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一种利用短链生物素化RNA优化的RNA结合蛋白定量下拉分析方法

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DOI：

10.3791/64923

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2023年2月17日

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1Center for Human Technology, Italian Institute of Technology (IIT), 2Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology (IEO), 3Department of Biology and Biotechnologies ‘Charles Darwin’, Sapienza University of Rome

本文内容

摘要

此处，我们介绍一种经过优化的 体外 利用人源细胞总蛋白提取物、包被生物素化RNA的链霉亲和素磁珠及质谱分析，鉴定、定量和验证特定RNA序列的蛋白互作分子的方法。

摘要

蛋白质与RNA的相互作用在转录和转录后水平上调控基因表达和细胞功能。因此，鉴定特定RNA的结合伴侣对于揭示多种细胞过程背后的机制具有重要意义。然而，RNA分子可能与某些RNA结合蛋白（RBPs）发生短暂且动态的相互作用，尤其是与非经典RNA结合蛋白之间的相互作用。因此，迫切需要改进的方法来分离并鉴定这类RNA结合蛋白。

为高效且定量地鉴定已知RNA序列的蛋白互作伙伴，我们开发了一种基于从细胞总蛋白提取物出发，富集并表征所有相互作用蛋白的方法。我们采用预先结合生物素化RNA的链霉亲和素包被磁珠，优化了蛋白下拉实验。为验证该方法的可行性，我们选用了一段已知可结合神经退行性疾病相关蛋白TDP-43的短RNA序列，并设置一段核苷酸组成不同但长度相同的RNA作为阴性对照。在用酵母tRNA封闭磁珠后，将生物素化RNA序列加载至链霉亲和素磁珠上，并与HEK 293T细胞的总蛋白提取物共同孵育。经过孵育及多次洗涤以去除非特异性结合蛋白后，使用高盐溶液洗脱与RNA特异性结合的蛋白，该洗脱条件与常用蛋白定量试剂及质谱样品制备兼容。通过质谱分析，我们量化了在已知RNA结合序列的下拉实验中TDP-43相对于阴性对照的富集程度。我们还利用相同技术验证了其他通过计算预测为该目标RNA或对照RNA特异性结合蛋白的相互作用。最后，我们通过蛋白质印迹（western blot）对本实验方案进行了验证。 通过 使用适当的抗体检测TDP-43。

本方案可在接近生理条件下研究目标RNA的蛋白质互作伙伴，有助于揭示独特且未被预测的蛋白质-RNA相互作用。

引言

RNA结合蛋白（RBPs）作为转录及转录后基因调控中的关键参与者而受到广泛关注，因其参与了mRNA剪接、RNA细胞内定位、翻译、修饰以及降解等过程1,2,3。这两类大分子之间的相互作用高度协调、精确平衡，对于功能性加工中心的形成至关重要。这些调控中心内的变异或失调可能破坏精细调控的蛋白-RNA网络，并与多种人类疾病密切相关，包括癌症4,5和神经退行性疾病6,7,8。RNA分子与其结合蛋白之间的相互作用可能表现为稳定且易于通过实验验证的形式，也可能表现为高度动态、瞬时存在且更难表征的形式。

近年来，人们已投入大量努力来研究这些相互作用。在众多成熟的方法中，蛋白质下拉实验（protein pull-down assays, PDs）可能是最受认可且最常用的方法，用于揭示构成核糖核蛋白（RNP）复合物及其他蛋白质-RNA相互作用网络的关键组分。3,9,10. PDs 包括一系列信息丰富的技术，例如RNA免疫沉淀（RIP）11,12 或蛋白质（CLIP）13,14 感兴趣的目标。其中一些RNA-PD方案采用已知RNA作为诱饵来捕获蛋白质15，最常用的方法是利用高亲和力标签（如生物素）。在此情况下，可通过将生物素标记的RNA锚定在链霉亲和素包被的磁珠上，有效分离核糖核蛋白复合物（RNP），从而检测该RNA的相互作用伴侣。这些方法的主要局限性通常在于生物素化探针的设计及其与靶蛋白结合能力的验证。为此，若有可参考的该靶蛋白已发表的CLIP数据，则可加以利用，因为这些数据能够高精度地揭示与靶蛋白相互作用的短RNA区域，即相互作用信号峰所对应的RNA片段13,16这些相同区域也可用于开发PDs的探针。设计此类RNA诱饵的另一种方法可能是指数富集配体的系统进化（SELEX）。17，从而实现适配体的设计 体外 筛选，从一个全面的随机文库开始 通过 一系列由PCR驱动的优化循环。然而，SELEX技术复杂且耗时较长，其最终结果高度依赖于初始文库。为了筛选本方案中所使用的RNA诱饵，采用了另一种方法，即设计一种RNA诱饵 从头合成 通过算法的计算能力 猫RAPID 是一种可预测特定蛋白质对某些 RNA 序列优先结合能力的方法18,19,20.

