展示了两个家族分布在多个峰上的不同示例，其中一个为两个强度相似的峰（图4F），另一个为两个强度不同的峰（图4H）。

流式细胞术直方图；CFSE、CTV 数据分析；峰代表细胞增殖阶段。
图 3：流式细胞术分析中的峰定义。 （A-D）应至少记录 500 个事件来定义峰，以确保每个独立峰具有良好的代表性。 （A） CFSE-A 荧光强度的直方图。可识别出多个峰，每个峰对应一个不同的分裂细胞群体。 （B,C） 衍生参数（代表 CFSE-CTV 混合物）CV（B）和 VC（C）的荧光强度直方图。 （D） CTV-A 荧光强度的直方图。 请点击此处查看该图的放大版本。

流式细胞术分析，CFSE 和 CTV 散点图，细胞群体鉴定，数据可视化。
图 4：峰的指认。（A,B）在此孔中，CF 门内仅能检测到一个峰。（C,D）在此孔中，VI 门内可检测到两个强度几乎相等的峰，且峰之间分辨良好。（E,F）在此孔中，VI 门内可检测到两个强度相近的峰。仅考虑了基于混样孔所设定策略的门内事件。（G-H）在此孔中，CF 门内可检测到两个强度不等的峰。请点击此处查看该图的放大版本。

数据表示与统计检验
图5 显示了两次独立实验在细胞培养72小时后不同类型的数据呈现结果。造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）在两种不同的细胞培养基中培养，旨在改变细胞分裂与分化特性。这两种培养基分别命名为“Diff”（分化）32 和“GT”33前者促进髓系和红系分化，因其含有促红细胞生成素（EPO）和粒单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）；后者则是在基因治疗临床试验背景下开发，旨在维持并扩增高比例的造血干细胞与祖细胞（HSPCs）。 图 5A “Diff”条件下的代表性热图，展示了多种细胞谱系，涵盖不同的细胞命运和分裂次数。在该热图中，每一行代表一个独立的谱系，每个方块代表一个单独的细胞，各列则将处于相同世代的细胞进行归类（例如，第2代细胞至少经历了两次分裂）。可以区分出高度同质的谱系，即由单一细胞类型组成且分裂次数相同的谱系（如谱系#63），以及异质性谱系，包含跨越两个世代的三种细胞类型（如谱系#84）。由于该分析的细胞回收率约为70%，因此完整谱系（定义为所有细胞均被回收，可能处于不同世代，例如第1代1个细胞、第2代2个细胞的谱系）较为罕见（其编号旁显示井号标记表示） 图5A）。对于检测不完全的情况，存在多种可能的解释，可能是技术性的（如染色问题、因操作步骤导致的细胞丢失），也可能是生物学性的（如细胞死亡和/或凋亡）。可通过使用专门设计以减少单个样本死体积的分析仪，以及在细胞培养板中直接进行细胞染色以减少移液体积，来克服技术上的局限性。相反地，可采用正交方法来测定细胞死亡程度（例如， 通过 活细胞成像实验）有助于区分导致检测不完全的技术因素与生物学因素。

图 5Bi 展示了如何可视化培养条件对细胞类型组成的影响，如同进行了批量检测一样。在此，Diff 条件促进了更多种类的细胞命运，并提高了 CD34 的百分比+ 细胞（定义为除CD34以外的所有细胞类型）-）。置信区间在脚本中计算得出 通过 基础自举法，包含 250,000 个自举数据集34值得注意的是，其余所有直方图中的 图5 显示以相同方法计算的置信区间。 表5 概括了每一代中家族数量和细胞数量的全部信息。

图5Bii 图示表示在脚本“2_bar_plot”中执行的统计检验结果。有关统计框架的正式描述可查阅相关文档26简而言之，该框架在统计假设检验中假设来自同一谱系的细胞具有相关性（这一假设本身可被检验），这与经典统计学要求所有观测细胞之间相互独立的前提相反。在图中所示的具体案例中，统计检验用于验证一个假设：即多能祖细胞（MPPs）的命运选择（通过培养中不同细胞类型的频率来衡量）是否独立于所使用的细胞培养条件。首先，采用G检验统计量来评估不同培养基条件下细胞类型频率之间的差异（以图中示例为例，在 Bii，该统计量以红条表示）。随后，对数据进行随机化处理 通过 置换，即在两种细胞培养条件下交换整个细胞家族。此举旨在保持家族相关细胞之间的依赖性，同时确保每组中的家族数量与原始数据一致。G检验统计量由随机化后的数据集计算得出。图中蓝色数值表示 5Bii 是针对250,000次置换的G检验统计量。最后， p 通过计算该值来评估原始数据集与置换后数据集分布之间的偏离程度。在本示例中，原始统计量与分布存在显著偏离，从而得到一个较小的值 p 因此否定了MPPs的细胞命运与培养条件无关的假设。

