本报告提供了一种用于可视化神经肌肉接头的新样本制备方法 果蝇 幼虫。与传统方法相比，该方法在防止样品卷曲方面更为有效，尤其适用于 果蝇 神经肌肉接头超微结构分析
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摘要
摘要
Drosophila 神经肌肉接头（NMJ）已成为神经科学领域一个重要的模型系统。在 Drosophila NMJ 上应用共聚焦显微镜技术，使研究人员能够获取突触信息，包括突触数量的定量数据以及其形态的详细信息。然而，透射电子显微镜（TEM）视野范围有限且样本中结构分布弥散，为超微结构分析带来了挑战。本研究介绍了一种创新且高效的样本制备方法，优于传统技术。该方法首先在平底瓶或试管底部放置金属网，随后将固定后的幼虫样本置于网上，并在样本上方再覆盖一层金属网，确保样本夹于两层网之间。固定后的样本经过充分脱水和渗透处理后，再进行包埋。随后以平面薄片方式将样本包埋于环氧树脂中，便于肌肉的定位与切片。得益于这些步骤，Drosophila 幼虫的全部肌肉均可在光学显微镜下观察，从而有利于后续的定位与切片操作。在定位到体节 A2 和 A3 的第 6th 和第 7th 肌肉后，去除多余的树脂，随后对第 6th 或第 7th 肌肉进行连续超薄切片。
引言
电子显微镜是研究生物材料超微结构的理想方法之一，能够以纳米级分辨率直观而准确地展示细胞内部结构1。然而，由于样品制备过程复杂且成本较高，电子显微镜的应用普及程度不及光学显微镜。近年来，电子显微镜技术的进步显著提升了图像质量，同时大幅降低了相关工作量。因此，电子显微镜在多个学科领域推动科学知识发展的过程中已发挥出重要作用2。
Drosophila 是进行基因操作以精确控制目标基因时空表达的优良动物模型3。此外，与哺乳动物模型相比，Drosophila 具有生长周期短、易于培养的优点；因此，Drosophila 被广泛应用于形态学研究4,5。
在 果蝇 幼虫中，神经肌肉接头（NMJ）突触小体广泛分布于肌肉内6,7，且神经肌肉接头的免疫染色可轻松提供有关突触数量和形态的信息8,9 位于6的NMJ突触小结th/7th A的肌肉2 和 A3 由于其尺寸和数量优势，这些节段非常适合用于光学显微镜下的定量与形态学研究。10,11因此， 果蝇 幼虫神经肌肉接头被认为是神经科学研究中的有用模型12.
然而，通过透射电子显微镜观察神经肌肉接头（NMJ）突触小结的超微结构具有挑战性。由于透射电子显微镜的扫描视野较窄，难以定位广泛分布的NMJ突触小结13。另一个原因是，在样品制备流程的酒精脱水步骤中，果蝇（Drosophila）体壁容易发生卷曲7。
传统研究通常选择直径在6之间的突触小结th 和 7th A的肌肉2 和 A3 由于其丰富性和尺寸，可将片段作为样本材料14,15. 第6th 和 7th A的肌肉2 和 A3 片段比其他肌肉更大，且包含更多的突触小结。然而，当样品制备用于透射电子显微镜时，固定后的样品往往变薄并容易卷曲，从而导致6号位点定位不当th 和 7th A的肌肉2 和 A3 片段。
本文报道了一种新的处理流程，与传统的样品制备方法7,16相比，该方法能更有效地防止样品卷曲，使样品在后续脱水过程中保持平整，从而更有利于果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头的准确定位。
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方案
注意：本文所使用的透射电子显微镜样品制备方法已有先前报道16。需要注意的是，应根据样品情况选择适当的试剂并调整用量。样品制备过程中涉及多种有毒化学试剂，因此操作人员需采取必要的防护措施，例如穿戴防护服和手套，并在通风橱内进行操作。
1. 解剖、固定及放置操作步骤
- 解剖
- 在 Jan 溶液中解剖游走期晚期三龄幼虫，并根据标准操作获取完整的体壁17。Jan 溶液的配制方法如下：128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl2、35 mM 蔗糖、5 mM HEPES，pH 7.4
注意：Drosophila 幼虫的体壁是指果蝇 Drosophila 幼虫阶段的外层覆盖物或表皮结构，包括角质层、表皮细胞及构成幼虫外骨骼的下层组织。体壁提供结构支撑和保护作用，并作为幼虫体内与外界环境之间的屏障17。
- 在 Jan 溶液中解剖游走期晚期三龄幼虫，并根据标准操作获取完整的体壁17。Jan 溶液的配制方法如下：128 mM NaCl、2 mM KCl、4 mM MgCl2、35 mM 蔗糖、5 mM HEPES，pH 7.4
- 固定
- 将幼虫体壁置于解剖皿中，用固定液在 4 °C 下过夜固定。固定液的配制方法：将 2% 戊二醛和 2% 多聚甲醛溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中
- 用二甲胂酸钠缓冲液多次冲洗样品。
- 用二甲胂酸钠缓冲液配制 1% OsO4 溶液。将样品在 1% OsO4 中固定 2 小时，随后用蒸馏水多次冲洗。
注意：醛类与 OsO4 的双重固定可更好地保护细胞超微结构。此外，OsO4 可对样品组织进行染色，使样品与背景之间的对比度更加明显18。 - 用 2% 饱和醋酸铀对 Drosophila 神经肌肉接头样品染色 2 小时，随后用去离子水多次冲洗（图 1A）。
- 样品放置
- 用剪刀剪下两片大小相近的金属网片（孔径 270 µm）。
- 预先将一片金属网（270 µm）放置于平底瓶底部。
- 将固定的幼虫样品置于网片上，再覆盖另一片网片，使样品夹在两片网片之间。
2. 脱水
注意：本文采用乙醇梯度脱水法。
- 将样品依次置于浓度递增的乙醇中进行脱水处理（50%、70%、85%、95% 各一次，100% 两次），每次 20 分钟，温度为 4 °C。
- 用丙烯氧化物在室温下漂洗样品两次，每次 5 分钟（图 1C）。
3. 渗入