本文介绍的方案是一种RNA-PD（RNA亲和纯化）方法的优化版本，旨在接近生理条件下洗脱特定的蛋白质互作伙伴，无需使用去污剂、变性剂或高温处理。该方法依赖于共价包被了高纯度链霉亲和素的纳米超顺磁性微珠，以及一种经in silico（计算机设计）设计的生物素化RNA作为诱饵。本方案提供了一种快速且高效的方法，可在天然条件下分离生物素化RNA分子的结合伴侣蛋白，具有广泛下游应用的潜力。为验证该方案，采用了一段已知可高亲和力和高特异性结合TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的10个核苷酸单链RNA适配体序列20。从HEK 293T细胞裂解液出发，通过高渗缓冲液将与RNA诱饵结合的蛋白复合物洗脱后，进行质谱分析以鉴定互作蛋白。分析结果证实 成功鉴定并定量了TDP-43作为该RNA适配体的优先结合蛋白。

该方案仅需一段短序列即可成功鉴定蛋白质相互作用分子， 体外 合成的RNA寡核苷酸。此外，使用 计算机模拟 设计RNA适体作为PD探针21,22 在显著降低成本的同时，保证对目标物的特异性。

方案

1. 通用方法与材料

  1. 根据所选的哺乳动物细胞培养体系配制相应的培养基，并在使用前于 37 °C 预热 20 分钟。
  2. 按照材料表中的说明提前准备好所需材料。对玻璃器皿、塑料器皿和缓冲液储备液进行高压灭菌。
  3. 按照表 1中的说明配制缓冲液。在将各组分稀释至终体积前，使用浓盐酸或氢氧化钠调节储备液的 pH 值。

2. 哺乳动物细胞系的制备

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）和100 µg/mL青霉素/链霉素溶液的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK 293T细胞。将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育。常规传代培养细胞。
  2. 消化前，用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，使其完全覆盖生长表面。
  3. 吸除PBS，加入一层极薄的胰蛋白酶-EDTA溶液。
  4. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育5分钟，或直至细胞脱落（显微镜下观察应呈分散状态）。
  5. 通过加入完全DMEM将胰蛋白酶-EDTA溶液稀释十倍以终止其活性，并对细胞进行计数。
  6. 以1.5 × 105 个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每种实验条件设两个复孔。
  7. 将细胞置于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育48小时。
    注意：请参考试剂制造商提供的说明书，选择适用于该细胞系的培养基类型和添加物。此外，胰蛋白酶-EDTA的用量和孵育时间因细胞系而异。某些细胞类型的生长速度可能快于或慢于本方案所述；因此，接种浓度应预先进行测试。

3. 总蛋白提取

  1. 移除细胞培养孔中的培养基。
  2. 用 1 mL PBS 清洗 6 孔板的每个孔。
  3. 弃去 PBS。
  4. 将 6 孔板置于冰上，可直接进行步骤 3.5，或在 -80 °C 冻存干燥的 6 孔板以促进细胞裂解。
  5. 向每个孔中加入 200 µL 裂解缓冲液。
  6. 使用细胞刮刀刮下并破碎细胞。
  7. 将来自两个孔的细胞提取物转移至同一个 1.5 mL 离心管中。
  8. 将含有蛋白提取物的离心管置于冰上孵育 30 分钟。
  9. 在 4 °C 条件下，以 17,000 x g 离心 15 分钟。
  10. 将每份上清液转移至预冷的离心管中。
    注意：建议每种 PD 条件使用 106-107 个细胞。细胞裂解和蛋白提取应使用预冷的缓冲液进行。裂解缓冲液中应添加蛋白酶抑制剂以防止蛋白降解。

4. 蛋白质浓度测定

  1. 按照生产商说明，用去离子水将 Bradford 试剂稀释五倍，配制工作液2O.
  2. 将1 mL试剂加入1 cm比色皿中，加入1 µL样品，倒置混匀。
  3. 室温避光孵育5-10分钟。
  4. 在595 nm处读取吸光度。
  5. 根据蛋白提取物中蛋白质含量计算出相当于1.5 mg蛋白质的提取物体积，并用裂解缓冲液将所有样品调整至终体积为600 µL。
  6. 将样品置于冰上保存，直至使用。
    注意：可使用其他任何蛋白质浓度测定方法，但需遵循缓冲液兼容性建议。无论采用何种方法，均应以裂解缓冲液作为空白对照。许多试剂与二硫苏糖醇（DTT）不兼容，建议在蛋白质定量完成后，再加入DTT或其他还原剂（DTT终浓度为1 mM）。

