需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案

2.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64927

⸱

2023年3月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

本文内容

摘要

小鼠模型可用于研究视网膜色素上皮（RPE）的生物学特性。已有研究表明，小鼠可产生多种RPE病理改变。本文介绍一种表型分析方案，通过光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜对小鼠RPE的病理变化进行阐明和定量分析。

摘要

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种在老年人群中常见的致残性视网膜疾病。目前普遍认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是 AMD 发生发展中的关键病理生物学事件。为了深入理解导致 RPE 功能障碍的机制，研究人员可利用小鼠模型进行研究。已有前期研究表明，小鼠可出现 RPE 病理改变，其中部分病变特征与被诊断为 AMD 患者眼部所见相似。本文介绍了一种用于评估小鼠 RPE 病理改变的表型分析方案。该方案包括通过光学显微镜和透射电子显微镜对视网膜横切面进行制备与评估，以及通过共聚焦显微镜对 RPE 铺片进行分析。我们详细描述了利用上述技术所观察到的小鼠 RPE 常见病理类型，并介绍了通过无偏倚方法进行定量分析以实现统计检验的具体方式。作为概念验证，我们应用该 RPE 表型分析方案，对过表达跨膜蛋白 135（Tmem135）的小鼠以及老龄野生型 C57BL/6J 小鼠中观察到的 RPE 病理改变进行了量化。本方案的主要目标是为使用 AMD 小鼠模型的科研人员提供标准化的 RPE 表型分析方法，并实现无偏倚的定量评估。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种常见的致盲性疾病，主要影响55岁以上人群1。许多研究人员认为，视网膜色素上皮（RPE）功能障碍是AMD早期且关键的病理生物学事件2。RPE是由单层极性细胞构成的组织，负责维持邻近感光细胞和脉络膜血管的稳态3。目前已有多种模型用于研究RPE中的疾病相关机制，包括细胞培养模型4,5和小鼠模型6,7,8。最近有研究报告了RPE细胞培养模型的标准化操作流程和质量控制标准4，但尚无研究尝试对小鼠模型中RPE的表型分析进行标准化。事实上，许多关于AMD小鼠模型的出版物缺乏对RPE的完整描述或对RPE病理变化的定量分析。本实验方案的总体目标是为使用AMD小鼠模型的科研人员提供标准化的RPE表型分析方法，并进行无偏倚的定量评估。

既往研究通过三种成像技术观察到小鼠中存在多种视网膜色素上皮（RPE）病理改变。例如，光学显微镜可使研究人员观察小鼠视网膜的大体形态（图1A），并检测RPE变薄、空泡化及迁移等RPE病理变化。在年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型中，RPE变薄表现为RPE高度与其相应对照组相比出现偏离（图1B）。RPE空泡化可分为两类：微空泡化（图1C）和巨空泡化（图1D）。RPE微空泡化表现为RPE内出现空泡但不影响其整体高度；而巨空泡化则表现为空泡突入光感受器外节。RPE迁移在视网膜横切面中表现为色素在RPE单层上方局灶性聚集（图1E）。值得注意的是，来自AMD供体眼的迁移性RPE细胞对免疫细胞标志物（如分化簇68（CD68））呈免疫反应阳性9，这可能代表免疫细胞正在吞噬RPE碎片，或RPE细胞正在发生转分化9。另一种称为透射电子显微镜的成像技术可使研究人员观察RPE及其基底膜的超微结构（图2A）。该技术可用于识别小鼠中主要的RPE下沉积物，即基底层状沉积物（BLamD）（图2B）10。最后，共聚焦显微镜可通过成像RPE铺片来揭示RPE细胞的结构（图3A）。该方法可揭示RPE形态异常，即RPE偏离其经典的蜂窝状结构（图3B）；还可检测RPE多核现象，即一个RPE细胞内存在三个或更多细胞核（图3C）。关于当前AMD小鼠模型中存在的RPE病理类型综述，我们建议研究人员参考文献中的相关综述6,7。

研究年龄相关性黄斑变性（AMD）的研究人员在进行表型分析实验前，应了解使用小鼠研究视网膜色素上皮（RPE）病理变化的优缺点。小鼠的优势在于其相对较短的寿命、成本低廉，以及易于进行遗传学和药理学操作。此外，小鼠也会出现与AMD供体眼组织中观察到的相似的RPE退行性改变，包括RPE细胞迁移、形态异常和多核化现象11,12,13,14,15,16,17；这表明小鼠和人类RPE病理变化的发生机制可能存在相似之处。然而，也存在一些关键差异，限制了小鼠研究结果向人类AMD的转化应用。首先，小鼠缺乏黄斑——这是人类视网膜中一个解剖结构独特的区域，对视觉敏锐度至关重要，且在AMD中易受累。其次，某些在小鼠中出现的RPE病理改变，如RPE变薄和空泡化，在AMD供体眼中通常并不常见18。第三，小鼠不会形成AMD病理特征性的玻璃膜疣（drusen）19。玻璃膜疣是位于RPE基底膜与Bruch膜（BrM）内层胶原层之间的沉积物，含有脂质和蛋白质，但几乎不含基底膜蛋白19。玻璃膜疣在成分和解剖位置上均不同于小鼠常见的RPE下沉积物BLamD。BLamD是随年龄和应激累积而形成的富含细胞外基质的异常结构，位于BrM的RPE基底膜与RPE基底皱褶之间20。有趣的是，BLamD在小鼠和人类中的蛋白质组成及形态表现相似6,10,21。近期研究表明，BLamD可能通过影响AMD向晚期阶段的进展而在其发病机制中发挥作用18,22；因此，这类沉积物可能代表了小鼠视网膜中病变的RPE。了解这些优势与局限性，对于希望将小鼠研究结果转化为AMD相关发现的研究人员至关重要。

在本实验方案中，我们讨论了为明场显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜制备眼球样本的方法，以观察视网膜色素上皮（RPE）的病理变化。我们还描述了如何以无偏倚的方式对RPE病理变化进行量化，以便进行统计学分析。作为概念验证，我们应用该RPE表型分析方案，研究跨膜蛋白135（Tmem135）过表达小鼠以及老龄野生型（WT）C57BL/6J小鼠中观察到的RPE结构病理改变。总之，我们的目标是描述一种用于表征年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型中RPE特征的表型分析方法，因为目前尚无标准操作流程可供参考。需要指出的是，本方案主要针对RPE，对于希望研究光感受器或脉络膜病理变化（这些结构在AMD小鼠模型中亦受影响）的研究人员，本方案可能不适用于其研究目的。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有涉及动物受试者的实验程序均已获得威斯康星大学麦迪逊分校机构动物照护与使用委员会的批准，并符合视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明要求。

1. 通过光学显微镜评估小鼠视网膜色素上皮（RPE）

  1. 在玻璃瓶中配制固定剂缓冲液，室温下终浓度为2%多聚甲醛和2%戊二醛。
    注意：本方案每只小鼠最多需要 14 mL 固定缓冲液。
    警告：多聚甲醛和戊二醛为有害物质。操作这些物质时，请遵循标准操作规程。
  2. 在通风橱内的吸水垫上准备重力灌注系统，用于心脏灌注（补充图1A).
    1. 将40 mL固定缓冲液加入灌注系统的注射器筒中（补充图1B).
    2. 将阀门旋转至与管路平行，以使缓冲液流经管路（补充图1C用缓冲液冲洗管路，直至管路中的所有气泡完全排出。
    3. 将阀门旋转至与管路垂直，以阻止缓冲液流入管路（补充图1D).
      注意：灌流系统现已准备就绪，可供使用。
  3. 通过将小鼠放入二氧化碳（CO₂）环境中实施安乐死2）室，并让 CO2 以每分钟30%腔室体积的流速通入腔室。当小鼠停止呼吸后，允许CO2 至少让液体流入腔室1分钟。在进入下一步之前，确认小鼠已死亡。
    注意：本方案中可采用注射药剂的方式实施安乐死，作为 CO 的替代方法2 吸入
  4. 对安乐死小鼠进行心脏灌注。
    1. 将小鼠转移至灌注系统附近的浅盘中，使其腹部朝上。用70%乙醇（EtOH）喷洒腹部。
    2. 做四个切口以暴露腹腔（补充图 2A).
      1. 使用弯剪和镊子在小鼠最左侧、紧邻肋弓下方的部位，沿皮肤和腹壁做一条5 cm长的向下切口。
      2. 从下切口顶端开始，沿中线方向穿过小鼠皮肤和腹壁进行3 cm的切口。
      3. 在小鼠最右侧肋骨下方的皮肤和腹壁上，沿内侧切口末端再做一个5 cm的向下切口。
      4. 用弯钳做另一个3 cm的内侧切口，以去除腹部皮瓣。
    3. 剪开膈肌和胸骨以暴露心脏（补充图 2B).
      注意：需小心避免划伤心脏、动脉和静脉。划伤这些组织将导致心脏灌注效率降低。
    4. 将测压针插入心脏的左心室。旋转阀门，使其与导管管路平行。用弯剪刀剪开右心房，以使血液和固定液能够从心脏流出。补充图 2C).
    5. 让10 mL固定缓冲液灌注小鼠，持续至少1-2分钟，或直至肝脏颜色变浅且右心房无血液流出。灌注完成后，旋转阀门至与管路垂直，以停止缓冲液流动。
  5. 在心脏灌注后摘除小鼠眼球。
    1. 将小鼠从浅盘中取出，置于通风橱内的吸水垫上。调整小鼠头部方向，使左眼朝向实验操作者，右眼背向不可见。用组织标记染料在眼睛的上方侧做标记。
    2. 用拇指和食指轻轻按压眼眶周围，使眼球从眼眶中突出补充图 3A).
    3. 取弯剪，将其以与眼眶成30°角的方向持握。沿眼球周围以30°角用弯剪进行剪切（补充图3B).
      注意：可以切除眼窝中多余的组织，以保持眼球的完整性。
    4. 用弯头镊子将眼球从头部取出，并置于吸水垫上。用11号手术刀片在角膜上切开一小口，然后用弯头镊子将眼球放入含有2 mL固定缓冲液的2 mL微量离心管中。用小鼠编号和“左”字标记该2 mL微量离心管，以标识左眼。
      注意：角膜上的切口可使固定剂充分渗透眼球，从而更好地保存组织。
    5. 对右眼重复步骤 1.5.1–1.5.4。
  6. 将眼球置于固定缓冲液中，在4摄氏度（°C）摇床中孵育过夜 室温下，以每分钟75转（rpm）的速度进行。
  7. 用 2 mL 1× 磷酸盐缓冲液替换固定液缓冲液 （PBS）。将眼球置于1×PBS中，在室温下以75 rpm于摇床孵育10分钟。重复此步骤两次。
  8. 清洗并解剖眼球以制备后段组织。
    注意：后段是指小鼠眼球中包含神经视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜和巩膜的部分，不含角膜、虹膜和晶状体。
    1. 将眼睛置于盛有1×PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作补充图 4A).
    2. 用精细尖头镊子轻轻将眼球周围的脂肪和肌肉剥离。使用显微解剖剪沿与眼球平行的方向仔细修剪脂肪和肌肉组织，直至眼球表面呈现均匀的蓝黑色。补充图 4B).
      注意：切勿沿垂直方向切割，以免损伤眼球。此外，若在处理过程中组织标记染料脱落，应立即重新标注眼球的上方位置。
    3. 在角膜穿刺处放置尖头镊子，使用显微解剖剪从穿刺点开始沿角膜边缘剪切，以去除眼球上的角膜和虹膜（补充图 4C).
    4. 用精细镊子轻轻将晶状体从眼球中取出，以获得视网膜后段（补充图 4D).
    5. 将后段组织放回含有2 mL 1×PBS的2 mL微量离心管中，于4 °C冰箱中保存。
      注意：后段组织在进一步处理前可置于4 °C的1x PBS中保存数周。
  9. 重复步骤 1.3–1.8，以制备本研究中其他小鼠的眼部样本。
  10. 将每只小鼠的一个后段组织进行处理，并包埋于石蜡中以备切片。确保后段组织的上方侧朝上。
    注意：作者依赖威斯康星大学麦迪逊分校（UW）病理学转化研究倡议（TRIP）实验室来完成这些操作。以下为采用类似石蜡处理与包埋方法的已发表实验方案23,24.
  11. 修整每个石蜡包埋块并进行切片，获得包含视神经乳头的5 µm厚视网膜切片，以及另外四张相互间隔250 µm的5 µm厚视网膜切片。在载玻片上标记小鼠编号及连续切片序号（即1、2、3、4或5）。将载玻片存放于载玻片盒中。
    注意：作者依赖威斯康星大学TRIP实验室提供的石蜡切片服务。以下为采用类似石蜡切片方法的已发表实验方案25,26.
  12. 用苏木精和伊红（H&E）。一种H&E染色可见于 补充图5.
    注意：H 的所有步骤&E 染色步骤必须在通风橱中完成。
  13. 采集H的拼接图像&使用20倍物镜的光学显微镜观察苏木精-伊红染色的视网膜切片，并附比例尺。
  14. 量化每个样本包含视神经乳头的视网膜图像中的视网膜色素上皮（RPE）厚度。
    1. 下载并打开 Fiji ImageJ 程序。将所有包含视神经乳头的拼接视网膜图像拖入 Fiji ImageJ 任务栏中。确认图像比例尺已校准为 µm 而非像素。
      注意：图像比例尺位于 Fiji ImageJ 程序中包含视网膜图像的窗口左上角。若比例尺单位为像素，请参考 Fiji ImageJ 程序的使用手册，将像素转换为 µm。
    2. 从视神经乳头边缘到视网膜末端（锯齿缘），在每张图像中每隔 300 µm 标记一次。点击 直的 Fiji ImageJ 工具栏中的图标。从视神经头边缘向锯齿缘方向点击并拖动一条长度为 300 µm 的直线。点击 画笔 在 Fiji ImageJ 工具栏中选择工具，然后单击 300 µm 标尺线的末端以标记该位置。
    3. 在每个标记的区间测量RPE厚度。单击 直的 Fiji ImageJ 工具栏中的图标。从 RPE 的顶部到底部单击并拖动一条线补充图6）。点击 分析 > 测量 在 Fiji ImageJ 菜单栏中获取 RPE 厚度。
    4. 将RPE厚度测量值导入电子表格，并在包含测量值的列中标注小鼠编号。另设一列标注为“标记区间”，并输入距视神经的距离值（如300、600、900等）。
      注意：第一个测量区间对应视神经后方300 µm处，第二个测量区间对应600 µm处，依此类推。
  15. 根据每个样本的视网膜图像量化RPE病理发生率。
    1. 打开 Fiji ImageJ 程序。
    2. 打开 细胞计数仪 Fiji ImageJ 程序中的应用。单击 插件 > 分析 > 细胞计数仪 在 Fiji ImageJ 菜单栏中。将视网膜图像拖入 Fiji ImageJ 任务栏并点击 初始化 在 细胞计数仪 窗口
    3. 使用视网膜切片计数每张切片中RPE病变的数量 细胞计数仪 应用。点击 1型 在……下方 计数器 然后点击图像中的所有微空泡化事件。点击 2型 在……下方 计数器 然后点击图像中的所有大空泡化事件。点击 3型 在……下方 计数器 然后点击图像中的所有单个迁移事件。
    4. 将RPE病理变化的数量记录到电子表格中。以微囊样空泡化、大囊样空泡化或细胞迁移标注行，以小鼠编号标注列。
    5. 重复步骤 1.15.2–1.15.4，处理样本的其他图像。计算每个样本中 RPE 病理的数量平均值，并除以 5，以在电子表格中计算该样本每种 RPE 病理的发生率。
  16. 对各时间间隔的RPE厚度及RPE病理发生率进行统计学分析，以确定研究组间是否存在显著差异。