图5C 表示每个最大代次的细胞家族所占的百分比，用于探究不同条件如何改变每个细胞家族的细胞分裂情况。该数据图显示，在72 h时，Diff条件下培养的细胞比GT条件下的细胞完成更多的分裂次数。此处表示的是每个家族的最大代次数，因此，一个包含第1代和第2代细胞的家族被视为第2代。可用于图5B的相同统计框架可用于在统计学上检验细胞分裂与培养条件之间的独立性。

图5D 探讨了不同类型祖先细胞（HSCs 或 MPPs）第一次分裂的对称性/不对称性类型。对于第一代中完整的细胞家族——这是唯一能够明确将两个子细胞确定为姐妹细胞的世代——可定义四种不同类型的对称性/不对称性：“对称未分化”（Sym Undiff）指两个子细胞均保留了亲代细胞表型的家族；“对称分化”（Sym Diff）指两个子细胞具有相同但不同于亲代细胞的表型；“不对称未分化”（Asym Undiff）指仅有一个子细胞保留亲代细胞表型；最后，“不对称分化”（Asym Diff）描述的是两个子细胞具有不同表型，且均不同于亲代细胞的家族。为了在评估这些对称/不对称之命运时获得足够的统计学效力，建议在早期时间点进行 MultiGen 分析，以便观察到更多其后代处于第一代的细胞家族。

最后，图5E展示了不同分裂次数下各类细胞所占的百分比，以揭示细胞在分裂过程中分化模式的演变规律。例如，图中数据显示，细胞会逐渐向CD34-状态转变，仅经过三次分裂后，该类别中检测到的细胞比例就已超过50%。此外，可以推断出多能祖细胞（MPPs）并不倾向于进行自我更新式的分裂，因为仅有少量细胞保留了原始的表型。其中部分结论可通过前文图示中所介绍的统计框架进行验证。

克隆生成示意图、细胞类型分布图、MPP分化分析。
图5：使用脐带血HSPC进行一次72小时实验的数据表示示例。 (A) 选定数据集（HSC，在“Diff”培养基中培养72 h后）的热图。图中每个方块代表单个细胞，按其亲缘关系（行）、经历的分裂次数（列，称为代数）和表型（颜色）进行排列。生物) 比较HSCs和MPPs细胞后代中各类细胞比例在GT条件与Diff条件下的直方图。Bii该图展示了在“2_bar_plot”脚本中对培养72小时的MPPs进行的统计学检验结果，比较了“Diff”与“GT”两种细胞因子组合的效果。实验测得值以红色显示，生成的数值以 通过 250,000 次置换，以蓝色表示。该 p. G检验的P值显示在右上角，括号内为用于检验的家系数量。C) 柱状图比较了每种培养条件下造血干细胞（HSCs）和多能祖细胞（MPPs）各世代（按颜色编码，共314个家族）所占家族百分比。置信区间通过250,000次自助抽样数据集计算得出。D) 直方图表示在第1代含有两个细胞的家族中，子代细胞命运之间对称性/不对称之类型的分布：对称未分化（Sym Undiff，两个子代细胞均保留来源细胞的表型）、对称分化（Sym Diff，两个子代细胞具有相同的表型，且与来源细胞不同）、不对称未分化（Asym Undiff，仅一个子代细胞保留来源细胞的表型）和不对称分化（Asym Diff，两个子代细胞具有不同的表型，且均不类似于来源细胞）。E使用“Diff”培养基培养的MPP细胞按代次分类的细胞类型贡献比例直方图；n = 204个细胞，97个家族。 请点击此处以查看此图的放大版本。