5. 磁珠制备

  1. 通过轻弹管壁使磁珠在保存缓冲液中充分混匀。
  2. 按每份样品100 µL的浆液量进行计算，并将相应体积转移至磁力架上。
  3. 磁珠洗涤
    1. 移除保存液，向每管中加入1 mL裂解缓冲液，手动颠倒混匀。
    2. 将管置于磁力架上，移除缓冲液。
    3. 重复洗涤步骤一次。
    4. 加入与初始浆液体积相等的裂解缓冲液，轻弹管壁混匀，并将缓冲液均匀分装至与样品数量相同的1.5 mL离心管中。
  4. 磁珠封闭
    1. 使用磁力架移除缓冲液，每管加入600 µL用裂解缓冲液配制的0.25 mg/mL酵母tRNA溶液。
    2. 在旋转摇床中室温孵育1小时。
    3. 使用磁力架移除tRNA溶液。
    4. 加入600 µL裂解缓冲液，手动混匀进行洗涤。
    5. 重复洗涤一次，弃去缓冲液。

6. 磁珠加载

  1. 每管加入含有初始100 µL浆液介质（已封闭的磁珠）的样品中，准备200 µg RNA寡核苷酸溶于600 µL裂解缓冲液中。
  2. 将寡核苷酸加入磁珠中，室温下旋转孵育1小时。
  3. 移除溶液，加入600 µL裂解缓冲液，室温下旋转5分钟，重复洗涤磁珠两次。
  4. 弃去缓冲液。
    ​注意：切勿涡旋振荡磁珠，可轻轻弹动混匀。尽量减少移液操作次数，除非必要。尽可能使用剪去尖端的1 mL吸头。磁珠浆液介质/样品的用量取决于磁珠的结合能力以及总蛋白的起始量。如果预测RNA寡核苷酸具有较显著的二级结构，建议先在80 °C变性10分钟，然后在室温下缓慢冷却，或在30 °C孵育1小时进行重折叠。建议在磁珠负载RNA后回收未结合的RNA寡核苷酸，并测定其剩余浓度，以优化负载所需的RNA用量，并评估RNA重复使用可能性。

7. 蛋白质在珠粒上的结合

注意：从现在开始，尽可能在 4 °C 下进行步骤操作。

  1. 从600 µL蛋白溶液中取5%体积作为输入样本（IN），用于后续分析（1.5 mg蛋白溶于600 µL中，因此5%对应30 µL和75 µg蛋白）。
  2. 将剩余的蛋白混合液分别加入已装填珠子的各管中，于4 °C缓慢旋转孵育过夜。

8. 洗去非特异性结合物

  1. 使用磁力架去除未结合的组分。保留5%的体积，并标记为流穿液（FT）（未结合的体积约为600 µL，因此再次保留30 µL用于后续分析）。
  2. 向磁珠中加入1 mL洗涤缓冲液1，在4 °C下旋转孵育5分钟。
  3. 弃去上清液。
  4. 重复步骤8.2和8.3。
  5. 向磁珠中加入1 mL洗涤缓冲液2，在4 °C下旋转孵育5分钟。
  6. 弃去上清液。

9. 特异性结合物的洗脱

  1. 向珠子中加入 100 µL 洗脱缓冲液 1 或洗脱缓冲液 2。
  2. 通过轻弹手动混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
  3. 将管子放入恒温混匀仪中，在 95 °C 下剧烈振荡 5 分钟。
  4. 将管子置于磁力架中，收集洗脱组分至干净的管子中。
  5. 使用台式离心机快速离心珠子，以最大程度回收洗脱液。
  6. 保留总洗脱液体积的 5%（EL）用于后续分析（总体积为 100 µL，因此将 5 µL 分装至另一管中）。
  7. 如有需要，可按照第 4 节方法，使用洗脱缓冲液作为空白对照测定蛋白浓度。
    注意：建议在测定蛋白浓度前不要向洗脱缓冲液中添加 DTT。如果不需要进行蛋白定量，或有适用于还原剂的蛋白定量试剂盒，则可从开始就在洗脱缓冲液中添加 1 mM DTT。在本方案中，测试了洗脱缓冲液 1（含 1 M NaCl）和洗脱缓冲液 2（含 2 M NaCl）。增加离子强度对目标蛋白的洗脱效率未见差异，但仍建议在确定最适缓冲液前测试两种条件。如果洗脱缓冲液中盐浓度过高会对后续分析造成限制，由于洗脱缓冲液中去垢剂含量极低，可进行缓冲液置换。作为替代方案，也可将洗脱液稀释至所需盐浓度。

10. 通过质谱法鉴定蛋白质结合物

  1. 丙酮沉淀
    1. 通过将洗脱的蛋白质在冷的（-20 °C）丙酮中稀释四倍来浓缩蛋白质。
    2. 涡旋混匀后，在 -20 °C 下孵育过夜。
    3. 在 4 °C 下以 17,000 × g 离心 30 分钟。
    4. 小心移除上清液，并让丙酮挥发，直至沉淀完全干燥。
  2. 溶液中蛋白质消化
    1. 加入 50 µL 变性缓冲液，溶解蛋白质沉淀。
    2. 加入 DTT 至终浓度为 5 mM，在 55 °C 下还原蛋白质 30 分钟。
    3. 将样品冷却至室温，随后进行蛋白质烷基化反应，加入碘乙酰胺（IAA）至浓度为 10 mM，反应 15 分钟。
    4. 使用合适的酶（胰蛋白酶、LysC）消化蛋白质，并在 37 °C 下孵育过夜。
    5. 加入 1 µL 10% 三氟乙酸（TFA）终止消化反应。
    6. 使用定制的反相 C18 微柱对肽段进行纯化和浓缩，方法如前所述19。
    7. 用缓冲液 B 从 C18 小柱上洗脱肽段。
    8. 使用真空离心浓缩仪去除有机溶剂，将肽段重悬于 5 µL 0.1% 甲酸中，用于后续分析。
      注意：也可在洗去非特异性结合物后（步骤 8.1–8.6），立即在磁珠上进行蛋白质消化"on-beads"，从而加快实验流程。然而，建议测试酶在固定化蛋白上"on-beads"的消化效率，并与标准的溶液中消化方法进行比较，以确保获得最佳的蛋白质序列覆盖度。
  3. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
    1. 安装分析柱（C18 固定相），并在运行期间保持柱温为 45 °C。
    2. 通过毛细管接头（20 µm × 550 mm）将色谱柱连接至液相泵六通阀的出口，采用单柱配置。
    3. 调整液相色谱参数如下：
      1. 在受控压力（980 bar）下，使用缓冲液 A 上样。
      2. 以 300 nL/min 的流速，在 59 分钟内施加 5%–20% 的缓冲液 B 梯度，随后在 15 分钟内施加 20%–30% 的缓冲液 B 梯度，最后在 5 分钟内施加 30%–65% 的缓冲液 B 梯度。
      3. 通过在 5 分钟内将缓冲液 B 浓度升至 95%，再进行 5 分钟的等度洗脱（95% 缓冲液 B）完成清洗步骤。
    4. 将质谱仪设置为数据依赖性采集（DDA）模式，自动在 MS 和 MS/MS 事件之间切换。
    5. 设定循环计数为 15，MS 和 MS/MS 事件的自动增益控制（AGC）目标值分别为 3 × 106 和 1 × 105。
    6. 设定 MS 的最大离子累积时间为 20 ms，分辨率为 60 K；MS/MS 的最大离子累积时间为 100 ms，分辨率为 15 K。
    7. 采用归一化碰撞能量为 28% 进行高能碰撞解离（HCD）碎裂实验，动态排除时间为 20 秒。
    8. 源参数设置如下：
      喷雾电压：1.7 kV
      毛细管温度：275 °C
      不使用鞘气和辅助气体
      注意：本实验中，超高效液相色谱（UHPLC）与质谱（MS）分析采用单柱液相系统连接混合三重四极杆-轨道阱质谱仪（材料表）进行。也可使用其他 LC-MS 系统，但建议对参数进行相应调整。
  4. 数据分析
    1. 点击 Load 按钮导入原始数据文件。
    2. 点击 Set Experiment 按钮定义实验名称。
    3. 进入组别特异性参数部分，设置与鉴定相关的所有参数：
      消化所用酶：胰蛋白酶/P
      允许漏切位点：最多三个
      固定修饰：羧甲基化
      可变修饰：N-乙酰化（蛋白质）、甲硫氨酸氧化
    4. 上传来自公共数据库（如 UniprotKB）的最新 FASTA 文件。
    5. 根据所选数据库的来源设置正确的解析规则。
    6. 设定蛋白质和肽段的母离子假发现率（FDR）值 = 1。
    7. 在“无标记定量”（Label Free Quantification）选项卡中启用无标记定量（LFQ）功能。
    8. 保持最小 LFQ 比值计数为 2。
      注意：本文描述使用 MaxQuant24 和 Perseus 软件25 分别进行蛋白质定量和后续统计分析。但也可使用其他商业或免费的生物信息学工具进行数据分析。FDR 采用基于目标-诱饵数据库的方法进行估算26。肽段和蛋白质的 FDR 为 0.01 表示鉴定结果中预期含有 1% 的假阳性。
  5. 统计分析
    1. 加载 proteingroups.txt 文件，在蛋白质水平上进行统计分析。
    2. 将 LFQ 值设为主要数据列。
    3. 通过分类列过滤，剔除"reverse" 和 "contaminants" 条目。
    4. 使用分类注释行对不同实验条件进行分组。
    5. 对数据矩阵进行缩减，选择每个预定义组中有效数值的数量。
    6. 根据实验设计选择最合适的统计检验方法（如 t 检验、多组样本 ANOVA 检验）。
    7. 基于 FDR 计算确定显著性差异的阈值。通常，校正后的 p 值以 0.01 或 0.05 作为可接受的阈值。
    8. 使用火山图（volcano plot）可视化基于 t 检验统计量的差异分析结果。
    9. 将最终矩阵以 .txt 格式导出，用于进一步编辑最终结果表格。
      注意：配置文件夹中包含一个 FASTA 文件，其中含有角蛋白等在全局蛋白质组实验中常见的污染物蛋白，这些蛋白在输出表格中以“+”标记。本研究包含两个样本组，因此采用 t 检验进行统计分析。