注意：浸透是透射电镜样品制备的必要步骤之一。浸透可使脱水介质在样品中逐步被包埋介质取代，从而使包埋介质填充细胞间隙19。
- 将样品依次置于丙烯氧化物与环氧树脂按1:1和1:2比例配制的混合溶液中，各1小时，然后在室温下置于纯环氧树脂中2小时。
4. 包埋
- 准备一片聚乙烯薄膜，将其裁剪成一个大正方形（约 5 × 5 cm）和一个小的中空矩形支撑片（约 2 × 2 cm）。将小正方形粘附在大正方形上。
- 在大正方形的中心预先放置足量的环氧树脂。
- 将样品放置于预置的环氧树脂上，肌肉面朝上。使用体视显微镜操作。
- 向样品上滴加数滴树脂，然后用聚乙烯薄膜覆盖（薄膜略大于间隔片）（图 1D-E）。
- 分别在 37 °C、42 °C 和 60 °C 下对样品进行聚合，每种温度处理 24 小时（图 1F）。
5. 切片步骤
- 用锋利的刀片切除幼虫体壁的多余部分，保留包含A在内的梯形区域2/A3 片段
注意：上线应靠近13th 肌肉，且基线应远离样品，朝向环氧树脂。顶线与基线之间的高度约为5-8 mm。 - 将梯形部分从样本其余部分上取下，并使用A/B胶将其粘附到装有树脂的胶囊上。
- 确认第6个位置th 和 7th A的肌肉2 和 A3 在光学显微镜下的片段图1G）并保持切平面与6平行th 肌肉
- 沿A的两侧切去样品的五分之一3 片段
注意：去除大部分的 6th 肌肉，并保留第七块宽度的1/3th 肌肉 - 使用超薄切片机，从第6个样本开始制备超薄切片th 肌肉
注意：每个切片的厚度约为 90 nm。 - 将尽可能多的切片附着到每个铜网上。
- 按照先前所述方法进行透射电子显微镜观察16.
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结果
的 果蝇 幼虫体壁由30条可辨识的肌纤维以规则模式排列组成，解剖并固定后外观呈薄片状21(图1A）。由于金属网的存在，样品在脱水过程中保持平坦。图1B，C）。幼虫体壁肌肉被包埋在由环氧树脂制成的薄片中（图1D-G），可轻松准确地定位并粘接到充满树脂的胶囊上（图1H，我).
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讨论
Drosophila 幼虫样本在脱水过程中容易卷曲，由于样本较薄，难以准确定位神经肌肉接头，从而增加了样本制备的难度和工作量。传统的改进方法是缩短样本7，但样本仍会不同程度地卷曲。
在本方法中，有两个关键步骤：首先，由于金属网的限制，样品在整个脱水过程中保持平整。此外，在聚合过程中，可通过将样品夹在塑料制品之间进行聚合，以防止样品因温度变化而发生折叠，从而有利于在光学显微镜下对样品的观察以及目标肌肉的定位。然而，该方法的不足之处在于，由于树脂与塑料之间的黏附作用，样品不易取出。
通过本方法获得的扁平树脂切片在修块和定位方面优于传统的包埋块。尽可能多地修去样品周围的树脂，也可显著降低操作的难度和工作量。通常，为确保样品完全保留在树脂中，会在样品周围保留少量树脂。
该方法已在我们先前对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头的超微结构研究中应用24<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金项目32070811和东南大学（中国）分析测试基金11240090971的资助。我们感谢中国南京东南大学医学院电子显微镜实验室和形态学分析中心。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-环氧丙烷 | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | 渗透剂 |
| 果蝇品系 | Bloomington | 无 | 本研究中使用的野生型对照果蝇品系均为W1118，均按照标准培养方法进行饲养 |
| 平底玻璃试管 | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | 无 | 带海绵塞（或瓶塞）的平底玻璃试管（瓶） |
| K4M交联剂 | Agar Scientific | Cat# 1924B | 包埋树脂基于高度交联的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯配方 |
| K4M树脂（单体B） | Agar Scientific | Lot# 631557 | 树脂单体 |
| 聚乙烯薄膜 | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | 无 | 透明聚乙烯薄膜最佳，厚度约为0.2 mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | 十二烯基琥珀酸酐 |
| SPI-Chem DMP-30 环氧树脂 | SPI | 02823-DA | 环氧树脂促进剂 |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | 环氧树脂固化剂 |
| SPI-PON 812 环氧树脂 | SPI | SPI#0259-AB | 树脂单体 |
| 金属网 | Yuhuiyuan Gardening Store（线上） | 无 | 铜网或不锈钢网 |
| 透射电子显微镜 | Hitachi H-7650 | 11416692 | 所有载样铜网均经柠檬酸铅染色后，在透射电子显微镜下观察 |
| 超薄切片机 | Leica UC7 超薄切片机 | 595915 | 所有切片操作均使用Leica UC7超薄切片机配合金刚石刀完成 |
参考文献
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勘误
Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan
