本实验方案描述了四种不同真菌β-葡聚糖的纯化步骤及其后续研究，这些β-葡聚糖作为潜在的免疫调节分子，可增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的抗肿瘤特性。
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方法文章
分离与纯化真菌β-葡聚糖作为胶质母细胞瘤的免疫治疗策略
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
开发针对胶质母细胞瘤的有效疗法所面临的主要挑战之一，是克服肿瘤微环境中强烈的免疫抑制状态。免疫治疗作为一种有效策略，能够激活免疫系统以对抗肿瘤细胞。胶质瘤相关巨噬细胞和小胶质细胞（GAMs）是导致此类抗炎环境的主要驱动因素。因此，增强GAMs中的抗肿瘤免疫反应，可能成为治疗胶质母细胞瘤患者的一种潜在辅助治疗手段。在此背景下，真菌β-葡聚糖分子长期以来被认为具有强大的免疫调节作用。已有研究描述了其激活先天免疫活性并改善治疗反应的能力。这些调节特性部分归因于其与模式识别受体结合的能力，而有趣的是，这些受体在GAMs中高度表达。因此，本研究聚焦于真菌β-葡聚糖的分离、纯化及其后续应用，以增强小胶质细胞对胶质母细胞瘤细胞的杀瘤反应。本研究采用小鼠胶质母细胞瘤（GL261）和小胶质细胞（BV-2）细胞系，检测四种从当前生物制药工业中广泛使用的蘑菇中提取的真菌β-葡聚糖的免疫调节特性：Pleurotus ostreatus、Pleurotus djamor、Hericium erinaceus、 和 Ganoderma lucidum。为评估这些化合物的作用，进行了共刺激实验，以测定经预先激活的小胶质细胞条件培养基对胶质母细胞瘤细胞增殖和凋亡激活的影响。
引言
尽管神经肿瘤学领域取得了诸多新进展，胶质母细胞瘤患者的预期寿命仍然十分有限。目前针对脑肿瘤的金标准治疗方案主要基于手术、放疗和化疗的联合应用。然而，在过去十年中，免疫治疗已逐渐成为治疗多种癌症类型的有力策略1。因此，利用人体自身免疫系统对抗肿瘤细胞的可能性，最近已成为肿瘤学的第四大支柱。
长期以来，人们一直认识到该领域最大的挑战之一是克服肿瘤微环境中存在的强烈免疫抑制2。特别是对于胶质母细胞瘤——一种最常见且最具侵袭性的脑癌类型而言，揭示调控此类促肿瘤状态的关键通路，并发现能够逆转免疫系统受抑反应的新型化合物，可能为未来治疗这种难治性疾病开辟道路。
大脑拥有自身的免疫系统细胞，其中最重要的细胞类型是小胶质细胞。研究表明，这类细胞在不同中枢神经系统疾病中表现出相当复杂的行为3。在原发性脑肿瘤（例如胶质母细胞瘤）的情况下，这些细胞会转变为抗炎表型，从而支持肿瘤细胞在脑实质中的定植3。大量研究已进一步证实了这些细胞在肿瘤进展过程中的关键作用。其中一个主要原因是，胶质瘤相关的小胶质细胞和浸润的巨噬细胞（GAMs）占整个肿瘤质量的三分之一，这明确表明其活化状态在脑肿瘤进展中具有不可忽视的影响4,5。
正因如此，真菌β-葡聚糖被描述为能够触发有效免疫反应的强效分子，包括促进吞噬作用和促炎因子的产生，从而清除有害物质6,7,8,9,10。目前对真菌β-葡聚糖的研究通常采用来自不同蘑菇部位的提取物。然而，要明确其特定效应，必须对其进行纯化，以避免结果歧义，并能够阐明这类分子作为免疫调节剂的作用机制8。
本研究从四种不同蘑菇的子实体中纯化可溶性β-葡聚糖，这些蘑菇通常被用作食用蘑菇（Pleurotus ostreatus 和 Pleurotus djamor）或药用蘑菇（Ganoderma lucidum 和 Hericium erinaceus）。特别是，这四种蘑菇在食品和制药工业中具有重要用途，并已在一家企业内通过环境友好的循环经济模式进行生产（见材料表）。
为了奠定真菌β-葡聚糖在未来脑癌治疗中应用的基础，必须建立明确的纯化策略，并开展深入探讨其与免疫系统细胞潜在相互作用的临床前研究，以评估其作为抗肿瘤介质的潜力。本研究描述了从选定蘑菇子实体中提取可溶性β-葡聚糖所需的多个分离与纯化步骤。在成功纯化后，激活小胶质细胞以增强其促炎表型。随后，将经上述提取物处理过的小胶质细胞条件培养基作用于小鼠胶质母细胞瘤细胞（GL261），并评估其对肿瘤细胞行为的影响。有趣的是，本实验室的初步研究（数据未显示）发现，促炎型小胶质细胞不仅可减缓胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭能力，对其他多种癌细胞系也具有类似作用。这项多学科交叉的研究可能为肿瘤学研究人员提供一种有效工具，用于测试能够增强多种肿瘤免疫应答的有前景化合物。