11. 通过蛋白质印迹法验证结果

  1. 样品制备
    1. 向每份上样量（IN、FT 和 EL）中加入适当体积的 4× 上样缓冲液。
    2. 在 95°C 下煮沸样品 5 分钟。
    3. 快速离心，以回收蒸发至管壁顶部的样品。
  2. SDS-PAGE 电泳及凝胶转膜
    1. 将样品上样至 4%–12% 变性聚丙烯酰胺凝胶。
    2. 使用 MES SDS 电泳缓冲液，在 120 V 条件下电泳 1.5 小时。
    3. 按照制造商说明，使用半干转装置将凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜。建议在 15 V 条件下转膜 10 分钟。
  3. 免疫检测
    1. 用含 10% 牛血清白蛋白（BSA）的溶液在室温下封闭膜 1 小时，同时轻轻振荡。
    2. 根据制造商说明，将一抗用含 5% BSA 的 TBST 溶液稀释后加入，4 °C 孵育过夜或室温孵育 1 小时，同时轻轻振荡。
    3. 用 TBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟。
    4. 加入用 TBST 稀释的二抗，室温振荡孵育 1 小时。
    5. 用 TBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟。
    6. 使用蛋白印迹成像仪检测结果。
      注：为检测已知与我们的 RNA 结合的蛋白 TDP-43，使用了重组兔单克隆抗体，并在 4 °C 与膜孵育过夜。二抗选用抗兔 IgG 辣根过氧化物酶（HRP）抗体，但荧光标记的二抗同样适用。为在膜上显色，将膜与 Clarity Western ECL 底物孵育 1 分钟，随后使用 ChemiDoc 成像系统进行成像。

结果

为验证所提出方案的有效性，本文展示的蛋白质下拉实验（PD）采用了一种设计的生物素化RNA适体进行 in silico 特异性结合 TDP-4320。该RNA以高结合亲和力（Kd = 90 nM20此处，序列为 5'-CGGUGUUGCU-3' 的 RNA 被命名为“+RNA”。作为阴性对照，使用了 +RNA 的反向互补序列，此处称为“-RNA”，其序列为 5'-AGCAACACCG-3'。-RNA 对 TDP-43 的结合亲和力显著降低（Kd = 1.5 µM)19为本方案的目的，这些RNA寡核苷酸已购自供应商，并与生物素分子偶联，以便与链霉亲和素磁珠结合。+RNA在3'端带有生物素-TEG修饰，其中生物素与核酸磷酸基团之间包含一个由15个原子组成的三乙二醇间隔臂；而-RNA则在5'端带有生物素，直接与核酸偶联。 通过 一个氨基-C6接头。然而，如果RNA诱饵的设计合理，并且只要接头与RNA之间不存在结构或化学上的干扰，也可采用其他生物素偶联位点及其他长度的接头。

通过蛋白质鉴定（PD）确定与+RNA探针结合的主要蛋白质身份后，可利用质谱分析（MS）和蛋白质印迹（WB）在洗脱液中验证TDP-43的存在，从而验证该实验方案的可靠性（图1）。

