利用单链DNA免疫荧光法量化卵巢癌细胞中的复制应激

摘要

本文介绍了一种基于免疫荧光的方法，用于定量细胞中单链DNA的水平。该方法高效且可重复，可用于检测复制应激，而复制应激是多种卵巢癌的常见特征。此外，该检测方法可与自动化分析流程兼容，进一步提高其检测效率。

摘要

复制应激是多种卵巢癌的特征之一。复制应激可源于多种因素，包括双链断裂、转录与复制冲突或扩增的癌基因，最终导致单链DNA（ssDNA）的产生。因此，定量ssDNA为评估不同类型细胞以及在不同DNA损伤条件或处理下的复制应激水平提供了机会。新兴证据还表明，ssDNA可作为预测细胞对靶向DNA修复通路化疗药物反应的指标。本文介绍了一种基于免疫荧光的详细方法用于定量ssDNA。该方法包括使用胸腺嘧啶类似物标记基因组，随后在非变性条件下通过抗体检测染色质中的该类似物。ssDNA区域可在荧光显微镜下表现为明显的荧光焦点。焦点的数量和强度与细胞核内ssDNA的含量直接相关。我们还描述了一种自动化的ssDNA信号定量分析流程。该方法快速且可重复。此外，由于该方法操作简便，适用于高通量应用，如药物筛选和遗传筛选。

引言

基因组DNA经常受到来自各种内源性和外源性因素的多重攻击¹。内源性损伤的频率与代谢副产物（如活性氧或醛类）的水平直接相关，而这些副产物在多种癌症类型（包括卵巢癌）中的本底水平较高^2,3。必须高效地修复DNA损伤；否则，可能引发基因毒性损伤，进而导致突变。细胞修复基因毒性损伤的能力依赖于无错误DNA修复通路的功能完整性，以及在DNA损伤发生时对细胞周期进程的有效调控。值得注意的是，许多卵巢癌携带p53的功能失活性突变，因而G1/S检查点存在缺陷，导致细胞即使存在未修复的基因组损伤，仍启动DNA复制^4,5。此外，超过50%的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）存在介导同源重组的BRCA1和BRCA2相关缺陷——这是无错误的DNA修复通路；约20%的病例存在CCNE1基因扩增，促使G1期细胞过早进入S期⁶，进一步加剧了卵巢癌中的DNA损伤程度。内源性DNA损伤频率高、检查点缺陷以及修复通路功能障碍共同作用，使卵巢癌中基因组损伤的积累呈指数级增长。这些损伤可阻碍DNA复制和转录等关键细胞过程的正常进行。如下文所述，此类阻碍会催化细胞内单链DNA（ssDNA）的产生。

DNA的双螺旋结构对于保护基因组免受多种致突变过程的损害至关重要，例如自发性脱嘌呤和脱嘧啶、胞嘧啶脱氨酶的活性以及氧化性DNA损伤^1,7。相比之下，单链DNA（ssDNA）对这些突变事件极为敏感。细胞内的多种过程可导致单链DNA的产生（图1），包括以下情况：

（i）DNA 复制机器的停滞：这会导致 DNA 解旋酶与聚合酶解偶联，从而留下单链 DNA 区域^8,9。

（ii）转录机器的停滞：RNA聚合酶的持续停滞会导致形成一种称为R环的三链杂合DNA/RNA结构。R环的形成使被置换的非模板链DNA以单链形式暴露出来¹⁰。

（iii）DNA末端切除：同源定向修复的启动需要产生3'单链DNA，以催化对同源序列的搜索¹¹。

（iv）D环：同源重组过程中的链侵入可能导致非模板互补链被置换，从而产生单链DNA¹²。

（v）复制偶联的缺口：在DNA复制过程中，滞后链的合成以不连续的方式进行，首先生成冈崎片段，随后将其连接。若冈崎片段的加工发生延迟或存在缺陷，也可能导致单链DNA（ssDNA）的形成。最后，若前导链上的复制叉遇到阻碍性损伤，DNA聚合酶和引物酶PRIMPOL可在下游重新起始合成，从而在后方留下单链DNA缺口^13,14。

显然，这些事件大多发生在DNA复制机器遇到基因组损伤时，或在与复制偶联的修复过程中，这表明更高的DNA损伤会导致单链DNA（ssDNA）水平升高。由于这些事件中有许多与复制相关，因此ssDNA的形成被认为是细胞中"复制应激"的标志^15,16。

