Method Article

优化 果蝇 幼虫神经肌肉接头透射电子显微镜样品制备工艺

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

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本报告提供了一种新的样品制备程序，用于可视化 果蝇 幼虫中的神经肌肉接头。与传统方法相比，该方法在防止样品卷曲方面更有效，对于 果蝇 神经肌肉接头超微结构分析特别有用。

Abstract

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果蝇神经肌肉接头 （NMJ） 已成为神经科学领域有价值的模型系统。在果蝇 NMJ 中应用共聚焦显微镜使研究人员能够获取突触信息，包括突触丰度的定量数据和对其形态的详细见解。然而，透射电镜的漫射分布和有限的视觉范围给超微结构分析带来了挑战。本研究引入了一种创新且高效的样品制备方法，该方法超越了传统方法。该过程首先将金属网放在平底瓶或试管的底部，然后将固定的幼虫样品定位到网状物上。在样品上放置一个额外的网格，确保它们位于两个网格之间。在进行包埋程序之前，将固定样品彻底脱水并渗透。然后以平片方式将样品嵌入环氧树脂中，这允许准备用于定位和切片的肌肉。受益于这些步骤，果蝇幼虫的所有肌肉都可以在光学显微镜下看到，从而促进后续的定位和切片。在定位身体节段 A2 和 A3 的第 6 和第 7块肌肉后，去除多余的树脂。进行第 6或第 7块肌肉的连续超薄切片。

Introduction

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电子显微镜是研究生物材料超微结构最理想的方法之一，可以在纳米级1级直观准确地展示细胞的内部结构。然而，由于样品制备过程的复杂性和高昂的成本，电子显微镜不如光学显微镜那么受欢迎。电子显微镜技术的最新进展导致了图像质量的显着提高，同时显着减少了相关的工作量。因此，电子显微镜在推进不同领域的科学知识方面发挥着重要作用2.

果蝇是一种优秀的动物模型，用于执行遗传操作以精确控制靶基因的空间和时间表达3。此外，与哺乳动物模型相比，果蝇具有生长期短、易于饲养的优点;因此，果蝇在形态学研究中被广泛使用4,5。

在果蝇幼虫中，神经肌肉接头 （NMJ） 胸膜广泛分布在肌肉中 6,7，NMJ 的免疫染色可以很容易地提供有关突触数量和形态的信息 8,9 。位于 A2

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Protocol

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注:本文中使用的透射电子显微镜样品制备方法之前已报道过16.需要注意的是，试剂的选择和剂量的调整是必要的，具体取决于样品。在样品制备过程中使用有毒化学试剂很多，因此，操作人员需要采取一定的防护措施，如穿防护服和手套，在通风橱中操作。

1. 解剖、固定和放置程序

  1. 解剖
    1. 在Jan溶液中解剖游荡的3龄后期幼虫，并根据标准程序17获得整个体壁。按如下方式制备Jan溶液:128mM NaCl，2mM KCl，4mM MgCl 2,35mM蔗糖，5mM HEPES，pH 7.4
      注: 果蝇 幼虫的体壁是指 果蝇果蝇幼虫阶段的外层覆盖物或外皮。这包括形成幼虫外骨骼的角质层、表皮细胞和下层组织。体壁提供结构支撑和保护，并作为幼虫体与外部环境之间的屏障17.
  2. 固定
    1. 用固定剂将幼虫体壁在4°C下固定在解剖室中过夜。为了制备固定剂，将 2% 戊二醛和 2% 甲醛混合在 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液 （pH 7.4） 中
    2. 用二甲胂酸钠缓冲液冲洗样品数次。
    3. 在二甲胂酸盐缓冲液中制备1%OsO4 。将样品在1%....

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Results

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果蝇幼虫体壁由30根可识别的肌肉纤维组成，这些肌肉纤维以规则的模式排列，在解剖和固定后看起来像一片薄片21（图1A）。由于金属网的存在，样品在脱水过程中保持平坦（图1B，C）。将幼虫体肌肉埋在由环氧树脂制成的薄板中（图1D-G），该薄板易于准确地定位并粘合到填充树脂的胶囊上（图1H，I）。

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Discussion

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果蝇 幼虫样品在脱水过程中容易卷曲，因为样品很薄，难以准确定位神经肌肉接头，从而增加了样品制备的难度和工作量。传统的改进是缩短了样品7个，但样品仍进行了不同程度的卷曲。

在我们的方法中，有两个关键步骤:首先，由于金属网的限制，样品在整个脱水过程中保持平坦。此外，在聚合过程中，可以通过将样品夹在塑料制品之间来聚合样品，以防止样品因温度变化而折叠，从而便于在光学显微镜下观察样品和定位目标肌肉。然而，该方法的缺点是由于树脂和塑料之间的粘附性，样品不容易检索。

通过我们的方法得到的扁平树脂片比传统的嵌入块更易于修剪和定位。尽可能地修剪样品周围的树脂也可以显着降低工作的难度和工作量。一般来说，为了让样品完全保留在树脂中，通常会在样品周围留下少量的树脂。

这种方法已经在我们之前对 果蝇 幼虫24 中神经肌肉接头的一些超微结构研究中进行了实践。这种方法大大.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作得到了中国自然科学基金32070811和东南大学（中国）分析测试基金11240090971的支持。我们感谢中国南京东南大学医学院电子显微镜实验室和形态分析中心。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-环氧丙烷上海凌丰化学试剂有限公司JYJ 037-2015渗透剂
果蝇 种群布卢明顿无本研究使用的野生型对照果蝇菌株均为 W1118，并按标准培养方法饲养
平底玻璃试管海门晨兴实验设备公司 无平底玻璃试管（瓶）带海绵塞（或瓶塞）
K4M 交联剂 琼脂科学Cat# 1924B包埋树脂基于高度交联的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯配方 
K4M 树脂（单体 B） 琼脂科学批次# 631557树脂单体
聚乙烯薄膜海门晨星实验设备公司 无透明聚乙烯薄膜最好，厚度约0.2mm
SPI Chem DDSASPISpI#02827-AF十二烯基琥珀酸酐
SPI-Chem DMP-30 环氧树脂 SPI02823-DA促进
剂 SPI-Chem NMASPISpI#02828-AF环氧
SPI-PON 812 环氧树脂SPI SPI0259-AB树脂单体
钢网 玉惠园艺店（在线）无铜或不锈钢网
透射电子显微镜Hitachi H-765011416692所有网格（收集样品的网格）均用柠檬酸铅染色，并在透射电子显微镜下观察。
超薄切片机Leica UC7 超薄切片机595915所有切片作均使用金刚石刀在 Leica UC7 超薄切片机上进行
树脂固化剂 #

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

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Drosophila Neuromuscular JunctionTransmission Electron MicroscopySample PreparationUltra Thin SectioningEpoxy Resin EmbeddingConfocal MicroscopyMuscle PositioningMetal Mesh TechniqueLarval Body WallSynaptic Structure

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