对使用 +RNA 或 -RNA 进行的四次 PD 重复实验进行了质谱分析（图 2）。+RNA 和 -RNA 相互作用组的鉴定超出了本实验方案的范围，但此处报告了一些可验证该方案准确性的结果。值得注意的是，将显著富集的蛋白质绘制在火山图中显示，从 +RNA 洗脱的总蛋白含量及富集蛋白显著高于从 -RNA 回收的蛋白（图 2）。这意味着，尽管 +RNA 与 -RNA 具有相同的长度和结构特征（线性），+RNA 能够形成更多的特异性相互作用，这些相互作用可一直保留至高盐洗脱步骤。相反，-RNA 可能形成了更多非特异性结合，这些结合在洗涤步骤中被破坏。如预期所示，TDP-43 被鉴定为 +RNA 特有的互作蛋白20；在使用 +RNA 进行的四次 PD 重复实验中，TDP-43 的平均无标记定量（LFQ）值为 31.96 ± 0.56，而在 -RNA 的互作蛋白中未检测到该蛋白。此外，在所有 +RNA 特有的互作蛋白中，TDP-43 是丰度最高的富集蛋白。

为进一步验证该方案，使用实验室内部算法 catRAPID18,19 对其他可能特异性结合 +RNA 或 -RNA 的蛋白质进行计算预测。具体而言，采用我们先前研究中定义的 catRAPID “相互作用倾向性”功能27，计算了人类蛋白质组中各蛋白质与 +RNA 和 -RNA 的相互作用得分。在高置信度得分的蛋白质中，HNRNPH3 被预测为选择性结合 +RNA（+RNA 相互作用得分为 1.01；-RNA 相互作用得分为 0.21），而 PCBP2 被预测为特异性结合 -RNA（+RNA 相互作用得分为 -0.5；-RNA 相互作用得分为 0.31）（图 3A）。此外，RBM41 被预测为对两种 RNA 寡核苷酸均具有结合倾向（+RNA 相互作用得分为 0.4；-RNA 相互作用得分为 0.39）（图 3A）。质谱分析结果确实证实了 HNRNPH3 和 PCBP2 分别存在于 +RNA 和 -RNA 的免疫共沉淀产物中，而 RBM41 被发现可与两者均发生相互作用（图 3B）。

通过 WB 检测 TDP-43 的存在，以进一步确认结果并用于实验方案优化（图 4）。在本文所述的实验流程中，不同样本在不同阶段被收集。输入样本（IN）为用裂解缓冲液稀释的总蛋白。流穿组分（FT）是在总蛋白与包被有生物素化 RNA 的链霉亲和素磁珠孵育过夜后获得的，代表未与 RNA 结合的蛋白组分。最后，洗脱组分（EL）包含所有特异性识别目标 RNA 的蛋白，因为在 FT 与 EL 步骤之间，经过三轮含 150 mM 盐和 0.1% Triton-X 的洗涤步骤，已去除了较弱的相互作用。

对于每个重复实验，均平行进行相同体积（5% v/v）的IN、FT和EL组分的SDS-PAGE电泳，并使用抗TDP-43抗体进行染色（图4）。在+RNA情况下，TDP-43条带在IN和EL组分中均被检测到，表明该蛋白从总蛋白提取物开始即存在，在洗涤步骤中被+RNA保留，并仅在最后通过高盐缓冲液洗脱下来。在-RNA情况下，TDP-43同样存在于IN中，但对应于该蛋白的条带也在FT中可见，表明这种RNA不能结合TDP-43。EL中未出现TDP-43条带，进一步证实了这一结果。

在优化实验方案过程中，分别使用含 1 M NaCl 的洗脱缓冲液（EB1）和含 2 M NaCl 的完全洗脱缓冲液（EB2）对特异性结合 RNA 序列的蛋白质进行洗脱（图 4）。将两种缓冲液获得的洗脱液在 SDS-PAGE 上进行比较，并用抗 TDP-43 抗体进行免疫印迹。随后使用 ImageJ28 分析所得图像，以量化两种缓冲液洗脱出的 TDP-43 蛋白量的差异。总体而言，未观察到显著差异，因此我们得出结论：在本实验体系中，1 M 盐浓度已足以破坏最强的蛋白质-RNA 相互作用。

总体而言，本文报道的质谱（MS）和蛋白质印迹（WBs）结果表明，该方案能够特异性高效地捕获特定RNA的蛋白质互作分子，并可在与下游分析兼容的缓冲液中进行洗脱。

RNA相互作用组分析示意图；显示蛋白质结合、洗涤、洗脱、质谱和WB数据。
图1：本方案中所用实验流程示意图。（A）在裂解缓冲液中配制适当浓度的生物素化RNA寡核苷酸。（B）磁性链霉亲和素珠经洗涤后，用酵母tRNA封闭，并与生物素化RNA结合。（C）将来源于培养的哺乳动物细胞系的总蛋白提取物加入珠- RNA混合物中。（D）进行多次洗涤以去除非特异性相互作用。（E）使用高渗溶液将特异性结合的蛋白质从RNA上解离下来。（F）通过质谱分析确定相互作用蛋白的身份，并通过Western blot验证特定案例。请点击此处查看此图的放大版本。

