小鼠模型可用于研究视网膜色素上皮（RPE）的生物学特性。已有研究表明，小鼠可产生多种RPE病理改变。本文介绍一种表型分析方案，通过光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠RPE的病理变化进行阐明和定量分析。
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摘要
摘要
年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种在老年人群中常见的致残性视网膜疾病。目前普遍认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是 AMD 发生发展中的关键病理生物学事件。为了深入理解导致 RPE 功能障碍的机制，研究人员可利用小鼠模型进行研究。已有前期研究表明，小鼠可出现 RPE 病理改变，其中部分病变特征与被诊断为 AMD 患者眼部所见相似。本文介绍了一种用于评估小鼠 RPE 病理改变的表型分析方案。该方案包括通过光学显微镜和透射电子显微镜对视网膜横切面进行制备与评估，以及通过共聚焦显微镜对 RPE 铺片进行分析。我们详细描述了利用上述技术所观察到的小鼠 RPE 常见病理类型，并介绍了通过无偏倚方法进行定量分析以实现统计检验的具体方式。作为概念验证，我们应用该 RPE 表型分析方案，对过表达跨膜蛋白 135（Tmem135）的小鼠以及老龄野生型 C57BL/6J 小鼠中观察到的 RPE 病理改变进行了量化。本方案的主要目标是为使用 AMD 小鼠模型的科研人员提供标准化的 RPE 表型分析方法，并实现无偏倚的定量评估。
引言
年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种常见的致盲性疾病，主要影响55岁以上人群1。许多研究人员认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD早期且关键的病理生物学事件2。RPE是由单层极性细胞构成的组织，负责维持邻近感光细胞和脉络膜血管的稳态3。目前已有多种模型用于研究RPE中的疾病相关机制，包括细胞培养模型4,5和小鼠模型6,7,8。最近有研究报告了RPE细胞培养模型的标准化操作流程和质量控制标准4，但尚无研究尝试对小鼠模型中RPE的表型分析进行标准化。事实上，许多关于AMD小鼠模型的出版物缺乏对RPE的完整描述或对RPE病理变化的定量分析。本实验方案的总体目标是为使用AMD小鼠模型的科研人员提供标准化的RPE表型分析方法，并进行无偏倚的定量评估。
既往研究通过三种成像技术观察到小鼠中存在多种视网膜色素上皮（RPE）病理改变。例如，光学显微镜可使研究人员观察小鼠视网膜的大体形态（
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方案
所有涉及动物受试者的实验程序均已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物照护与使用委员会的批准，并符合视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明要求。
1. 通过光学显微镜评估小鼠视网膜色素上皮（RPE）
- 在玻璃瓶中配制固定剂缓冲液，室温下终浓度为2%多聚甲醛和2%戊二醛。
注意：本方案每只小鼠最多需要 14 mL 固定缓冲液。
警告：多聚甲醛和戊二醛为有害物质。操作这些物质时，请遵循标准操作规程。 - 在通风橱内的吸水垫上准备重力灌注系统，用于心脏灌注（补充图1A).
- 将40 mL固定缓冲液加入灌注系统的注射器筒中（补充图1B).
- 将阀门旋转至与管路平行，以使缓冲液流经管路（补充图1C用缓冲液冲洗管路，直至管路中的所有气泡完全排出。
- 将阀门旋转至与管路垂直，以阻止缓冲液流入管路（补充图1D).
注意：灌流系统现已准备就绪，可供使用。
- 通过将小鼠放入二氧化碳（CO₂）环境中实施安乐死2）室，并让 CO2 以每分钟30%腔室体积的流速通入腔室。当小鼠停....
