清醒小型猪的超声心动图记录

摘要

本文介绍了一种用于在站立清醒的小型猪中进行研究性超声心动图检查的简易推车装置，同时描述了其构建要点、训练技术以及典型的超声图像。

摘要

超声心动图利用超声波无创评估心脏结构和功能，是心脏评估与监测的临床标准方法。小型猪（minipig）在医学研究中正日益被用作心脏疾病模型。猪类 notoriously 难以安全地固定和操作，因此对该物种进行的研究性超声心动图检查几乎总是在麻醉或深度镇静下进行。麻醉剂和镇静剂普遍影响心血管功能，可能导致心输出量和血压下降、心率及全身血管阻力升高或降低、电生理节律改变以及冠状动脉血流异常。因此，镇静或麻醉状态下的超声心动图可能无法准确反映大型动物模型中心脏疾病的进展，从而限制了这些重要研究的转化价值。本文介绍一种新型装置，可实现小型猪在清醒站立状态下接受超声心动图检查。此外，还描述了训练猪只耐受这一无痛、无创操作的技术，无需使用影响血流动力学的麻醉药物。清醒站立状态下的超声心动图检查为在小型猪心血管研究中实施最常见的心脏监测手段提供了一种安全且可行的方法。

引言

心力衰竭给美国及全球的医疗机构带来了日益沉重的负担，全球患者人数已达3800万¹。2020年，全球约有1900万人死于心血管疾病，较2010年上升了18.7%²。然而，新疗法的研发速度远远跟不上这一严峻趋势。因此，心力衰竭是当前亟需深入研究的关键领域，而用于准确捕捉疾病发生与进展的高保真工具的重要性再怎么强调也不为过。

目前，超声心动图是无创评估心脏疾病进展最重要的临床工具，但在大型动物研究模型中，其应用可能具有挑战性³。超声心动图利用超声波评估心脏结构和功能，是临床环境中进行心脏评估和监测的标准方法⁴。在心脏疾病的临床前大型动物模型（如猪）中，基础科学研究向心血管治疗手段转化的过程中发挥着关键作用⁵。因此，在开发这些治疗方法的过程中，将超声心动图技术应用于大型动物模型，成为这一关键努力的重要组成部分。

猪是常用于模拟缺血性、压力超负荷和快速起搏性心力衰竭的多种大型动物模型之一^5,6。猪在临床前研究中尤为重要，因其神经激素代偿机制和心脏重构过程与人类病理生理学高度相似^6,7。近年来，小型猪（又称迷你猪）作为具有多种合并症 的心脏疾病模型展现出良好前景，其肥胖、高血压、高胆固醇血症和糖尿病可稳定导致心脏功能障碍和结构重构^8,9。

对大多数大型动物安全地进行超声心动图检查需要深度镇静或全身麻醉。然而，所有麻醉药和镇静药均会以剂量依赖的方式抑制心脏功能^10,11。麻醉药和镇静药可能导致心输出量和血压下降，心率及全身血管阻力升高或降低，电生理节律改变，以及冠状动脉血流异常¹²。在大多数情况下，麻醉药会降低交感神经张力，减少静脉回流，从而导致血压下降¹³。重要的是，麻醉药还会影响超声心动图参数，使在动物模型中利用该检查监测心脏疾病时的解读变得复杂¹⁴。清醒状态下的超声心动图最能真实反映心脏的固有功能。

本文描述了一种猪用固定装置，清醒的迷你猪 readily 接受该装置，可用于基本的心脏超声监测，而无需使用会影响血流动力学的麻醉剂。

方案

超声心动图推车的构建和使用均符合犹他大学机构动物照护与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）规定的动物操作与培训标准。

1. 超声心动图推车构建的注意事项

1. 构建一种装置，以便能够获取猪的侧位和腹侧站立状态下的超声心动图成像窗。
2. 使用四周（包括两侧、前方和后方）具有高边栏的推车，以防止猪在进行超声心动图检查时攀爬或跳出。
3. 采用长度和宽度可调节的推车，以适应不同体型和年龄的猪；但在所有实验猪的体型、品种和年龄均相同的研究中，此调节功能可能并非必需。
4. 配备一个防滑坡道，用于猪上下推车。猪倾向于向前行走，因此应避免使其向后退下。在本示例中，使用了可拆卸坡道：猪登上推车后，可将坡道一端拆下，随后将其移至推车另一端，用于下坡。
5. 使用带锁定轮子的带轮推车，以便将该装置从存放处移动至动物房。
6. 为符合动物饲养室的清洁和消毒标准，应采用塑料、金属和橡胶材料。
7. 最后，在推车前方加装一个可拆卸的饲喂槽，以便在超声心动图检查期间为猪提供注意力分散物。

2. 手推车构建规格

注意：本研究中使用的猪为5至10月龄的尤卡坦猪和哥廷根小型猪，因此我们的推车是根据这一体型设计的。

1. 尽管可以完全从零开始构建类似结构，但为了减少部分搭建工作，建议从预制的重型手推车开始（图1）。推荐使用带锁定功能的轮子。
2. 锯掉并移除手推车的前部和后部，改用PVC管和链式网片制作成可开合的门。使用链式网片材料通过挂钩或卡扣悬挂饲料槽（图2）。由于移除了前后结构，塑料部件的整体性和承重能力会下降，因此对于体型较大、较重的猪，应在手推车层板底部加装金属条进行加固。
3. 在手推车顶部平台开设一个足够大的开口，以便容纳一只手握持超声探头通过。保留一个与开口顶部匹配的塑料盖板，当猪安全站立于手推车内后，可取下该盖板以进行剑突下超声心动图检查（图3）。
4. 根据定制需求，使用 铝材（例如方管、棒材和金属板） 制作带有加强结构的金属装卸坡道，并将其固定在改装后手推车的特定连接点上。使用螺栓和衬套加装可拆卸的橡胶垫以增加摩擦力（图4）。
5. 为侧门设计铰链机构，利用简单的销钉收窄猪的站立区域，以实现更好的固定效果（图5）。该设计可使猪在手推车内紧密贴合，确保其朝向前方站立，无法转身。