质谱工作流程：样品制备、液相色谱-质谱分析、肽段处理、火山图数据分析。
图2基于质谱的无标记蛋白质定量分析策略 (A) 沉淀蛋白质于预冷丙酮中过夜。随后使蛋白质变性，并进行溶液内消化。蛋白酶解肽段经浓缩并脱盐处理。B) 肽的分析 通过 采用“鸟枪法”进行LC-MS/MS分析。C) 原始数据的处理与分析分别使用 MaxQuant 和 Perseus 软件进行。D在火山图中显示具有统计学显著性的富集蛋白。 请点击此处以查看此图的放大版本。

HNRNPH3、PCBP2、RBM41 蛋白的预测结合倾向条形图与LFQ数据表。
图3：预测的相互作用倾向与实验测定的+RNA和-RNA相互作用之间的相关性。（A）catRAPID 相对于 HNRNPH3、PCBP2 和 RBM41 的相互作用评分，显示 HNRNPH3 倾向于结合 +RNA，PCBP2 倾向于结合 -RNA，而 RBM41 被预测为无差别地结合两种 RNA 序列。（B）通过 +RNA 和 -RNA 拉下实验后进行质谱分析所确定的无标记定量（LFQ）平均值。分析结果证实，HNRNPH3 仅结合 +RNA，PCBP2 仅结合 -RNA，而 RBM41 对两者结合程度相当。请点击此处查看此图的放大版本。

SDS-PAGE 凝胶；蛋白质纯化结果；43kDa 处的 TDP-43 条带；电泳分析。
图 4：TDP-43 在选定 RNA 序列互作分子中存在与否的 Western blot 验证。 WB 膜使用抗 TDP-43 抗体进行孵育。IN = 上样对照；FT = 穿流组分；EL (EB1) = 使用洗脱缓冲液 1 洗脱；EL (EB2) = 使用洗脱缓冲液 2 洗脱；符号 "+" 表示来自 +RNA 条件下 pull-down 实验的样品；符号 "-" 表示来自 -RNA 条件下 pull-down 实验的样品；第 1 泳道为蛋白 Marker。箭头指示 TDP-43 的位置。Western blot 结果显示，TDP-43 存在于 +RNA 互作分子中，但不存在于 -RNA 互作分子中。请点击此处查看本图的高清版本。

缓冲液名称组成
10x 转膜缓冲液250 mM Tris, 1.92 M 甘氨酸, 1% SDS, 20% 甲醇。使用前稀释10倍PD
20X MES SDS 电泳缓冲液1 M MES, 1 M Tris, 2% SDS, 20 mM EDTA。调节pH至7.3。使用前稀释20倍
4x 上样缓冲液0.25 M Tris 碱, 0.28 M SDS, 40% 甘油, 20% 2-巯基乙醇, 4 mg/ml 溴酚蓝
洗脱缓冲液 120 mM 磷酸盐 pH 7.5, 1 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT（定量后添加）
洗脱缓冲液 220 mM 磷酸盐 pH 7.5, 2 M NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT（定量后添加）
裂解缓冲液10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制剂
含 Tween-20 的 Tris 缓冲盐水1 M Tris-HCl pH 7.4, 3 M NaCl, 2.0% Tween-20
洗涤缓冲液 110 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton™ X-100, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制剂
洗涤缓冲液 225 mM Hepes pH 8, 150 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 0.1% Triton X-100, 1 mM DTT 及蛋白酶抑制剂
缓冲液 A0.1% 甲酸MS
缓冲液 B60% 乙腈, 0.1% 甲酸
变性缓冲液8 M 尿素, 50 mM Tris-HCl

表1：PD和MS缓冲液。 用于pull-down实验（PD）或质谱分析（MS）的缓冲液名称及其组成。

讨论

本研究报道了一种利用生物素标记的RNA寡核苷酸捕获其相互作用蛋白的PD（pull-down）实验方案的优化。本文所述方案操作简便，所需材料少，且结果高度可靠。尤为重要的是，该方案最具创新性的方面在于：使用完全通过in silico（计算机设计）方法设计、且针对目标蛋白特异的RNA探针，并通过高盐溶液直接破坏蛋白与RNA探针之间的相互作用来洗脱所有结合蛋白，而非采用去垢剂和高温处理使链霉亲和素与生物素解离的传统方式。