2. 通过透射电子显微镜评估小鼠视网膜色素上皮

  1. 将步骤1.5–1.9中获得的其余后段组织用剃刀刀片沿背侧标记线纵向切成两半，分为两个部分。使用组织标记染料重新标记分割后组织块的背侧。将分割后的后段组织分别放入新的2 mL微量离心管中，每管加入2 mL 1×PBS，并标注小鼠编号。
    注意：小鼠眼后段过大，无法整体处理，必须切成两半后再进行透射电子显微镜制样。
  2. 用 2 mL 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗组织。室温下在实验台上孵育 10 分钟。重复此步骤两次。
  3. 用2 mL的2%四氧化锇（OsO₄）替换0.1 M卡可基酸盐缓冲液4) 用 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液稀释，在通风橱中室温孵育 1.5 小时。
    警告：OsO4 是一种有毒物质。操作四氧化锇（OsO₄）时，请遵循标准操作规程。4.
  4. 在通风橱中，于室温下用 2 mL 0.1 M 卡可基酸盐缓冲液冲洗组织 10 分钟。重复此步骤一次。
  5. 在通风橱中，于室温下使用浓度递增的乙醇（50%至100%）对组织进行脱水。脱水操作的具体步骤可参见 补充图7.
  6. 从组织中移除100%乙醇，加入2 mL丙烯酸甲酯。在通风橱中室温孵育15分钟。移除丙烯酸甲酯，向组织中加入2 mL新鲜丙烯酸甲酯。在通风橱中室温孵育15分钟。
    警告：环氧丙烷是一种有毒物质。操作环氧丙烷时，请遵循标准操作规程。
  7. 除去组织中的丙烯氧化物，加入2 mL丙烯氧化物与树脂的1:1混合液。于室温下在通风橱中真空处理过夜。
    警告：树脂对人体有害。操作树脂时，请遵循实验室的标准操作规程。
  8. 用2 mL纯树脂替换组织中丙烯酸环氧丙烷与树脂的1:1混合液，于室温下在通风橱中真空放置过夜。
  9. 将组织包埋于树脂中。在模具中放入用铅笔标注小鼠编号的标签，并加入一滴树脂。将组织置于树脂滴上，随后充满模具，置于通风橱内室温下抽真空1小时。
  10. 用尖头镊子重新放置标签和样本，将后部眼杯切片的背面朝上。将模具置于通风橱内的烘箱中，在 65 °C 下过夜。
  11. 将模具从烤箱中取出，在实验台上静置至室温冷却。从模具中取出组织块。
    注意：组织块现已准备好进行修整。
  12. 用剃刀将树脂块修整成梯形。使用切片机修块，直至视神经头可见。随后使用金刚石刀从树脂块上切下厚度为0.5 µm的半薄切片。
    注意：以下是一篇已发表的关于切片机切片的实验方案27如有需要，可从树脂块中收集0.5 µm厚的半薄切片并进行染色，以评估样品的完整性。
  13. 使用超薄切片机从每个修整好的包埋块上切下70 nm厚的超薄切片。将70 nm厚的超薄切片收集到400目细栅铜网上。将铜网放入网格储存盒中，并在对应槽位标记小鼠编号。
    注意：以下是一篇已发表的超薄切片机切片实验方案28.
  14. 在通风橱中，室温下先用2%醋酸铀酰染色5分钟，再用3.5%柠檬酸铅溶液染色5分钟。
    警告：醋酸铀酰和柠檬酸铅为有害物质。操作这些物质时，请遵循标准操作规程。
  15. 使用透射电子显微镜以15,000倍放大倍数获取每个样本的图像，其中铜网的网格线与视网膜色素上皮（RPE）和Bruch膜（BrM）相交。
    注意：每个切片应至少包含20至35张图像，每个样本应包含40至70张图像。
  16. 量化研究中各样本图像中BLamD的高度。
    1. 打开 Fiji ImageJ 程序。将样本部分的所有图像拖入 Fiji ImageJ 任务栏中。确认图像的单位已校准为 μm 而非像素。
    2. 测量图像中BLamD的高度。点击 直的 Fiji ImageJ 任务栏中的图标。从 BrM 的弹性层到图像中最高沉积物的顶端，点击并拖动一条线补充图8）。点击 分析 > 测量 在 Fiji ImageJ 菜单栏中获取图像中的 BLamD 高度。
      注意：如果图像中没有布鲁赫膜（BrM）的弹性层，则从布鲁赫膜的弹性层画一条线至视网膜色素上皮（RPE）的基底膜。
    3. 将 BLamD 高度数据导入电子表格，并标注小鼠编号。
  17. 在电子表格中计算每种基因型的BLamD高度的累积频率以及每只小鼠BLamD高度的平均值。对BLamD高度的平均值进行统计学分析，以确定研究中各组之间是否存在显著差异。