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结果
完成本文所述的视网膜色素上皮细胞表型分析方案，可对小鼠年龄相关性黄斑变性模型中常见的视网膜色素上皮细胞结构异常进行定量分析。为验证该方案的有效性，我们将其应用于已知存在视网膜色素上皮细胞病理改变的小鼠，包括过表达野生型的小鼠模型。 Tmem135 由鸡β-肌动蛋白启动子驱动Tmem135 甘油三酯30 以及老龄C57BL/6J小鼠31,32本实验旨在向小鼠模型领域的新进研究人员展示，采用本方案所述方法可获得的代表性结果。
我们严格遵循了以下方法： 步骤 1 用于处理与评估野生型（WT）及 Tmem135 利用光学显微镜评估转基因小鼠视网膜色素上皮病理变化。我们发现4月龄 Tmem135 与年龄匹配的WT小鼠相比，TG小鼠在两个测量时间点的RPE厚度均显著降低，该结果通过方差分析及事后Tukey检验得出（
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讨论
本文介绍了一种用于评估小鼠模型视网膜色素上皮（RPE）结构病理学的表型分析方案。我们详细描述了为进行多种成像技术（包括光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜）而处理眼球所需的步骤，以及对观察到的典型病理学特征进行定量分析的方法。 通过 这些成像方法。我们通过检测验证了RPE表型分析方案的有效性 Tmem135 TG 和 24 月龄的 WT 小鼠，因为这些小鼠表现出 RPE 病理变化30,31,32该方案可应用于任何经基因修饰或药物处理后可能具有视网膜色素上皮（RPE）病变的小鼠，这些病变包括RPE变薄、空泡化、迁移和形态异常，以及Bruch膜异常（BLamDs）6,7尽管在RPE中观察到的病理变化 Tmem135 TG 和 24 月龄的 WT 小鼠存在于其他 AMD 小鼠模型中
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披露
本方案的作者没有披露信息和利益冲突。
致谢
作者谨此感谢木下悟（Satoshi Kinoshita）以及威斯康星大学（UW）病理学转化研究实验室（TRIP）为本研究的组织样本制备了光学显微镜切片。该核心实验室由威斯康星大学病理学与实验室医学系、威斯康星大学卡本癌症中心（P30 CA014520）以及美国国立卫生研究院院长办公室（S10OD023526）提供支持。共聚焦显微镜实验在威斯康星大学生物化学光学核心实验室完成，该实验室的建立得到了威斯康星大学生物化学系基金的支持。本研究还获得了美国国立眼科研究所的资助（R01EY022086，授予A. Ikeda；R01EY031748，授予C. Bowes Rickman；P30EY016665，授予威斯康星大学眼科与视觉科学系；P30EY005722，授予杜克眼科中心；NIH T32EY027721，授予M. Landowski；F32EY032766，授予M. Landowski）、Timothy William Trout讲席基金（A. Ikeda）、FFB Free Family AMD奖（C. Bowes Rickman），以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness）向杜克眼科中心提供的非限定性资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液 pH7.2 | PolyScientiifc R&D Company | S1619 | |
| 100 片容量载玻片盒 | 本方案需要两个（一个用于 H&E 染色的载玻片，另一个用于 RPE 平铺标本）。 | ||
| 100% 乙醇 | MDS Warehouse | 2292-CASE | 可用于本方案中配制稀释的乙醇溶液。 |
| 一通止流阀，两端均为鲁尔锁母接头 | Qosina | 11069 | |
| 1x 磷酸盐缓冲液（PBS） | 本方案中可使用预配制的 1x PBS 溶液。 | ||
| 2.0 mL 微量离心管 | Genesee Scientific | 24-283-LR | |
| 24 孔包埋胶囊替代模具 | Electron Microscopy Sciences | 70165 | |
| 24 英寸带鲁尔接头的 PVC 管 | Fisher Scientific | NC1376778 | |
| 400 目方形网眼铜网（Gilder 细条） | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| 95% 乙醇 | MDS Warehouse | 2293-CASE | |
| 带防水防潮屏障的吸水垫（23 英寸 × 24 英寸） | VWR | 56616-031 | |
| 可调节 237 ml 喷雾瓶 | VWR | 23609-182 | |
| Alexa Fluor488 标记的驴抗兔 IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| 铝箔 | |||
| BD PrecisionGlide 19 号注射器针头 | Sigma-Aldrich | Z192546 | |
| Bracken 镊子；弯型；细齿交叉纹；4" 长，尖端宽度 1 mm | Roboz Surgical Instrument | RS-5211 | 本方案中称为弯头镊子。 |
| 骆驼毛刷 | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 | |
| 二氧化碳安乐死舱 | |||
| 二氧化碳流量计 | |||
| 二氧化碳气罐 | |||
| Castaloy 棘爪延伸夹具 | Fisher Scientific | 05-769-7Q | |
| 铸铁 L 形底座支撑架 | Fisher Scientific | 11-474-207 | |
| Cell Profiler 细胞分析程序 | 可下载地址：https://cellprofiler.org/releases | ||
| 透明指甲油 | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Colorfrost 紫色显微镜载玻片 | VWR | 10118-956 | |
| 计算机 | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-5MG | |
| 蒸馏 H20 | 本方案使用 Milli-Q 纯化系统制备的水。 | ||
