本文介绍了一种基于免疫荧光的方法，用于定量细胞中单链DNA的水平。该方法高效且可重复，可用于检测复制应激，而复制应激是多种卵巢癌的常见特征。此外，该检测方法可与自动化分析流程兼容，进一步提高其检测效率。
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本文内容
摘要
摘要
复制应激是多种卵巢癌的特征之一。复制应激可源于多种因素，包括双链断裂、转录与复制冲突或扩增的癌基因，最终导致单链DNA（ssDNA）的产生。因此，定量ssDNA为评估不同类型细胞以及在不同DNA损伤条件或处理下的复制应激水平提供了机会。新兴证据还表明，ssDNA可作为预测细胞对靶向DNA修复通路化疗药物反应的指标。本文介绍了一种基于免疫荧光的详细方法用于定量ssDNA。该方法包括使用胸腺嘧啶类似物标记基因组，随后在非变性条件下通过抗体检测染色质中的该类似物。ssDNA区域可在荧光显微镜下表现为明显的荧光焦点。焦点的数量和强度与细胞核内ssDNA的含量直接相关。我们还描述了一种自动化的ssDNA信号定量分析流程。该方法快速且可重复。此外，由于该方法操作简便，适用于高通量应用，如药物筛选和遗传筛选。
引言
基因组DNA经常受到来自各种内源性和外源性因素的多重攻击1。内源性损伤的频率与代谢副产物（如活性氧或醛类）的水平直接相关，而这些副产物在多种癌症类型（包括卵巢癌）中的本底水平较高2,3。必须高效地修复DNA损伤；否则，可能引发基因毒性损伤，进而导致突变。细胞修复基因毒性损伤的能力依赖于无错误DNA修复通路的功能完整性，以及在DNA损伤发生时对细胞周期进程的有效调控。值得注意的是，许多卵巢癌携带p53的功能失活性突变，因而G1/S检查点存在缺陷，导致细胞即使存在未修复的基因组损伤，仍启动DNA复制4,5。此外，超过50%的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）存在介导同源重组的BRCA1和BRCA2相关缺陷——这是无错误的DNA修复通路；约20%的病例存在CCNE1基因扩增，促使G1期细胞过早进入S期6，进一步加剧了卵巢癌中的DNA损伤程度。内源性DNA损伤频率高、检查点缺陷以及修复通路功能障碍共同作用，使卵巢癌中基因组损伤的积累呈指数级增长。这些损伤可阻碍DNA复制和转录等关键细胞过程的正常进行。如下文所述，此类阻碍会催化细胞内单链DNA（ssDNA）的产生。
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方案
注意：这些步骤中使用了卵巢癌细胞系 OVCAR3，但本方案广泛适用于其他多种细胞系，包括来源于非卵巢组织的细胞系。本方案的示意图见图2。
1. 细胞接种
- 制备多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片。
- 将已灭菌的直径为12 mm的盖玻片加入含有多聚-L-赖氨酸溶液的50 mL锥形管中，置于摇床上孵育15分钟。
- 在组织培养超净台中吸除溶液，加入无菌水清洗盖玻片，并将装有盖玻片的锥形管重新置于摇床上振荡5分钟。重复此清洗步骤三次。
- 将包被后的盖玻片平铺于无菌培养皿中，吸除残留水分，在组织培养超净台中干燥1小时，或直至无可见水滴。干燥后用封口膜密封培养皿，并置于4 °C保存。
- 将一片多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片放入24孔板的每个孔中。使用多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片至关重要，可防止细胞在预提取步骤中从盖玻片上脱落。
- 当OVCAR3细胞生长至70%–80%融合度时，进行胰酶消化。
- 对于一个70%–80%融合的10 cm培养皿，先吸除培养基，用5–7 mL PBS洗涤一次。
- 吸除PBS，加入1 mL 0.25%胰酶溶液，将培养皿置于37 °C培养箱中孵育8–10分钟，或直至细胞从培养皿底部脱落。
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结果
图 4 显示了未经处理的细胞以及经 0.5 mM 羟基脲处理 24 小时后细胞核中 IdU 焦点的代表性图像及其定量结果。图 4 中两个细胞核均在 DAPI 通道中被染色并可识别。对这些图像的分析包括量化每个细胞核中的焦点数量。焦点数量与复制应激程度成正比。
图1：单链DNA生成的机制。 示意图展示细胞内生成单链DNA（ssDNA）的不同机制。包括（A）复制机器的停滞，（B
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讨论
如实验方案中所述，加入一些实验对照以确保检测的可靠性是非常重要的。这些对照包括未用IdU处理的样品以及未加一抗的样品。两种阴性对照均应显示细胞被DAPI染色，但无IdU信号。
根据所使用的实验条件和细胞系，可能需要使用不同的抗体稀释度以获得最佳荧光信号。信号过强可能导致无法定量单个焦点，而信号过弱则可能无法识别样品间的实验差异。如果背景信号过高，调整预提取和通透时间也可能有所帮助，因为过高的背景可能源于未被充分去除的核浆成分。
由于本实验方案需要在两次群体倍增期间掺入IdU，因此必须考虑每种细胞系的倍增时间。当比较具有不同倍增时间的两种细胞系时，必须根据每种细胞系的倍增时间调整IdU脉冲标记的持续时间。然而，这可能会引入一定程度的变异。因此，该检测方法在比较具有相似倍增时间的细胞系时最为有效。如果倍增时间未知，则可能需要预先进行实验优化。
此外，该检测方法可能低估细胞中某一时刻存在的单链DNA（ssDNA）的实际数量。只有当互补链被IdU标记时，ssDNA才能被识别为焦点.......
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致谢
PV 获得了巴恩斯-犹太医院基金会通过阿尔文·J·西特曼癌症中心资助的首届“Pedal the Cause”项目资助、玛丽·凯·阿什基金会卵巢癌研究玛莎·里夫金中心的试点研究资助以及癌症研究资助，以及V基金会的资助。NR 获得了美国国立卫生研究院（NIH）细胞与分子生物学培训T32项目对圣路易斯华盛顿大学的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3% 多聚甲醛（PFA） | Fisher Scientific | NC0179595 | 将10 g蔗糖加入100 mL 10X PBS中，加水至总体积为925 mL。加入75 mL 40%无甲醇PFA，混匀后分装为50 mL每份，然后储存 储存条件：-20 °C保存 |
| 5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU） | Sigma Aldrich | I7125-5G | 分子量 = 354.10 g/mol。配制10 mM储存液：将3.541 mg IdU溶解于1 mL 1 N液氨中 储存条件：-20 °C保存 |
| 抗BrdU抗体 | BD Biosciences | 347580 | 储存条件：4 °C保存 |
| 抗小鼠Alexa Fluor Plus 488二抗 | Thermo Scientific | A32766 | 避光——需避光保存 储存条件：4 °C保存 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | A7906-100G | 将特定质量的BSA加入一定体积的PBS中配制 储存条件：4 °C保存 |
| 圆形盖玻片 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 软件 | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | 培养基：RPMI培养基，添加L-谷氨酰胺、0.01 mg/mL牛胰岛素、胎牛血清至终浓度20%，以及1X青霉素-链霉素 储存条件：冻存液为完全培养基加5% DMSO，-80 °C保存 |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma Aldrich | P4832-50ML | 储存条件：4 °C保存 |
| 含DAPI的ProLong Diamond抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Scientific | P36962 | 储存条件：4 °C保存 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 储存条件：4 °C保存 |
| 无菌过滤水 | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | 储存条件：4 °C保存 |
参考文献
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D'Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamen....
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重印与许可
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