本方案利用了生物素与链霉亲和素之间结合的高亲和力29,30。根据所选用的链霉亲和素磁珠，必须在进行后续操作前对生物素标记RNA的载入效率进行测试和定量。此外，RNA的三维折叠结构可能会影响其在磁珠上的载入效率，因为该结构可能限制生物素与链霉亲和素的接触。使用非生物素化的tRNA对磁珠进行封闭，可减少与磁珠的非特异性相互作用，从而提高实验结果的特异性。载入缓冲液和洗脱缓冲液的选择应根据下游应用而定。本文中推荐使用非常温和的条件，适用于大多数实验应用，并有助于保持潜在的蛋白质复合物。然而，该方法具有高度可调性；使用者可选择任意细胞系和任意大小的RNA，并可在RNA折叠/去折叠处理后重复本实验流程，以研究结构对结合特性的影响。

本方案的另一个创新之处在于使用in silico预测工具来确保结果的准确性20。预先了解哪些蛋白质应被鉴定为靶标RNA的互作蛋白，使得验证本方案技术环节的可靠性成为可能，这是前所未有的优势。例如，在进行质谱分析之前，可通过简单的WB分析验证来自不同实验步骤样品中是否含有已知的目标蛋白；而质谱分析需要专用仪器且成本较高。此外，最近有研究报道了一种利用catRAPID20（一种实验室自有的蛋白-RNA相互作用预测算法）设计针对特定目标蛋白的全新RNA（de novo RNA）的方法。在不久前，设计靶向特定蛋白的DNA/RNA适配体（aptamer）的唯一可用方法是SELEX（指数富集配体系统进化）技术31。in silico方法能够更快速、更经济地实现RNA适配体的设计。

该方法的主要局限性在于需要使用无核酸酶的缓冲液和工具。此外，如果需要确认 体外 a之间的结合 从头合成-设计的RNA与目标蛋白在进行PD之前，需要先表达并纯化该蛋白，并通过生物物理方法确定其结合能力。这一局限性与单克隆抗体的制备过程相同。

尽管存在这些微小问题，但诸如本文所述的可靠方法仍可帮助科学家更深入地揭示许多生理和病理机制中的大分子网络及关键作用因子，例如癌症、心肌病、糖尿病、微生物感染以及遗传性和神经退行性疾病中涉及的分子网络与关键因子。

披露

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

作者谨感谢Tartaglia教授和Cuomo博士研究团队提供的支持。E.Z.获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议编号754490的MINDED奖学金资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6孔组织培养板 VWR10861-554CELLS
细胞刮刀BIOSIGMA 10153CELLS
Dulbecco′s改良Eagle′s培养基（DMEM）′′ Thermo Fisher Scientfic11995065CELLS
胎牛血清，经鉴定合格，热灭活，巴西来源Thermo Fisher Scientfic10500064CELLS
磷酸盐缓冲液（PBS，Waltham，MA）Thermo Fisher Scientfic14190169CELLS
胰蛋白酶（0.25%），含酚红Thermo Fisher Scientfic15050065CELLS
抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP）Cellsignal7070PD
生物素化RNAEurofins定制RNA寡核苷酸PD
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418PD
Clarity Western ECL底物，500 mlBiorad1705061PD
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Merck - Sigma Aldrich5056489001PD
NuPAGE 4至12%，Bis-Tris，1.0 mm，Mini Protein胶，10孔InvitrogenNP0321BOXPD
重组抗TDP43抗体Abcamab109535PD
核糖核酸，来自酿酒酵母（S. cerevisiae）Merck - Sigma AldrichR5636-1MLPD
链霉亲和素Mag SepharoseMerck - Sigma AldrichGE28-9857-99PD
Trans-Blot Turbo RTA Mini 0.2 µm PVDF转膜试剂盒Biorad1704272PD
丙酮Thermo Fisher Scientfic022928.K2MS
C18柱Thermo Fisher Scientfic13-110-018MS
二硫苏糖醇（DTT） Thermo Fisher Scientfic20290MS
EASY-Spray HPLC色谱柱Thermo ScientificES902MS
碘乙酰胺（IAA） Sigma Aldrich S.r.l.I6125MS
Lys-C/胰蛋白酶PromegaV5073MS
三氟乙酸（TFA）Thermo Fisher Scientfic28904MS
尿素Thermo Fisher ScientficJ75826.A7MS
设备
ChemiDoc成像系统Bio-RadCELLS
Dyna Mag-2磁力架InvitrogenCELLS
Forma Series 3水套式CO2培养箱Thermo ScientificPD
PROTEAN II xi电泳槽，用于PAGE的电源系统Bio-RadPD
旋转轮，SB3型旋转仪StuartPD
设定在37 °C的水浴锅VWRPD
XCell SureLock Mini-Cell电泳系统ThermoFisher ScientificMS
Easy-nLC 1200超高效液相色谱仪Thermo ScientificMS
Q exactive质谱仪Thermo ScientificMS
软件版本
MaxQuant2.0.3.0MS
Perseus1.6.14.0MS

参考文献

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RNA RNA HEK 293T TDP 43 RNA

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