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方案
本方案中描述的四种不同蘑菇变体均购自商业来源（见材料表）。
1. 真菌β-葡聚糖的分离
- 可溶性蘑菇多糖的提取与分离
注意：可溶性蘑菇多糖（SMPs）的提取过程如示意图所示。 图1.- 轻轻冲洗新鲜 P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus, 和 G. lucidum 子实体（约2,000克/蘑菇）用蒸馏水洗涤五次。
- 在50 ± 2 °C的常规空气干燥箱中将子实体干燥至恒重（约24 h）。
- 使用刀片研磨机将干燥的蘑菇研磨成粉，每种蘑菇可获得约200 g粉末。
- 将100 g蘑菇粉（MP）悬浮于P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus, 和灵芝（G. lucidum）) 溶于 1,000 mL H2Od然后，在121 °C下高压灭菌15分钟，最后于室温放置30分钟。
- 将所得悬液在6,000 x g 4 °C 下离心 10 分钟。
- 在50 ± 2 °C的鼓风干燥箱中将含有不溶性蘑菇多糖（IMPs）的沉淀物干燥24小时。
- 弃去沉淀，保留上清液。将上清液用旋转蒸发仪浓缩10倍。
- 在4 °C下，用乙醇（终浓度80%）过夜沉淀含有SMPs的浓缩液。
- 将乙醇悬浮液在6,000 x g下离心 g 4 °C下离心15分钟，保留沉淀，用移液器弃去上清液。
- 用80%乙醇将沉淀洗涤三次，然后溶于H2Od （10% w/v）。调节pH至6.5/7，温度至37 °C，按照生产商说明书分别加入2 U的α-淀粉酶和4 U的糖化酶处理，以溶解α-葡聚糖（见 材料表).
- 经α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶处理后，将pH和温度分别调节至8.0和50 °C，随后用碱性蛋白酶（2.5 U/g蛋白质）处理（见 材料表)以溶解蛋白质。
注意：该顺序酶处理可去除在乙醇沉淀过程中与β-葡聚糖共沉淀的大部分α-葡聚糖和蛋白质。 - 水解后，将水解产物在6,000 x g 4 °C 下离心 15 分钟，将上清液用旋转蒸发仪浓缩五倍，再用 80% 乙醇沉淀。
- 将所得沉淀溶于 H2Od 并使用纤维素透析管膜（截留分子量12,000 Da；参见 材料表）以去除小分子量物质。收集水溶性组分并进行冷冻干燥，以获得可溶性β-葡聚糖（SβGs）。
- 糖和蛋白质测定
- 采用苯酚-硫酸法测定各组分的总糖含量，以葡萄糖为标准品8.
注意：也可使用β-葡聚糖检测试剂盒（蘑菇和酵母；参见 材料表)，基于酶促水解及氧化还原酶活性：即外切-1,3-β-葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶和过氧化物酶，并随后生成醌亚胺。按照试剂盒说明书操作，略有修改。 - 使用18 MH2SO4 而不是 12 MH2SO4.
- 分别评估总葡聚糖和α-葡聚糖的含量。
- 根据凯氏定氮法（Kjeldahl protocol），通过测定总葡聚糖与α-葡聚糖（三份重复）数值之差，计算得到β-葡聚糖含量。在某些情况下，可采用Lowry法测定蛋白质含量，并以牛血清白蛋白绘制标准曲线。11,12.
- 采用苯酚-硫酸法测定各组分的总糖含量，以葡萄糖为标准品8.
- 紫外吸收光谱分析
- 使用紫外-可见分光光度计获取 SβG 的紫外（UV）光谱（参见 材料表）通过在200-400 nm波长范围内扫描样品（图2).
- 制备每种 SβG 的 1.0 mg/mL 溶液于 H2Od将溶液转移至石英比色皿中，在室温下进行扫描。
- 分子量分布分析
- 通过使用高效液相色谱系统（HPLC）的尺寸排阻色谱法（SEC）估算SβGs的均一性及聚合物的分子量（参见 材料表配备示差折光检测器和超羟基凝胶线性凝胶过滤柱（300 mm × 7.8 mm； 图3).
