分离与纯化真菌β-葡聚糖作为胶质母细胞瘤的免疫治疗策略

摘要

本实验方案描述了四种不同真菌β-葡聚糖的纯化步骤及其后续研究，这些β-葡聚糖作为潜在的免疫调节分子，可增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的抗肿瘤特性。

摘要

开发针对胶质母细胞瘤的有效疗法所面临的主要挑战之一，是克服肿瘤微环境中强烈的免疫抑制状态。免疫治疗作为一种有效策略，能够激活免疫系统以对抗肿瘤细胞。胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（GAMs）是导致此类抗炎环境的主要驱动因素。因此，增强GAMs中的抗肿瘤免疫反应，可能成为治疗胶质母细胞瘤患者的一种潜在辅助治疗手段。在此背景下，真菌β-葡聚糖分子长期以来被认为具有强大的免疫调节作用。已有研究描述了其激活先天免疫活性并改善治疗反应的能力。这些调节特性部分归因于其与模式识别受体结合的能力，而有趣的是，这些受体在GAMs中高度表达。因此，本研究聚焦于真菌β-葡聚糖的分离、纯化及其后续应用，以增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的杀瘤反应。本研究采用小鼠胶质母细胞瘤（GL261）和小胶质细胞（BV-2）细胞系，检测四种从当前生物制药工业中广泛使用的蘑菇中提取的真菌β-葡聚糖的免疫调节特性：Pleurotus ostreatus、Pleurotus djamor、Hericium erinaceus、 和 Ganoderma lucidum。为评估这些化合物的作用，进行了共刺激实验，以测定经预先激活的小胶质细胞条件培养基对胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡激活的影响。

引言

尽管神经肿瘤学领域取得了诸多新进展，胶质母细胞瘤患者的预期寿命仍然十分有限。目前针对脑肿瘤的金标准治疗方案主要基于手术、放疗和化疗的联合应用。然而，在过去十年中，免疫治疗已逐渐成为治疗多种癌症类型的有力策略¹。因此，利用人体自身免疫系统对抗肿瘤细胞的可能性，最近已成为肿瘤学的第四大支柱。

长期以来，人们一直认识到该领域最大的挑战之一是克服肿瘤微环境中存在的强烈免疫抑制²。特别是对于胶质母细胞瘤——一种最常见且最具侵袭性的脑癌类型而言，揭示调控此类促肿瘤状态的关键通路，并发现能够逆转免疫系统受抑反应的新型化合物，可能为未来治疗这种难治性疾病开辟道路。

大脑拥有自身的免疫系统细胞，其中最重要的细胞类型是小胶质细胞。研究表明，这类细胞在不同中枢神经系统疾病中表现出相当复杂的行为³。在原发性脑肿瘤（例如胶质母细胞瘤）的情况下，这些细胞会转变为抗炎表型，从而支持肿瘤细胞在脑实质中的定植³。大量研究已进一步证实了这些细胞在肿瘤进展过程中的关键作用。其中一个主要原因是，胶质瘤相关的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞（GAMs）占整个肿瘤质量的三分之一，这明确表明其活化状态在脑肿瘤进展中具有不可忽视的影响⁴<....

方案

本方案中描述的四种不同蘑菇变体均购自商业来源（见材料表）。

1. 真菌β-葡聚糖的分离

1. 可溶性蘑菇多糖的提取与分离
   注意：可溶性蘑菇多糖（SMPs）的提取过程如示意图所示。 图1.
   1. 轻轻冲洗新鲜 P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus, 和 G. lucidum 子实体（约2,000克/蘑菇）用蒸馏水洗涤五次。
   2. 在50 ± 2 °C的常规空气干燥箱中将子实体干燥至恒重（约24 h）。
   3. 使用刀片研磨机将干燥的蘑菇研磨成粉，每种蘑菇可获得约200 g粉末。
   4. 将100 g蘑菇粉（MP）悬浮于P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus, 和灵芝（G. lucidum）) 溶于 1,000 mL H₂O_d然后，在121 °C下高压灭菌15分钟，最后于室温放置30分钟。
   5. 将所得悬液在6,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。