本文描述了一种可用于可靠地定量细胞中单链DNA（ssDNA）的检测方法。该方法具有操作简便、可重复性强和成本较低的优点，适用于评估细胞的复制应激反应。近期研究表明，ssDNA的水平还可作为预测细胞对化疗药物反应的指标，例如PARP1/2酶抑制剂、ATR抑制剂和Wee1激酶抑制剂^{17,18,19,20,21}。这些抑制剂目前正在多种高级别浆液性卵巢癌（HGSOCs）的治疗方案中进行研究²²。因此，该检测方法也可作为预测卵巢癌细胞对化疗反应的有效工具。

方案

注意：这些步骤中使用了卵巢癌细胞系 OVCAR3，但本方案广泛适用于其他多种细胞系，包括来源于非卵巢组织的细胞系。本方案的示意图见图2。

1. 细胞接种

1. 制备多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。
   1. 将已灭菌的直径为12 mm的盖玻片加入含有多聚-L-赖氨酸溶液的50 mL锥形管中，置于摇床上孵育15分钟。
   2. 在组织培养超净台中吸除溶液，加入无菌水清洗盖玻片，并将装有盖玻片的锥形管重新置于摇床上振荡5分钟。重复此清洗步骤三次。
   3. 将包被后的盖玻片平铺于无菌培养皿中，吸除残留水分，在组织培养超净台中干燥1小时，或直至无可见水滴。干燥后用封口膜密封培养皿，并置于4 °C保存。
2. 将一片多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入24孔板的每个孔中。使用多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片至关重要，可防止细胞在预提取步骤中从盖玻片上脱落。
3. 当OVCAR3细胞生长至70%–80%融合度时，进行胰酶消化。
   1. 对于一个70%–80%融合的10 cm培养皿，先吸除培养基，用5–7 mL PBS洗涤一次。
   2. 吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰酶溶液，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育8–10分钟，或直至细胞从培养皿底部脱落。
   3. 用5–10 mL培养基收集细胞，并转移至锥形管中。
   4. 按照标准操作流程，使用血细胞计数板手动计数细胞。
4. 将细胞稀释至25,000 个/mL，每孔加入1 mL细胞悬液至24孔板各孔内的多聚-L-赖氨酸包被盖玻片上。对于其他任何细胞系，应确定合适的接种数量，以确保细胞在经历三次群体倍增后达到约70%–80%融合度。
5. 将细胞置于标准培养条件下，在培养基中继续培养。

2. 用IdU脉冲处理细胞

1. 为使细胞在盖玻片上充分铺展，一次群体倍增即可。在一次群体倍增后，使用 10 µM 5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）（IdU 的重悬方法见材料表）对细胞进行脉冲标记，并持续覆盖接下来的两个群体倍增周期。
   注意：我们已尝试多种胸腺嘧啶类似物，包括溴脱氧尿苷（BrdU）、5-氯-2′-脱氧尿苷（CIdU）和 IdU。在三种类似物中，IdU 具有最佳的信噪比。使用三种不同类似物脉冲标记的细胞的对比图像见图3。我们建议使用两种阴性对照：（i）未进行 IdU 脉冲标记的样本，（ii）无一抗对照。如果需要评估特定处理引起的单链 DNA（ssDNA）形成，建议在第一轮 IdU 倍增后添加药物。
2. 在使用 IdU 脉冲标记两个群体倍增周期后，收集细胞用于成像。
   1. 将培养基替换为预冷的含 0.5% Triton X-100 的 PBS（即 0.5% PBSTx），冰上孵育 5 分钟。此预提取步骤有助于释放胞质和非染色质结合的蛋白质，同时保留染色质结合的蛋白质。 某些细胞系在预提取过程中容易脱落。在此情况下，可使用 0.5% CSK 缓冲液（10 mM PIPES（pH 6.8）、100 mM NaCl、300 mM 蔗糖、3 mM MgCl₂、1 mM EGTA 和 0.5% Triton X-100）。