通过共聚焦显微镜评估小鼠视网膜色素上皮

  1. 从实验小鼠中采集眼球。按照步骤1.3所述方法处死小鼠。采用步骤1.5的方法摘除眼球。使用弯头镊子将眼球放入含有2 mL 1×PBS并标记小鼠编号的2 mL微量离心管中。
    注意：不要对小鼠进行暗适应，因为感光细胞与视网膜色素上皮（RPE）顶突的交错结构有利于通过共聚焦显微镜更清晰地观察RPE。
  2. 立即清洁并解剖小鼠眼球，以制备小鼠眼球后段。
    注意：后部眼杯与后段不同，因为它不包含神经视网膜。
    1. 将眼球转移至含有1x PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作（补充图 9A).
    2. 按照步骤1.8.2所述，去除眼球上的脂肪和肌肉补充图 9B).
    3. 用11号手术刀片在眼球角膜上做切口。按照步骤1.8.3所述，移除角膜和虹膜。补充图 9C).
    4. 用精细镊子取出晶状体。取两把精细镊子，轻轻将神经视网膜从眼球后段分离。
    5. 小心地在视神经乳头处切断神经视网膜，以便从眼球后杯状结构上分离取出（补充图9D).
    6. 将后部眼杯放入含有500 µL 1x PBS并标记小鼠编号的新2 mL微量离心管中。
  3. 用甲醇（MeOH）固定后部眼杯（补充图10).
    注意：步骤 3.3 需要约 2 小时 40 分钟完成。
    1. 向组织中加入 500 µL 甲醇，在室温下以 75 rpm 振荡孵育 5 分钟。
    2. 从组织中移除500 µL溶液，加入500 µL甲醇。在室温下以75 rpm振荡孵育5 min。重复此步骤一次。
    3. 移除组织中的全部溶液，加入 500 µL 甲醇。在室温下以 75 rpm 的转速振荡孵育至少 2 小时。
      注意：作为步骤 3.3.3 的替代方案，可将后部眼杯置于 MeOH 中，在 4 °C 条件下以 75 rpm 转速于摇床中孵育过夜。
    4. 加入 500 µL 1x PBS 至组织中。于室温下在摇床中以 75 rpm 振荡孵育 5 分钟。
    5. 从组织中移除500 µL溶液，加入500 µL 1x PBS。在室温下以75 rpm振荡孵育5分钟。重复此步骤一次。
    6. 移除组织中的全部溶液，并加入500 µL的1x PBS。
      注意：组织已通过甲醇完全固定，可在4 °C冰箱中保存至少1个月。
  4. 对后部眼杯进行免疫荧光染色，以观察视网膜色素上皮（RPE）的紧密连接和细胞核补充图11).
    1. 移除样品中的 500 µL 1x PBS，加入 100 µL 用 1x PBS 稀释的 10% 正常驴血清溶液。在室温下以 75 rpm 振荡孵育 30 分钟。
    2. 从样本中移除稀释的10%正常驴血清溶液，加入100 µL以1x PBS按1:50稀释的兔多克隆抗Zonula Occludens-1（ZO-1）抗体溶液。将样本转移至4 °C环境中，在75 rpm转速下于摇床中孵育过夜。
    3. 从样本中移除抗体稀释液，加入2 mL 1×PBS。在室温下以75 rpm于摇床上孵育10分钟。重复此步骤两次。
    4. 移除样本中的1×PBS。向样本中加入100 µL含1:250稀释的驴抗兔IgG抗体（偶联488荧光染料）和1:250稀释的4',6-二脒基-2'-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）的1×PBS溶液。用铝箔包裹样本，于室温在75 rpm摇床上孵育2小时。
      注意：样品必须完全用铝箔覆盖，以防止光漂白。
    5. 移除样本中的抗体和DAPI稀释液。向样本中加入2 mL 1×PBS，重新用铝箔覆盖，在室温下以75 rpm振荡孵育10分钟。重复此步骤三次。
      注意：视网膜色素上皮细胞的紧密连接和细胞核现已分别被完全标记和染色。
  5. 将后部眼杯固定在显微镜载玻片上。
    1. 用小鼠编号标记载玻片。在解剖显微镜下，将后部眼杯转移至载玻片上，使脉络膜面朝下。向后部眼杯添加一滴1×PBS，以防止其干燥。补充图12).
    2. 使用11号手术刀片在后部眼杯的四个位置进行切割，形成对应于四个基本方向（即北、东、南、西）的四个象限。用纸巾轻轻吸去后部眼杯边缘多余的1×PBS。用骆毛刷和尖头镊子轻轻将后部眼杯展平补充图12).
      注意：所得产物现称为RPE平铺片。
    3. 在RPE平铺样本上滴加一滴封片剂，然后盖上盖玻片。用透明指甲油密封盖玻片边缘，置于密闭抽屉中室温下干燥至少30分钟。将载玻片放入载玻片盒中，并将盒子存放在4 °C冰箱中。
      注意：进行RPE平铺制备时需小心避免产生气泡。RPE平铺样本可在两周内进行成像。
  6. 在共聚焦显微镜下以20倍放大倍数获取每份样本RPE平铺片视神经周围四个象限的图像。RPE平铺片图像示例见于 补充图13A.
    注意：可能需要对视网膜色素上皮（RPE）平铺样本进行z轴层扫成像，即采集多幅图像并叠加，以补偿RPE平铺样本的三维结构差异。
  7. 在每张RPE平铺图像中描记RPE细胞的紧密连接。描记后的RPE平铺图像示例可参见 补充图 13B.
    1. 打开 Fiji ImageJ 程序。将一张 RPE 平铺图像拖入 Fiji ImageJ 任务栏中。确认图像的标定单位为微米而非像素。
    2. 双击 叠加画笔工具 在 Fiji ImageJ 任务栏中点击图标，将画笔宽度设置为 3，透明度设置为 0，颜色设置为红色。点击 关闭 按钮在 叠加画笔工具 窗口。
    3. 点击 叠加画笔工具 图标。点击并拖动图像中所有完整显示的RPE细胞的紧密连接。
      注意：如果出现描迹错误，可双击该轨迹 叠加画笔工具 图标并单击 撤销 框内 叠加画笔工具 窗口以从图像中移除描迹错误。
    4. 点击 矩形 Fiji ImageJ 工具栏中的图标。单击图像并围绕图像边缘拖动。单击 编辑 > 清晰 在 Fiji ImageJ 菜单栏中操作，以保留 traced 线条并从图像中去除所有蓝色和绿色。
    5. 将轨迹图像保存至适当位置，文件名需包含小鼠编号、象限位置（如北、南、东或西）以及“CP”后缀标签。
      注意：在完成步骤 3.7.4 之前，不要保存 RPE 追踪图像。
  8. 计算每个样本的RPE细胞面积。
    1. 在计算机桌面屏幕上创建一个文件夹，用于指定保存RPE区域分析结果的存储位置。为每张RPE轨迹图像生成子文件夹，并以小鼠编号及象限位置（即：北、南、东或西）命名各子文件夹。
    2. 安装并打开 Cell Profiler 程序29下载 Ikeda_RPE 面积计算器.cpproj（补充编码文件 1）项目文件。通过点击打开 Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj 文件 文件 > 打开项目 在 Cell Profiler 程序菜单栏中。
    3. 将一张RPE追踪图像拖入 图像 > 将文件和文件夹拖放到此处 Cell Profiler 程序窗口中的框
    4. 将对应于RPE轨迹图像的文件夹位置输入Cell Profiler程序中。点击 输出设置 程序窗口左下角的按钮，并在其中输入文件夹的位置 默认输入文件夹 和 默认输出文件夹 文本框
    5. 点击 分析图像 位于 Cell Profiler 程序窗口左下角的按钮。分析完成后，一个 分析完成 屏幕上将出现一个窗口。单击 好的 按钮 分析完成 窗口
      注意：此操作将生成一个 csv 文件和一个 jpeg 图像。csv 文件将包含追踪图像中 RPE 细胞的面积数据。jpeg 图像将对应 RPE 追踪图像，其中每个 RPE 细胞将被标上一个数字补充图13C).
    6. 将csv文件中的RPE区域数据转移至电子表格中，并以小鼠编号对电子表格进行标记。
    7. 通过确认CSV文件中的每个RPE区域均对应于JPEG图像中一个完整勾画的RPE细胞，对数据进行质量控制检查。从电子表格中删除任何不对应于完整勾画RPE细胞的数值。
    8. 返回 Cell Profiler 程序。在 RPE 迹线图像名称上右键单击 将文件和文件夹拖放至此处 盒子并选择 清除列表 从Cell Profiler程序中移除图像。
    9. 重复步骤 3.8.3–3.8.8，以计算该样本其余三幅 RPE 追迹图像的 RPE 大小。
  9. 在电子表格中量化每个样本的RPE细胞大小平均值。
  10. 在电子表格中量化每个样本的视网膜色素上皮（RPE）细胞密度。计算RPE细胞密度时，将每个象限中RPE细胞的总数除以Cell Profiler程序检测到的该象限RPE细胞的总面积。取每个样本四个象限RPE细胞密度的平均值。
  11. 量化每个样本的RPE平铺标本中多核RPE细胞的数量。使用 细胞计数仪 使用 Fiji ImageJ 程序中的应用，按照步骤 1.15.1–1.15.3 所述，对样本四个象限中细胞核数量超过三个的视网膜色素上皮（RPE）细胞进行计数。
  12. 对RPE细胞大小和密度的平均值以及多核RPE细胞数量进行统计学分析，以确定研究各组之间是否存在显著差异。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