| Dumont 细尖镊子；型号 #55 | Roboz Surgical Instrument | RS-4984 | 本方案中称为细尖镊子，共需 3 把（两把用于解剖，一把用于电镜处理）。 |
| 电子显微镜载网夹 | Electron Microscopy Sciences | 71147-01 | |
| EPON 815 树脂 | Electron Microscopy Sciences | 14910 | |
| Epredia Mark-It 组织标记黄色染料 | Fisher Scientific | 22050460 | 使用该组织标记染料时，请遵循制造商的操作说明。 |
| Epredia 封片介质 | Fisher Scientific | 22-110-610 | 用于 H&E 载玻片的封片。 |
| Fiber-Lite Mi-150 系列卤素光源照明器，150 W 卤素光源 | Dolan-Jenner Industries | Mi-150 | 解剖显微镜的光源。 |
| Fiji ImageJ 图像分析程序 | 可下载地址：https://imagej.net/downloads | ||
| Flexaframe Castaloy 钩式连接器 | Thermo Scientific | 14-666-18Q | |
| 通风橱 | |||
| 2.5% 戊二醛磷酸缓冲液，pH 7.4，32% | Electron Microscopy Sciences | 16537-05 | |
| JEM-1400 透射电子显微镜（JEOL），配备 ORIUS (1000) CCD 相机 | |||
| 实验室台式摇床 | 本实验需要两台。一台置于室温，另一台置于 4 摄氏度冷室中。 | ||
| 激光冷冻标签 | Electron Microscopy Sciences | 77564-05 | |
| 柠檬酸铅 | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Leica EM UC7 超薄切片机 | |||
| Leica Reichert Ultracut S 切片机 | |||
| LifterSlips 载片 | Thermo Fisher Scientific | 22X22I24788001LS | 用于 RPE 平铺标本，因其边缘凸起，可容纳 RPE 的厚度。 |
| Mayer 苏木精染液 | VWR | 100504-406 | |
| McPherson-Vannas 微型解剖弹簧剪 | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | 本方案中称为微型解剖剪。 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 小鼠 | 任何年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型及其相应对照均可用于本方案。 | ||
| 微型解剖剪；标准型；弯型；尖端锋利；刀片长 24 mm；总长 4.5" | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | 本方案中称为弯头剪。 |
| Microsoft Excel | |||
| 微量离心管架 | |||
| Nikon A1RS 共聚焦显微镜 | |||
| 正常驴血清 | SouthernBiotech | 0030-01 | |
| 11 号无菌一次性手术刀片 | VWR | 21909-380 | |
| 四氧化锇 | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
| 多聚甲醛，32% | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 铅笔 | |||
| 培养皿 | VWR | 21909-380 | |
| 移液器吸头 | |||
| 移液器 | |||
| 多克隆抗 ZO-1 抗体 | Thermo Fisher Scientific | 402200 | |
| 环氧丙烷 | Electron Microscopy Sciences | 20412 | |
| 剃须刀片 | VWR | 10040-386 | |
| 小鼠灌流用浅盘 | |||
| Shandon 醇溶伊红 Y 染液 | VWR | 89370-828 | |
| Sharpie 超细尖黑色永久性记号笔 | Staples | 642736 | |
| 染色用载玻片架 | Grainger | 49WF31 | |
| 方形盖玻片 | Fisher Scientific | 12-541B | |
| 带盖染色皿 | Grainger | 49WF30 | H&E 染色步骤需要 15 个。 |
| Target 全塑料一次性鲁尔滑动式 50 mL 注射器 | Thermo Scientific | S7510-50 | 仅使用注射器筒体。 |
| 计时器 | Fisher | 1464917 | |
| 醋酸铀 | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| 真空烘箱 | |||
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories | H-1000 | 用于 RPE 平铺标本的封片。 |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | 22050283 | |
| Zeiss Axio Imager 2 光学显微镜 | 该显微镜具备生成 20x 拼接图像的功能。若光学显微镜不具备此功能，则需拍摄整个视网膜的图像，且相邻图像之间应有轻微重叠。使用 Adobe Photoshop 将这些图像拼接在一起。有关图像拼接，请参考 Adobe Photoshop 程序的使用手册。 | ||
| Zeiss Stemi 2000 解剖显微镜 | Electron Microscopy Sciences | 65575-02 |
参考文献
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Bhutto, I., Lutty, G.
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重印与许可
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