结果

β-葡聚糖的高效纯化
经提取与纯化流程后，从P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum和H. erinaceus子实体中获得的粗多糖（MP）、可溶性多糖组分（SMPs）及纯化β-葡聚糖（SβGs）的质量如表1所示。真菌来源的MP、SMPs和SβGs的基本组成（总碳水化合物、β-葡聚糖和蛋白质）见表2。结果表明，本方案可从SMPs中回收大量蛋白质。然而，经α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶和蛋白酶的酶解处理后，蛋白质含量降低，β-葡聚糖浓度相应提高。

不同SβG的紫外光谱在260 nm和280 nm处均未出现紫外吸收峰（图2A），表明SβG不含核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）。此外，采用紫外-可见吸收光谱-凝胶渗透色谱（SEC）检测SβG的均一性。色谱图（图3）.......

讨论

本研究描述了利用成熟技术成功从四种不同真菌中分离、纯化并表征SβGs成分的方法。结果表明，在对获得的SMPs进行热水提取后， P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, 和H. erinaceus, 随后通过α-淀粉酶、葡萄糖苷酶和蛋白酶进行水解处理，α-葡聚糖和蛋白质含量显著降低，从而大幅富集了纯化的SβGs。

尽管如此，我们在纯化过程中观察到大多数真菌β-葡聚糖不溶于水。本研究主要关注的是SβGs，因其具有医学/药用特性^10,18。此外，通过水解处理、乙醇沉淀和透析，成功去除了SMPs中的可溶性低分子量碳水化合物、多肽、寡肽和氨基酸，其去除效率与其他先前研究结果相似，这些研究虽使用了不同种类的蘑菇，但采用了类似的方法流程^19,20。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8孔板载玻片	Thermo Fisher, USA	171080
空气干燥烘箱	J.P. Selecta S.A., Spain	2000210
白蛋白	Sigma-Aldrich, St. Louis	A7030
Alcalase	Novozymes, Denmark	蛋白酶
Alexa Fluor 488	Thermofisher, USA	A32731
Alexa Fluor 647	Thermofisher, USA	A32728
刀式研磨仪	Retsch, Germany	SM100
牛血清白蛋白	MERK, Germany	A9418
纤维素透析膜管	Sigma-Aldrich, St. Louis	D9402
离心机	MERK, Germany	Eppendorf, 5810R
共定位分析插件	ImageJ		(https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis )
DAPI	MERK, Germany	28718-90-3
葡聚糖	Pharmacosmos, Holbalk, Denmark	Dextran 410, 80, 50
Dulbecco´s 改良 Eagle´s 培养基，含 Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	10564011
Extenda（α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶）	Novozymes, Denmark
胎牛血清	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	A4736301
傅里叶变换红外光谱仪	Bruker-Vertex, Switzerland	VERTEX 70v
绘图与分析软件	GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.)
H2SO4
HPLC 系统	Waters Corp, Milford, MA, USA	Waters 2695 HPLC
培养箱	Eppedorf	Galaxy 170S
质谱仪	Q Exactive GC, Thermo Scientific	725500
多聚甲醛	MERK, Germany	P6148
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
pH 计	Crison, Barcelona, Spain	Basic 20
磷酸盐缓冲液	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA	1010-015
兔源裂解型 Caspase-3（Asp175）抗体	Abcam, UK	ab243998
大鼠 Ki-67 单克隆抗体	Thermofisher, USA	MA5-14520
旋转蒸发仪	Büchi Ibérica S.L.U., Spain	El Rotavapor R-100
超羟基凝胶线性凝胶过滤色谱柱（300 mm × 7.8 mm）	Waters Corp, Milford, MA, USA	WAT011545
紫外-可见分光光度计	Amersham Bioscience, UK	Ultrospec 2100 pro
VectaMount 封片剂	Vector Laboratories, C.A, USA	H-5000-60
水浴锅	J.P. Selecta S.A., Spain
蔡司 LSM 7 DUO 共聚焦显微镜系统	Zeiss, Germany
β-葡聚糖检测试剂盒	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	K-BGLU
β-葡聚糖	Setas y Hongos del Sur, S.L.		提供四种蘑菇变体