完成本文所述的视网膜色素上皮细胞表型分析方案，可对小鼠年龄相关性黄斑变性模型中常见的视网膜色素上皮细胞结构异常进行定量分析。为验证该方案的有效性，我们将其应用于已知存在视网膜色素上皮细胞病理改变的小鼠，包括过表达野生型的小鼠模型。 Tmem135 由鸡β-肌动蛋白启动子驱动Tmem135 甘油三酯30 以及老龄C57BL/6J小鼠31,32本实验旨在向小鼠模型领域的新进研究人员展示，采用本方案所述方法可获得的代表性结果。

我们严格遵循了以下方法： 步骤 1 用于处理与评估野生型（WT）及 Tmem135 利用光学显微镜评估转基因小鼠视网膜色素上皮病理变化。我们发现4月龄 Tmem135 与年龄匹配的WT小鼠相比，TG小鼠在两个测量时间点的RPE厚度均显著降低，该结果通过方差分析及事后Tukey检验得出（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文介绍了一种用于评估小鼠模型视网膜色素上皮（RPE）结构病理学的表型分析方案。我们详细描述了为进行多种成像技术（包括光学显微镜、透射电子显微镜和共聚焦显微镜）而处理眼球所需的步骤，以及对观察到的典型病理学特征进行定量分析的方法。 通过 这些成像方法。我们通过检测验证了RPE表型分析方案的有效性 Tmem135 TG 和 24 月龄的 WT 小鼠，因为这些小鼠表现出 RPE 病理变化30,31,32该方案可应用于任何经基因修饰或药物处理后可能具有视网膜色素上皮（RPE）病变的小鼠，这些病变包括RPE变薄、空泡化、迁移和形态异常，以及Bruch膜异常（BLamDs）6,7尽管在RPE中观察到的病理变化 Tmem135 TG 和 24 月龄的 WT 小鼠存在于其他 AMD 小鼠模型中