表5：每种实验条件下（细胞来源和细胞培养基）分析的家族数量和细胞数量的描述。 请点击此处下载该表格。

补充文件 1： 请点击此处下载该文件。

补充文件 2： 请点击此处下载该文件。

补充文件 3： 请点击此处下载该文件。

补充文件 4： 请点击此处下载该文件。

讨论

MultiGen 检测是一种高通量、操作简便且成本低廉的检测方法，已被广泛用于淋巴细胞研究23,24,35 和小鼠造血细胞26,27. 此处，我们介绍该方法的一种新进展，可用来解析 离体 人类HSPC承诺的早期阶段，通过短期培养在单细胞水平上研究图6）。单细胞 离体 培养系统通常用于评估造血干细胞和祖细胞向成熟细胞的长期分化命运，但某些分化命运的发生早于其他。36，可能导致分析结果偏向于较少的命运类型。此外，这些培养系统通常缺乏命运决定过程中细胞分裂的相关信息。已有研究表明，最初的命运决定步骤可能早在培养初期即已发生，有时甚至不伴随细胞分裂。26,37，因此短期培养并追踪细胞分裂对于研究早期命运决定至关重要。通过同时追踪细胞的命运、分裂行为及谱系关系，该检测方法能够揭示人类造血干祖细胞（HSPCs）中首次分裂与命运决策的作用。利用该方法，可推断命运承诺过程发生在第几次分裂之后，早期前体细胞自我更新与分化之间的平衡关系，以及这些特性在世代间如何遗传。据我们所知，这是目前唯一可在单细胞分辨率下对人类HSPCs实现上述测量的检测方法。此外，通过使用不同组合的细胞分裂染料，我们提高了分析通量，使该检测成为快速生成大规模数据集的有力工具。染料组合的使用使得在同一孔中可同时追踪多个细胞谱系，从而增加短期培养中可用于分析的细胞数量。未来，染料组合的数量还有望进一步增加。 通过 可添加其他染料（例如黄色染料）或调整CFSE与CTV的比例，但这会减少可分析的其他参数数量。

细胞分选流程图：染料染色、抗体染色、数据分析、统计分析。
图6：实验方案的示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了成功完成分析，由于孔数量较多且待分析的细胞数量较少，必须使用配备微孔板读板器的流式细胞仪进行分析。新一代台式分析仪特别适用于该检测，因为其中大多数仪器具有更小的死体积，可降低细胞损失比例。这反过来保证了从每孔中回收全部细胞的效率更高，据估计效率可达70%左右26。在流式细胞术检测过程中评估细胞损失对于每个细胞家族的分析至关重要。例如，在假设无细胞死亡的前提下，通过计数细胞分裂次数，可估算每个家族的细胞数量。然而，建议进行一些验证性实验，特别是在特定培养条件下对细胞死亡情况进行评估，并通过使用已知数量的细胞进行实验来测定实际回收率。

该方案中一个关键步骤是峰的指认。如前所述，高质量的峰分布很大程度上依赖于细胞分选时获得非常窄的峰。然而，仅根据峰分布来准确指认细胞分裂次数仍然存在困难。由于细胞分选和流式细胞术分析是在两台不同的仪器上进行的，无法直接比较每个信号的强度，因此可能难以判断在直方图右侧末端观察到的第一个峰是第0峰还是第1峰。针对这一问题，有几种可行的解决方案：一种方法是进行正交实验，以精确测量这些细胞所经历的分裂次数（例如，活细胞成像）；另一种方法是在进行流式细胞术分析之前，使用倒置明场显微镜简单计数培养孔中的细胞数量，从而推断出平均分裂次数（假设无细胞死亡）。最后，还有一种事后修正的峰指认方法，即检测是否存在异常数量的“不可能的家系”；这些家系包含每代细胞数超过理论可能的情况（例如，第二代中有五个细胞，或第一代中有两个细胞且第二代中有一个细胞）。在统计分析步骤中已编码了排除“不可能家系”的功能，并会标记出此类家系。如果此类错误出现频率过高，则合理推测峰的指认需要重新校正。

在本实验方案中，我们包含了该检测方法中数据呈现与分析的若干示例，因为这已成为大规模数据生成与解读中的关键步骤38。第一个示例是热图，展示按细胞家族组织的所有被分析细胞的总体情况。这是一种高效工具，可用于探索数据的整体特征及潜在结论：家族是否由多种细胞类型组成，还是倾向于具有同质性？家族是否跨越多个世代，还是主要进行相同次数的分裂？这种探索性分析随后需结合更具体的图表和统计检验加以补充。该方法可用于定量评估对称性与不对称性命运决定、不分裂即分化、自我更新与分化之间的平衡，以及特定命运决定所经历的分裂次数。在实验设计阶段，必须根据所研究问题的类型合理设定细胞培养时长；例如，针对前两个问题（对称/不对称平衡和不分裂即分化），设计较短的培养周期可分离出大量仅经历一次或未发生分裂的细胞家族26。相反，较长周期的实验则有助于探究特定细胞命运决定所需的分裂次数，因为它能够采集处于不同分化阶段的细胞家族。然而，该方法并不适用于长期培养（2–3周），因为细胞染料稀释无法准确追踪超过七到八次的细胞分裂22。因此，该技术主要适用于研究造血祖细胞的早期命运决定，而不适用于对其长期分化特性的可靠结论。

