本方案描述了一种从人和非人灵长类动物尿液来源细胞中分离、扩增并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法，以及新生成的iPSCs在无饲养层条件下的维持培养操作指南。
本方案描述了一种从人和非人灵长类动物尿液来源细胞中分离、扩增并重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法，以及新生成的iPSCs在无饲养层条件下的维持培养操作指南。
研究灵长类多能干细胞及其分化产物的跨物种方法对于深入理解疾病、发育和进化的分子与细胞机制至关重要。为了提高灵长类诱导性多能干细胞（iPSCs）的可及性，本文介绍了一种非侵入性方法，可从尿液来源细胞中获得人和非人灵长类iPSCs，并采用无饲养层的培养体系对其进行维持。
尿液可从非无菌环境（例如动物笼具）中采集，并在原代细胞培养期间使用广谱抗生素混合物处理，以有效减少污染。在扩增尿源性细胞后，通过改良的转导方法利用 commercially available Sendai virus vector system（市售仙台病毒载体系统）生成诱导多能干细胞（iPSCs）。首先 iPSC 克隆在 5 天后可能已可见，最早可在 10 天后进行挑取。使用无酶解离缓冲液进行常规团块传代，可维持所获得 iPSC 超过 50 代的多能性。
人类与非人灵长类动物（NHPs）的基因组比较对于理解我们的进化历史以及人类特有性状的演化至关重要1。此外，这些比较还可通过识别保守的DNA序列来推断功能2，例如用于优先筛选与疾病相关的变异位点3。对基因表达水平等分子表型的比较对于更深入解读基因组差异、发现细胞层面的表型差异具有重要意义。同时，它们与DNA水平的比较类似，具有推断功能相关性的潜力，从而有助于更好地解释人类内部具有医学意义的遗传变异4。将全面的分子表型数据整合到这些比较研究中，需要合适的生物学资源（即跨物种的同源细胞）。然而，由于伦理和实际操作上的限制，获取此类可比细胞，尤其是在发育过程中的细胞，往往困难甚至不可能。诱导性多能干细胞（iPSCs）能够在体外生成这些难以获取的细胞类型in vitro5,6，具有良好的实验可及性，并已被广泛应用于灵长类动物的比较研究6,7,8,9,
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本实验方案已获得人类实验伦理委员会（20-122，Ethikkommission LMU München）的批准。所有实验均按照相关指南和规定进行。
注意：在开展涉及人类和非人灵长类动物（NHP）样本的实验前，必须获得相应伦理委员会的批准。所有实验操作均须遵循相关指南和规定。以下每个步骤均须在生物安全柜中采用无菌技术进行。所有缓冲液和培养基的组成详见补充表 S1。确保所有培养基在加入细胞前已预热至室温（22 °C）。除非特别说明，每次离心步骤均须在室温下进行。
1. 从尿液样本中分离细胞
警告：确保人类供体无艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）。对于非人灵长类动物（NHP），应确保潜在供体/细胞无特定病原体——B病毒（BV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴嗜T细胞病毒（SRV）和猴T细胞白血病病毒（STLV）。
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从人和非人灵长类动物（NHP）尿液中分离细胞时，可在分离后直接识别出不同类型的细胞。鳞状细胞以及多种较小的圆形细胞会随尿液排出；女性尿液中的鳞状细胞数量远多于男性尿液（图1B - 第0天；补充图S1）。在初级尿液培养基中培养5天后，可观察到首批贴壁增殖的细胞（图1A、B - 第5天）。此时开始，每天更换一半培养基为REMC增殖培养基，直至出现首批细胞集落。大约在第13天时，贴壁细胞形成较大的集落，可进行传代（图1B - 第13天）。这些集落由两种形态学上不同的细胞类型构成：一种呈上皮样表型，细胞排列紧密；另一种呈间充质样形态，细胞呈细长形，迁移能力较强（图1C）。首次传代后，尿源性细胞以单层形式生长，当培养皿中细胞融合度达到80%时即可再次传代（图1B - 第17天.......
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诱导多能干细胞（iPSCs）是一类有价值的细胞类型，因为它们能够在体外生成其他方式难以获得的细胞类型。in vitro。由于重编程的起始材料（例如成纤维细胞）并非在所有灵长类物种中都容易获取，本文提供了一种从尿液来源细胞生成iPSCs的实验方案。这些细胞可以通过添加广谱抗生素的培养基，以非侵入性方式获得，甚至可从非无菌的灵长类尿液样本中分离。
该方案中有几个关键步骤值得进一步讨论。首先，在从非无菌尿液中分离细胞时，重要的是在培养基中添加广谱抗菌试剂，以降低污染风险。即使使用了抗生素，若仍出现明显的微生物污染生长，则建议丢弃整个培养物并对操作区域进行消毒；此外，根据我们的经验，继续培养无法获得健康生长的尿源性细胞。其次，在开始重编程细胞时，强烈建议制备多个接种了不同数量SeV转导细胞的培养皿，以避免因细胞过度融合导致所有细胞脱落，并提高获得诱导多能干细胞（iPSC）的概率。通常情况下，接种较高密度的SeV转导细胞有望获得更多的重编程iPSC克隆，而将重编程细胞培养约20天则常常导致过度融合，继而引起整个孔内细胞的脱落。第三，在需要解离iPSC的每一步操作中，至关重要.......