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

本方案的作者没有披露信息和利益冲突。

致谢

作者谨此感谢木下悟（Satoshi Kinoshita）以及威斯康星大学（UW）病理学转化研究实验室（TRIP）为本研究的组织样本制备了光学显微镜切片。该核心实验室由威斯康星大学病理学与实验室医学系、威斯康星大学卡本癌症中心（P30 CA014520）以及美国国立卫生研究院院长办公室（S10OD023526）提供支持。共聚焦显微镜实验在威斯康星大学生物化学光学核心实验室完成，该实验室的建立得到了威斯康星大学生物化学系基金的支持。本研究还获得了美国国立眼科研究所的资助（R01EY022086，授予A. Ikeda；R01EY031748，授予C. Bowes Rickman；P30EY016665，授予威斯康星大学眼科与视觉科学系；P30EY005722，授予杜克眼科中心；NIH T32EY027721，授予M. Landowski；F32EY032766，授予M. Landowski）、Timothy William Trout讲席基金（A. Ikeda）、FFB Free Family AMD奖（C. Bowes Rickman），以及防盲研究组织（Research to Prevent Blindness）向杜克眼科中心提供的非限定性资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 M 卡可基酸盐缓冲液 pH7.2PolyScientiifc R&D CompanyS1619
100 片容量载玻片盒本方案需要两个（一个用于 H&E 染色的载玻片，另一个用于 RPE 平铺标本）。
100% 乙醇 MDS Warehouse2292-CASE可用于本方案中配制稀释的乙醇溶液。
一通止流阀，两端均为鲁尔锁母接头Qosina11069
1x 磷酸盐缓冲液（PBS）本方案中可使用预配制的 1x PBS 溶液。 
2.0 mL 微量离心管Genesee Scientific 24-283-LR
24 孔包埋胶囊替代模具Electron Microscopy Sciences70165
24 英寸带鲁尔接头的 PVC 管Fisher ScientificNC1376778
400 目方形网眼铜网（Gilder 细条）Electron Microscopy SciencesT400-Cu
95% 乙醇MDS Warehouse2293-CASE
带防水防潮屏障的吸水垫（23 英寸 × 24 英寸）VWR56616-031
可调节 237 ml  喷雾瓶VWR23609-182
Alexa Fluor488 标记的驴抗兔 IgG Thermo Fisher ScientificA-21206
铝箔
BD PrecisionGlide 19 号注射器针头Sigma-Aldrich Z192546
Bracken 镊子；弯型；细齿交叉纹；4" 长，尖端宽度 1 mmRoboz Surgical InstrumentRS-5211本方案中称为弯头镊子。
骆驼毛刷Electron Microscopy Sciences65575-02
二氧化碳安乐死舱
二氧化碳流量计
二氧化碳气罐
Castaloy 棘爪延伸夹具Fisher Scientific 05-769-7Q
铸铁 L 形底座支撑架Fisher Scientific 11-474-207
Cell Profiler 细胞分析程序可下载地址：https://cellprofiler.org/releases
透明指甲油Electron Microscopy Sciences72180
Colorfrost 紫色显微镜载玻片VWR10118-956
计算机
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
蒸馏 H20本方案使用 Milli-Q 纯化系统制备的水。
Dumont 细尖镊子；型号 #55Roboz Surgical InstrumentRS-4984本方案中称为细尖镊子，共需 3 把（两把用于解剖，一把用于电镜处理）。
电子显微镜载网夹Electron Microscopy Sciences71147-01
EPON 815 树脂Electron Microscopy Sciences14910
Epredia Mark-It 组织标记黄色染料Fisher Scientific 22050460使用该组织标记染料时，请遵循制造商的操作说明。 
Epredia 封片介质Fisher Scientific22-110-610用于 H&E 载玻片的封片。 
Fiber-Lite Mi-150 系列卤素光源照明器，150 W 卤素光源Dolan-Jenner IndustriesMi-150解剖显微镜的光源。
Fiji ImageJ 图像分析程序可下载地址：https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy 钩式连接器Thermo Scientific  14-666-18Q
通风橱
2.5% 戊二醛磷酸缓冲液，pH 7.4，32%Electron Microscopy Sciences16537-05
JEM-1400 透射电子显微镜（JEOL），配备 ORIUS (1000) CCD 相机
实验室台式摇床本实验需要两台。一台置于室温，另一台置于 4 摄氏度冷室中。
激光冷冻标签Electron Microscopy Sciences77564-05
柠檬酸铅Electron Microscopy Sciences17800
Leica EM UC7 超薄切片机
Leica Reichert Ultracut S 切片机
LifterSlips 载片Thermo Fisher Scientific22X22I24788001LS用于 RPE 平铺标本，因其边缘凸起，可容纳 RPE 的厚度。
Mayer 苏木精染液VWR100504-406
McPherson-Vannas 微型解剖弹簧剪Roboz Surgical InstrumentRS-5600本方案中称为微型解剖剪。 
甲醇Fisher Scientific A412-4
小鼠任何年龄相关性黄斑变性（AMD）小鼠模型及其相应对照均可用于本方案。
微型解剖剪；标准型；弯型；尖端锋利；刀片长 24 mm；总长 4.5"Roboz Surgical InstrumentRS-5913本方案中称为弯头剪。
Microsoft Excel
微量离心管架
Nikon A1RS 共聚焦显微镜
正常驴血清SouthernBiotech0030-01
11 号无菌一次性手术刀片VWR21909-380
四氧化锇 Electron Microscopy Sciences19150
多聚甲醛，32%Electron Microscopy Sciences15714-S
铅笔
培养皿VWR 21909-380
移液器吸头
移液器 
多克隆抗 ZO-1 抗体Thermo Fisher Scientific402200
环氧丙烷Electron Microscopy Sciences20412
剃须刀片VWR10040-386
小鼠灌流用浅盘
Shandon 醇溶伊红 Y 染液VWR89370-828
Sharpie 超细尖黑色永久性记号笔Staples642736
染色用载玻片架Grainger49WF31
方形盖玻片Fisher Scientific 12-541B
带盖染色皿Grainger49WF30H&E 染色步骤需要 15 个。
Target 全塑料一次性鲁尔滑动式 50 mL 注射器 Thermo Scientific S7510-50仅使用注射器筒体。
计时器Fisher1464917
醋酸铀Electron Microscopy Sciences22400
真空烘箱
Vectashield 封片介质Vector LaboratoriesH-1000用于 RPE 平铺标本的封片。 
二甲苯Fisher Scientific 22050283
Zeiss Axio Imager 2 光学显微镜该显微镜具备生成 20x 拼接图像的功能。若光学显微镜不具备此功能，则需拍摄整个视网膜的图像，且相邻图像之间应有轻微重叠。使用 Adobe Photoshop 将这些图像拼接在一起。有关图像拼接，请参考 Adobe Photoshop 程序的使用手册。 
Zeiss Stemi 2000 解剖显微镜Electron Microscopy Sciences65575-02