- 在40 °C下进行检测，以去离子水作为洗脱液，流速为0.5 mL/min-1 以及葡聚糖（110、80 和 50 kDa）作为标准品（参见 材料表收集5 mL馏分。
- 傅里叶变换红外（FTIR）分析
- 记录红外光谱（图4在FTIR光谱仪上，于4000-500 cm⁻¹范围内测定-1样品应预先与溴化钾（KBr）混合以制成薄膜（标准FTIR流程；参见制造商说明书及 材料表).
- 分子组成分析
- 采用高效薄层色谱法（HPTLC）以及气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），按照标准操作程序对SβGs的分子组成进行分析12.
2. 体外 β-葡聚糖诱导的小胶质细胞活化研究
- 小鼠胶质母细胞瘤和小胶质细胞在8孔腔室载玻片中的细胞培养
注意：本方案专用于GL261（胶质母细胞瘤）和BV2（小胶质细胞）细胞系。然而，经过轻微修改后，这些步骤也可能用于研究其他癌细胞和免疫细胞系。- 制备添加L-谷氨酰胺、4.5 g/L D-葡萄糖且不含丙酮酸的改良杜尔贝科氏必需培养基（DMEM）完全培养基。加入10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（见材料表）。将培养基在37 °C水浴中预热15分钟。
- 将冻存的BV2和GL261细胞冻存管在37 °C水浴中解冻2分钟，在细胞即将完全解冻前转移至超净工作台，并将细胞分别接种于两个无菌T25培养瓶中（每种细胞系一个培养瓶）。
- 将T25培养瓶置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育，直至细胞融合。
注意：根据冻存条件和冷冻保存时间的不同，达到融合所需时间可能有所差异。这些细胞系在T75培养瓶中通常需要3至5天达到融合状态。 - BV2细胞培养达到融合后，以每孔0.6 × 106个细胞的密度将其接种至8孔腔室载玻片中。将8孔腔室载玻片在培养箱中继续培养24小时。
- 待小胶质细胞接种至8孔腔室载玻片后，对GL261细胞重复相同的接种流程。
- 使用β-葡聚糖激活小胶质细胞
- 用四种不同的β-葡聚糖（P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum和H. erinaceus）以0.2 mg/mL的浓度处理BV2细胞，持续72小时。其中一个实验组应保持未处理状态（使用正常培养基），作为对照组。
- 72小时后用移液器收集上清液，并将剩余液体通过0.20 µm针头滤器过滤。随后将上清液在-80 °C下冷冻保存至少24小时。
- 用预先激活的小胶质细胞条件培养基处理GL261细胞
- 当8孔腔室载玻片中的GL261细胞达到80%融合时，加入经β-葡聚糖处理的小胶质细胞培养上清（步骤2.2.2），终体积浓度为25%，继续孵育72小时（每孔总体积：250 µL）。
- 72小时孵育后移除培养基并弃去。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4，0.1 M）洗涤细胞三次，每次5分钟。
- 加入200 µL 4%多聚甲醛（PFA），在4 °C下固定细胞15分钟。
注意：根据免疫荧光实验中可能使用的不同抗体，固定方法可能不同于常规的4% PFA固定。基于酒精的固定剂可能更有效地保留某些抗原表位。
- 免疫荧光检测
- 用含0.01% Triton X的PBS（PBST）洗涤样本三次，每次10分钟。
- 吸除PBST，每孔加入含10%牛血清白蛋白（BSA）的PBST封闭缓冲液（见表1），室温孵育30分钟。
- 吸除封闭液，每孔加入200 µL含一抗混合液的PBS（1:500大鼠Ki-67单克隆抗体和1:500兔cleaved caspase-3抗体；见材料表），4 °C孵育过夜。
- 4 °C孵育24小时后，将样本在室温下放置30分钟。
- 在摇床上用PBS洗涤三次，每次10分钟（低速）。
- 吸除PBS，每孔加入200 µL含二抗混合液的PBS（1:200驴抗大鼠IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488；1:200驴抗兔IgG（H+L）高交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647；见材料表），室温避光孵育45分钟。
- 在多功能摇床上用PBS洗涤样本10分钟。
- 吸除PBS，每孔加入200 µL用PBS稀释的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:5,000），孵育1分钟。
- 吸除DAPI（见材料表），用PBS洗涤细胞5分钟。
- 移除腔室框架，每孔加入50 µL PBS:甘油（1:1）混合液，并加盖盖玻片。
- 用指甲油封片。
- 使用共聚焦显微镜系统在20倍物镜下采集图像（见材料表）。
3. 肿瘤细胞增殖与凋亡的定量与分析
注意：为了测量不同β-葡聚糖对肿瘤细胞增殖和凋亡的潜在影响，使用了自行编写的脚本在ImageJ软件中定量Ki67（增殖）和cCasp3（凋亡）阳性像素的数量13。
- 打开 ImageJ。点击 Plugins 按钮。点击此前已安装在插件文件夹中的插件 Coloc2，最后选择要分析的图像11。
注：该插件需事先与 Dr. Vasiliki Economopoulos（veconom@uwo.ca）联系获取。除该脚本外，ImageJ 和 Fiji 软件均提供不同的共定位分析工具（见材料表），其功能特性相似。 - 根据对照组（未处理，仅含 DMEM）条件设置阈值。点击 OK 按钮。
注：为避免背景和强度差异，所有图像必须在相同条件下获取。建议在同一天内完成成像实验，且各图像间的显微镜参数保持不变。 - 确认共定位像素的生成图像以及提供高于阈值像素百分比或原始数量的汇总窗口已弹出。将结果相对于对照组（未处理）条件进行归一化处理。
注：所有数据均表示为均值 ± 标准误（SEM）。统计分析采用图形与数据分析软件进行（见材料表），使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。误差以均值的标准误（s.e.m.）表示（*p < 0.05，**p < 0.01）。
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结果
β-葡聚糖的高效纯化