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作者声明无利益冲突。
本工作由 DFG EN 1093/5-1（项目编号 458247426）资助。M.O. 受日本学术振兴会（JSPS）海外研究奖学金支持。所有图示使用 BioRender.com 制作。流式细胞术在慕尼黑生物医学中心核心设施流式细胞术平台的协助下完成。我们谨向 ASHBi 的 Makoto Shida 和 Tomoyo Muto 表示感谢， 京都大学，感谢其对视频拍摄的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Accumax™ 细胞解离液（解离溶液） | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| 两性霉素B溶液 | Merck | A2941-100ML | |
| 抗人TRA-1-60小鼠抗体 | Stem Cell Technologies | 60064 | 稀释比例：1/200 |
| 抗人TRA-1-60 PE标记抗体 | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | 稀释比例：1/50 |
| Bambanker™（细胞冻存培养基） | Nippon Genetics | BB01 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| 细胞培养多孔板，12孔CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II 自动细胞计数仪 | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL 带二维条码的冻存管（冻存管） | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | 可用于冻存的冻存管类型多样。带二维条码的冻存管优势在于可将样本信息与唯一的管编号一同存储于数据库中。 |
| CytoTune™ EmGFP 副流感病毒荧光报告系统（GFP副流感病毒） | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 副流感病毒重编程试剂盒（副流感病毒重编程试剂盒） | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM高糖培养基 | TH.Geyer | L0102 | |
| 含L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基 | Fisher Scientific | 15373541 | |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | 稀释比例：1/500 |
| 驴抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | 稀释比例：1/500 |
| 不含钙、不含镁的DPBS | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM重组多克隆兔抗体（22 HCLC） | Thermo Fisher Scientific | 710524 | 稀释比例：1/500 |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon 15 mL锥底离心管 | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon 50 mL锥底离心管 | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| 胎牛血清，经鉴定，热灭活，巴西来源（FBS） | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| 猪皮明胶 | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-free、hESC认证、低生长因子基底膜基质 | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ 添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2培养箱 | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe生物安全柜 | Kendro | 51017905 | |
| 人EGF，优质级 | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | 版本 2.9.0 | |
| MEM非必需氨基酸溶液（100X） | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| 聚丙烯微量离心管，1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| 尼康Eclipse TE2000-S显微镜 | Nikon | TE2000-S | |
| 小鼠抗甲胎蛋白抗体 | R&D Systems | MAB1368 | 稀释比例：1/100 |
| 小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白抗体 | R&D Systems | MAB1420 | 稀释比例：1/100 |
| 小鼠抗β-III微管蛋白抗体 | R&D Systems | MAB1195 | 稀释比例：1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technologies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 4903S | 稀释比例：1/400 |
| Normocure™（抗菌试剂） | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4兔抗体 | Cell Signaling Technology | 2750S | 稀释比例：1/400 |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL）（PS） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 青霉素-链霉素混合液包含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic） | PeproTech | 100-18B | |
| 重组人血小板源性生长因子AB（PDGF-AB） | PeproTech | 100-00AB | |
| 台式制冷离心机 | SIGMA | 4-16KS | |
| 肾上皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-400-030 | |
| 肾上皮细胞生长因子试剂盒 | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) 小鼠单克隆抗体 #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | 稀释比例：1/400 |
| SSEA4 (MC813) 小鼠单克隆抗体 | NEB | 4755S | 稀释比例：1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | 该培养基已停止生产，建议改用StemFit Basic04CT（适用于人细胞系）或StemFit Basic03（适用于非人灵长类动物）。 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select酶（1x），无酚红（解离酶） | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Precision GP 05水浴锅 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632，二盐酸盐（ROCK抑制剂） | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| 抗体稀释缓冲液 | 成分见补充表S1 | ||
| 封闭缓冲液 | 成分见补充表S1 | ||
| REMC培养基 | 成分见补充表S1 | ||
| 初级尿液培养基 | 成分见补充表S1 | ||
| 多能干细胞（PSC）培养基 | 成分见补充表S1 | ||
| 多能干细胞（PSC）生成培养基 | 成分见补充表S1 | ||
| 尿液洗涤缓冲液 | 成分见补充表S1 |
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