参考文献

  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  3. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progess in Retinal and Eye Research. 100846, (2020).
  4. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  5. Forest, D. L., Johnson, L. V., Clegg, D. O. Cellular models and therapies for age-related macular degeneration. Disease Models & Mechanisms. 8 (5), 421-427 (2015).
  6. Landowski, M., Bowes Rickman, C. Targeting lipid metabolism for the treatment of age-related macular degeneration: Insights from preclinical mouse models. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 38 (1), 3-32 (2022).
  7. Pennesi, M. E., Neuringer, M., Courtney, R. J. Animal models of age related macular degeneration. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 487-509 (2012).
  8. Malek, G., Busik, J., Grant, M. B., Choudhary, M. Models of retinal diseases and their applicability in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (4), 359-377 (2018).
  9. Cao, D., et al. Hyperreflective foci, optical coherence tomography progression indicators in age-related macular degeneration, include transdifferentiated retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (10), 34(2021).
  10. Ding, J. D., et al. Expression of human complement factor H prevents age-related macular degeneration-like retina damage and kidney abnormalities in aged Cfh knockout mice. The American Journal of Pathology. 185 (1), 29-42 (2015).
  11. Zanzottera, E. C., et al. The project MACULA retinal pigment epithelium grading system for histology and optical coherence tomography in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 56 (5), 3253-3268 (2015).
  12. Ding, J. D., et al. Anti-amyloid therapy protects against retinal pigmented epithelium damage and vision loss in a model of age-related macular degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (28), 279-287 (2011).
  13. Zhang, Q., et al. Comparison of histologic findings in age-related macular degeneration with RPE flatmount images. Molecular Vision. 25, 70-78 (2019).
  14. vonder Emde, L., et al. Histologic cell shape descriptors for the retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration: A comparison to unaffected eyes. Translational Vision Science & Technology. 11 (8), 19(2022).
  15. Gambril, J. A., et al. Quantifying retinal pigment epithelium dysmorphia and loss of histologic autofluorescence in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 60 (7), 2481-2493 (2019).
  16. Bird, A. C., Phillips, R. L., Hageman, G. S. Geographic atrophy: a histopathological assessment. JAMA Ophthalmology. 132 (3), 338-345 (2014).
  17. Zanzottera, E. C., et al. Visualizing retinal pigment epithelium phenotypes in the transition to geographic atrophy in age-related macular degeneration. Retina. 36, 12-25 (2016).
  18. Sura, A. A., et al. Measuring the contributions of basal laminar deposit and Bruch's membrane in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (13), 19(2020).
  19. Curcio, C. A. Soft drusen in age-related macular degeneration: biology and targeting via the oil spill strategies. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 59 (4), 160(2018).
  20. Johnson, M., et al. Comparison of morphology of human macular and peripheral Bruch's membrane in older eyes. Current Eye Research. 32 (9), 791-799 (2007).
  21. Sarks, S. H., Arnold, J. J., Killingsworth, M. C., Sarks, J. P. Early drusen formation in the normal and aging eye and their relation to age related maculopathy: a clinicopathological study. The British Journal of Ophthalmology. 83 (3), 358-368 (1999).
  22. Chen, L., Messinger, J. D., Kar, D., Duncan, J. L., Curcio, C. A. Biometrics, impact, and significance of basal linear deposit and subretinal drusenoid deposit in age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 62 (1), 33(2021).
  23. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  24. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
  25. Cornell, W. C., et al. Paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis. Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).
  26. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  27. Baena, V., Schalek, R. L., Lichtman, J. W., Terasaki, M. Serial-section electron microscopy using automated tape-collecting ultramicrotome (ATUM). Methods in Cell Biology. 152, 41-67 (2019).
  28. Yamaguchi, M., Chibana, H. A method for obtaining serial ultrathin sections of microorganisms in transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (131), e56235(2018).
  29. Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  30. Landowski, M., et al. Modulation of Tmem135 leads to retinal pigmented epithelium pathologies in mice. Investigative Ophthalmology & Visual Sciences. 61 (12), 16(2020).
  31. Mori, H., et al. Developmental and age-related changes to the elastic lamina of Bruch's membrane in mice. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (2), 289-301 (2019).
  32. Chen, M., et al. Retinal pigment epithelial cell multinucleation in the aging eye - a mechanism to repair damage and maintain homoeostasis. Aging Cell. 15 (3), 436-445 (2016).
  33. Ortín-Martínez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392(2014).
  34. El-Danaf, R. N., Huberman, A. D. Sub-topographic maps for regionally enhanced analysis of visual space in the mouse retina. The Journal of Comparative Neurology. 527 (1), 259-269 (2019).
  35. Ortolan, D., et al. Single-cell-resolution map of human retinal pigment epithelium helps discover subpopulations with differential disease sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (19), 2117553119(2022).
  36. Brown, E. E., Lewin, A. S., Ash, J. D. Mitochondria: Potential targets for protection in age-related macular degeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 11-17 (2018).
  37. Puk, O., De Angelis, M. H., Graw, J. Longitudinal fundus and retinal studies with SD-OCT: a comparison of five mouse inbred strains. Mammalian Genome. 24 (5-6), 198-205 (2013).
  38. Knott, E. J., Sheets, K. G., Zhou, Y., Gordon, W. C., Bazan, N. G. Spatial correlation of mouse photoreceptor-RPE thickness between SD-OCT and histology. Experimental Eye Research. 92 (2), 155-160 (2011).
  39. Allen, R. S., Bales, K., Feola, A., Pardue, M. T. In vivo structural assessments of ocular disease in rodent models using optical coherence tomography. Journal of Visualized Experiments. (161), e61588(2020).
  40. Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium. Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

视网膜色素上皮病变光学显微镜透射电子显微镜共聚焦显微镜心脏灌注视网膜色素上皮定量分析分子通路
评估和量化年龄相关性黄斑变性小鼠模型中视网膜色素上皮病变的实验方案
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。