该统计框架是专门为分析此类数据而开发的，其基础是置换概念26。之所以需要这样做，是因为观察到细胞类型分布及细胞分裂次数存在家族依赖性。换句话说，属于同一家族的细胞更可能表现出相似的表型，并进行相同次数的分裂。尽管深入分析超出了本研究的范围，但所提供的统计检验方法在评估不同条件时应已足够。

总之，该方案是评估造血干细胞和祖细胞细胞动力学的有力工具 离体以快速且经济的方式进行。由于其在分析时间点、培养条件和所分析的HSPC类型方面具有灵活性和多功能性，因此可用来测试多种实验条件。作为一种基于流式细胞术的检测方法，它可在大多数实验室中实施，且不需要 extensive prior knowledge，使其成为筛选实验和预实验的理想选择。

披露

作者声明本研究不存在任何利益冲突。资助方在研究设计、数据收集与解释，以及决定提交论文发表等过程中均未发挥任何作用。

致谢

我们感谢居里研究所流式平台成员在建立流式细胞术实验过程中提供的帮助。我们还要感谢Perié研究团队其他成员在多次讨论中的贡献。感谢Julia Marchingo博士和Phil Hodgkin教授（Walter and Eliza Hall医学研究所）分享他们在淋巴细胞细胞分裂染料多重标记方面的实验方案。感谢圣路易医院脐带血生物样本库为本实验方案的开发提供了必要的生物资源。本研究获得了法国国家科学研究中心（CNRS）和贝当古-舒勒基金会（Bettencourt-Schueller Foundation）ATIP-Avenir项目资助（授予L.P.），Labex CelTisPhyBio 项目（ANR-10-LBX-0038）（授予L.P.和A.D.），巴黎科学与文学大学（Paris-Science-Lettres）Idex项目（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）（授予L.P.），法国国家癌症研究所（INCA）Canceropole新兴项目（2021-1-EMERG-54b-ICR-1，授予L.P.），以及ITMO MIIC项目（21CM044，授予L.P.）的资助。此外，本研究还获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下“ERC StG 758170-Microbar”项目（授予L.P.）的资助。A.D.获得了法国基金会（Fondation de France）博士后奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL聚丙烯微量离心管vWR87003-294
15 mL聚丙烯管vWR734-0451
50 mL聚丙烯管vWR734-0448
96孔U型底培养板 Falcon353077
抗人 Lin APC赛默飞世尔科技22-7776-72稀释比例 1/40
ARIA IIIBD可替换为任何能够将单个细胞分选至96孔板的FACS分选仪
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）Life TechnologiesC34570
细胞示踪紫（CTV） Life TechnologiesC34571
补偿微珠 BD552843
杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）Life Technologies11320033
乙二胺四乙酸（EDTA）赛默飞世尔科技J62948-36在无菌水中配制 0.5 M 溶液
FC 封闭 Fc1.3216BD564220稀释比例 1/50
胎牛血清（FBS）DutscherS1900-500CS00CH 批次
FlowJo v10.8.1BD
小鼠抗人 CD10 PerCP-5.5，克隆号 HI10aBiolegend312216稀释比例 1/20
小鼠抗人 CD123 BUV395，克隆 7G3BD564195稀释比例 1/15
小鼠抗人 CD34 APC-Cy7，克隆 581Biolegend343513稀释比例 1/40
小鼠抗人 CD38 BV650，克隆 HB7Biolegend356620稀释比例 1/40
小鼠抗人 CD45RA AF700，克隆号 HI100BD560673稀释比例 1/20
小鼠抗人 CD45RA PE-Cy7，克隆 HI100BD560675稀释比例 1/20
小鼠抗人 CD90 PE，克隆 5E10Biolegend328110稀释 1/20
磷酸盐缓冲液（PBS）1XLife Technologies10010001
Python
R
无菌12x75 mm锥形聚丙烯管Falcon
ZE5 伯乐（Bio-Rad）可替换为任何配备微孔板读取功能的流式细胞仪
<强>实验室制备
细胞培养基根据具体实验而定。每日新鲜配制，并于+4℃保存 °C，直至使用
DMEM + 10% FBS可在无菌条件下于 +4 ℃ 保存 °C 可保存长达 1 年。配制 500 mL 时，将 50 mL FBS 加入 450 mL DMEM 中
PBS 1X + EDTA 0.1%可在无菌条件下于室温保存，最长1年。制备500 mL时，将3.42 mL 0.5 M EDTA加入500 mL 1× PBS中
染色缓冲液可在无菌条件下于 +4 ℃ 保存 °C，最长可保存1年。配制500 mL时，向500 mL 1× PBS中加入2 mL 0.5 M EDTA和1 mL胎牛血清（FBS）。

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