3. 固定

1. 吸去 PBSTx，于室温下用 3% PFA（材料表）孵育 15 分钟，随后用 1× PBS 洗涤 3 至 4 次。固定后的细胞可于 4 °C 保存，待后续步骤使用。
   ​注意：PFA 具有高毒性且为致癌物。避免接触皮肤、眼睛和黏膜。所有涉及 PFA 的操作均应在通风橱中进行，并妥善处理废弃物。

4. 透化与封闭

1. 固定后，在冰上用 0.5% PBSTx 对细胞进行透化处理，持续 5 分钟。使用足够体积以完全覆盖整个盖玻片（通常为 500 µL 至 1 mL）。
2. 用 0.2% PBST（1× PBS + 0.2% Tween-20）在室温下洗涤细胞三到四次，每次使用 1 mL PBST 即可洗涤一个孔。连续进行洗涤，中间不进行任何孵育步骤。
3. 吸除 PBST，然后在室温下用含 5% BSA（材料表）的 1× PBS（封闭缓冲液）封闭样本，持续 30 分钟。

5. 使用IdU抗体进行免疫染色

1. 进行免疫染色时，准备一个加湿染色盒（在平底塑料盒内放置湿润的纸巾）。用封口膜覆盖24孔板的盖子，将其放入加湿染色盒中，并将盖玻片放置在孔板盖子上。
2. 用步骤4.2中的封闭缓冲液按1:200稀释抗BrdU小鼠一抗（材料表）。已有研究表明该抗BrdU抗体可检测IdU。
3. 在盖玻片表面加入60 µL IdU抗体稀释液，在37 °C孵育1小时。
   1. 或者，可将盖玻片倒扣在封口膜上预先滴加的抗体稀释液液滴（20–25 µL，1:200稀释）上，以减少抗体溶液用量。此方法也可降低孵育过程中溶液干燥的风险。
4. 孵育1小时后，吸除一抗溶液。将盖玻片放回24孔板中，用0.2% PBST洗涤四次。
5. 对于二抗孵育，使用步骤5.1中所述的同一加湿染色盒。将偶联的抗小鼠二抗（材料表）用封闭缓冲液按1:200稀释。在盖玻片上加入60 µL二抗溶液，避光、室温孵育1小时。该二抗对光敏感。
6. 吸除二抗溶液。将盖玻片放回24孔板中，用0.2% PBST洗涤四次。
7. 标记载玻片，并用含DAPI的封片剂（材料表）将盖玻片封固于载玻片上。将载玻片避光、室温放置24小时。若封片剂需要固化或硬化，建议孵育24小时。
   注：载玻片可在荧光显微镜观察前于4 °C保存。代表性图像见图4。

6. IdU 焦点的自动化定量分析

注意：该检测方法的优势在于能够自动化分析，从而实现快速高效的定量。本文展示了一条自动化分析流程，可用于定量给定图像视野中的IdU焦点。在同一个实验中，所有图像必须采用相同的曝光参数拍摄，否则定量结果将不可靠。建议至少在首次运行该实验时，加入未染色对照作为阴性对照（图5）。以下方案专用于NIS通用分析软件，但相同原理也可适用于其他商业软件。

1. 在 视图 选项卡中，进入 分析控制 | 分析资源管理器。这将打开一个名为 分析资源管理器 的新侧边窗口。点击 创建新项目 | 通用分析 3。这将启动分析资源管理器流程图创建软件。
2. 转到 数据源 选项卡，从左侧菜单中将 通道 命令拖动到工作区域。DAPI 和 IdU 焦点的两个通道将自动以二值化方框形式弹出（如 图5 中红框所示）。
3. 进入 预处理 选项卡，从左侧菜单中将 局部对比度 命令拖至工作区。将 局部对比度 与 IdU 焦点通道连接。从 分割 选项卡中，拖动 阈值 命令（每个通道各一个）。
4. 将每个通道连接至一个 阈值 命令。为消除图像边缘处的任何细胞核，请进入 二值化处理 选项卡，拖动 接触边界 命令，并将其连接至 DAPI 阈值。
5. 使用 测量 选项卡中的 聚合子代 命令合并两个通道的数据。将 DAPI 通道定义为父代（A），焦点通道定义为子代（B）。在 聚合子代 命令的下拉菜单中，选择选项 子代位于父代内部。此步骤有助于统计每个细胞核（父代）内的焦点（子代）数量。
   1. 要以表格格式导出数据，请点击 数据管理 选项卡中的 修改列 命令。在 修改列 命令的下拉菜单中，选择 DAPI-ID（这有助于为每幅图像中的每个细胞核分配唯一编号）和 IdU 计数（这提供每个细胞核中 IdU 焦点的数量）。要以 CSV 格式导出数据，请使用 参考 选项卡中的 表格转 CSV 命令。现在可以使用描述性标题保存 GA3。
6. 进行分析时，在软件中打开一幅图像。
   1. 像步骤 6.1 中一样打开 分析资源管理器 选项卡，并找到新创建的 GA3。双击 GA3 文件，将打开一个名为 GA3 向导 的新窗口，在其中可以设置 DAPI 和 IdU 通道的阈值。
   2. 使用窗口中的滑块设置每个通道的最小和最大阈值，从而定义信号。理想的阈值应使每个细胞核和 IdU 焦点的边界清晰可辨。一旦确定满意的阈值，应在分析特定实验中的所有文件时保持这些数值不变。
   3. 点击 运行 按钮，以获得每个细胞核的 IdU 焦点计数。
      注意：软件将生成每个细胞核的焦点数量表格，可用于后续作图分析（图5）。