经提取与纯化流程后，从P. ostreatus、P. djamor、G. lucidum和H. erinaceus子实体中获得的粗多糖（MP）、可溶性多糖组分（SMPs）及纯化β-葡聚糖（SβGs）的质量如表1所示。真菌来源的MP、SMPs和SβGs的基本组成（总碳水化合物、β-葡聚糖和蛋白质）见表2。结果表明，本方案可从SMPs中回收大量蛋白质。然而，经α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶和蛋白酶的酶解处理后，蛋白质含量降低，β-葡聚糖浓度相应提高。
不同SβG的紫外光谱在260 nm和280 nm处均未出现紫外吸收峰（图2A），表明SβG不含核酸（260 nm）和蛋白质（280 nm）。此外，采用紫外-可见吸收光谱-凝胶渗透色谱（SEC）检测SβG的均一性。色谱图（图3）...
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讨论
本研究描述了利用成熟技术成功从四种不同真菌中分离、纯化并表征SβGs成分的方法。结果表明，在对获得的SMPs进行热水提取后， P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum, 和H. erinaceus, 随后通过α-淀粉酶、葡萄糖苷酶和蛋白酶进行水解处理，α-葡聚糖和蛋白质含量显著降低，从而大幅富集了纯化的SβGs。
尽管如此，我们在纯化过程中观察到大多数真菌β-葡聚糖不溶于水。本研究主要关注的是SβGs，因其具有医学/药用特性10,18。此外，通过水解处理、乙醇沉淀和透析，成功去除了SMPs中的可溶性低分子量碳水化合物、多肽、寡肽和氨基酸，其去除效率与其他先前研究结果相似，这些研究虽使用了不同种类的蘑菇，但采用了类似的方法流程19,20。
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披露
不存在任何竞争性利益需要声明。
致谢
我们感谢 Vasiliki Economopoulos 博士提供了用于在 ImageJ 中测量荧光信号的内部脚本。我们还要感谢塞维利亚大学 CITIUS 及其全体工作人员在演示过程中给予的支持。本工作得到了西班牙 FEDER I + D + i-USE 项目（项目编号 US-1264152，来自塞维利亚大学）以及科学、创新与大学部 PID2021-126090OA-I00 项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8孔板载玻片 | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| 空气干燥烘箱 | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| 白蛋白 | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | 蛋白酶 | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| 刀式研磨仪 | Retsch, Germany | SM100 | |
| 牛血清白蛋白 | MERK, Germany | A9418 | |
| 纤维素透析膜管 | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| 离心机 | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| 共定位分析插件 | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| 葡聚糖 | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s 改良 Eagle´s 培养基，含 Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda（α-淀粉酶/葡萄糖淀粉酶） | Novozymes, Denmark | ||
| 胎牛血清 | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| 傅里叶变换红外光谱仪 | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| 绘图与分析软件 | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC 系统 | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| 培养箱 | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| 质谱仪 | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| 多聚甲醛 | MERK, Germany | P6148 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH 计 | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| 兔源裂解型 Caspase-3（Asp175）抗体 | Abcam, UK | ab243998 | |
| 大鼠 Ki-67 单克隆抗体 | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| 旋转蒸发仪 | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| 超羟基凝胶线性凝胶过滤色谱柱（300 mm × 7.8 mm） | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| 紫外-可见分光光度计 | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount 封片剂 | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| 水浴锅 | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| 蔡司 LSM 7 DUO 共聚焦显微镜系统 | Zeiss, Germany | ||
| β-葡聚糖检测试剂盒 | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-葡聚糖 | Setas y Hongos del Sur, S.L. | 提供四种蘑菇变体 |
参考文献
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