结果

图 4 展示了未经处理的细胞以及经 0.5 mM 羟基脲处理 24 小时后细胞核中 IdU 焦点的代表性图像及其定量结果。图 4 中两个细胞核均在 DAPI 通道中被染色并可识别。对这些图像的分析包括量化每个细胞核中的焦点数量。焦点数量与复制应激程度成正比。

图1：单链DNA生成的机制。 示意图展示细胞内生成单链DNA（ssDNA）的不同机制，包括（A）复制机器的停滞，（B

讨论

如实验方案中所述，加入一些实验对照以确保检测的可靠性是非常重要的。这些对照包括未用IdU处理的样品以及未加一抗的样品。两种阴性对照均应显示细胞被DAPI染色，但无IdU信号。

根据所使用的实验条件和细胞系，可能需要使用不同的抗体稀释度以获得最佳荧光信号。信号过强可能导致无法定量单个焦点，而信号过弱则可能无法识别样品间的实验差异。如果背景信号过高，调整预提取和通透时间也可能有所帮助，因为过高的背景可能源于未被充分去除的核浆成分。

由于本实验方案需要在两次群体倍增期间掺入IdU，因此必须考虑每种细胞系的倍增时间。当比较具有不同倍增时间的两种细胞系时，必须根据每种细胞系的倍增时间调整IdU脉冲标记的持续时间。然而，这可能会引入一定程度的变异。因此，该检测方法在比较具有相似倍增时间的细胞系时最为有效。如果倍增时间未知，则可能需要预先进行实验优化。

此外，该检测方法可能低估细胞中某一时刻存在的单链DNA（ssDNA）的实际数量。只有当互补链被IdU标记时，ssDNA才能被识别为焦点...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 多聚甲醛（PFA）	Fisher Scientific	NC0179595	将10 g蔗糖加入100 mL 10X PBS中，加水至总体积为925 mL。加入75 mL 40%无甲醇PFA，混匀后分装为50 mL每份，然后储存 储存条件：-20 °C保存
5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）	Sigma Aldrich	I7125-5G	分子量 = 354.10 g/mol。配制10 mM储存液：将3.541 mg IdU溶解于1 mL 1 N液氨中 储存条件：-20 °C保存
抗BrdU抗体	BD Biosciences	347580	储存条件：4 °C保存
抗小鼠Alexa Fluor Plus 488二抗	Thermo Scientific	A32766	避光——需避光保存 储存条件：4 °C保存
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A7906-100G	将特定质量的BSA加入一定体积的PBS中配制 储存条件：4 °C保存
圆形盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 软件	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	培养基：RPMI培养基，添加L-谷氨酰胺、0.01 mg/mL牛胰岛素、胎牛血清至终浓度20%，以及1X青霉素-链霉素 储存条件：冻存液为完全培养基加5% DMSO，-80 °C保存
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma Aldrich	P4832-50ML	储存条件：4 °C保存
含DAPI的ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂	Thermo Scientific	P36962	储存条件：4 °C保存
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Genesee Scientific	25-510	储存条件：4 °C保存
无菌过滤水	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	储存条件：4 °C保存