3. 训练小型猪站在推车内

1. 必须训练猪长时间从食槽中进食、走上斜坡以及走下斜坡。
2. 在食槽中放置冷冻零食可延长猪站立的时间。可使用果汁、代乳饮料或酸奶与谷物、标准饲料、饼干和/或果味条的组合。将这些成分混合后冷冻，制成持久耐吃的冷冻零食食槽（图6）。另一种可选方法是在超声心动图检查期间，不提供动物的常规餐食，而将其放入推车中的食槽内进行喂食。
3. 在训练猪于装置中食用冷冻零食之前，应先将冷冻零食食槽放置于地面，引导猪识别食槽可提供高价值零食。
4. 训练猪适应站立状态下的超声心动图检查，持续5–7天，每天进行一次训练。按以下步骤操作：
   1. 通过在推车周围放置高价值零食（如饼干或谷物）1–2天，使猪熟悉推车环境。
   2. 在斜坡上放置高价值零食，并在猪走上斜坡时给予额外奖励，持续1–2天，使其适应斜坡。
   3. 允许猪站在推车上，但暂不启用侧边约束装置或门栏（以免引起恐惧），并在前门处提供冷冻零食食槽，持续2–3天。在最后1–2天期间，当猪从食槽进食时，将涂有超声耦合剂的超声探头接触猪体表，使其适应探头接触的感觉。
   4. 完成该训练方案后，猪将能够轻松接受约束装置和门栏的闭合，并配合完成超声检查，以获取超声心动图图像。

4. 图像采集

1. 在超声心动图推车上获取图像，该推车允许探头按以下位置进行定位，具体如下所述。
   1. 通过推车两侧分别对准右腋区和左腋区获取图像。这些位置用于获得右侧和左侧胸骨旁成像切面。
   2. 通过推车底部对准剑下区域获取心尖视图。
2. 从上述固定位置获取B模式和M模式成像的图像。
3. 有关模拟清醒状态下超声心动图记录操作，请参见视频1。视频中使用一个与真实小型猪尺寸相同的模型猪来代表实验动物，模型猪被固定在推车内，活动空间受限，模拟真实情况。视频还展示了最佳的成像声窗以及超声探头的正确放置位置。

结果

本文展示了在约8月龄的尤卡坦小型猪中获得的代表性图像。该动物从未使用镇静剂，在图像采集过程中正享受饲料或冷冻零食槽中的食物。

超声心动图推车主要用于获取简单图像，以通过B型或M型图像和视频计算左心室腔容积和射血分数（EF）。对于更敏感的成像技术，如血管成像或组织多普勒成像，该方法可能难以实现，因为清醒状态下的猪活动受限，且成像时间窗口受限于进食持续时间。

实验室使用一台床旁超声设备，该设备不具备事后图像分析功能。因此，视频和静态图像需要使用编辑软件进行处理，并利用科学图像分析软件进行测量。

短轴横向视图M型超声图像（图7) 通过推车侧面获取，用于分析收缩期和舒张期左心室内径（分别为 LVIDs 和 LVIDd），并据此计算射血分数（EF），其中 EF = (EDV - ESV)/EDV × 100%（EDV：舒张末期容积；ESV：收缩末期容积），容积依据 Teichholz 公式计算（容积 = 7D³/[2.4 + D])（D：左心室线性直径）¹⁵. 四次M型超声扫描的代表性数据来自两只小型猪，包含在 表1以及来自同一动物在镇静状态超声心动图检查期间记录的M型扫描所生成的数据。正如预期，镇静状态超声心动图检查所生成的射血分数往往低于清醒状态超声心动图检查的射血分数。

还从滑车两侧获取了胸骨旁长轴切面的B型超声图像（图8）。采用面积-长度法，利用这些B型图像计算射血分数（EF）¹⁶。首先，根据舒张末期左心室长轴长度和心腔面积，使用公式 EDV = (0.85 × area²)/length 计算左心室舒张末期容积（EDV）。左心室收缩末期容积（ESV）则采用相同方法，代入收缩期测量值进行计算。随后通过公式 EF = (EDV - ESV)/EDV × 100% 计算射血分数。来自两只小型猪的八次B型超声扫描所获得的代表性数据列于表2中。作为对照，还包含了同一批动物在镇静状态下进行超声检查时记录的B型扫描数据。根据B型图像分析，镇静状态与清醒状态下的超声检查所获得的射血分数结果高度一致（表2）。

图1：超声心动图推车的侧视图。 超声心动图推车采用预制的重型多功能推车制成。请点击此处查看此图的放大版本。

图2：超声心动图推车的正面视图。 预制推车的前部和后部被替换为由PVC管和链节网制成的铰接门（A），该结构还可容纳一个悬挂式食槽（B）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：超声心动图推车的俯视图。在推车顶部设置一个开口，以便操作者将手持超声探头的手伸入。另配有塑料覆盖件，以确保推车安装和拆卸时的安全。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：铝制坡道。将一个铝制坡道连接至手推车的前部或后部，并使用螺栓和衬套加装可拆卸的橡胶垫以增加摩擦力。请点击此处查看此图的放大版本。

图5：侧门。 为侧门设计了铰链，并配有销钉，以实现更精确的尺寸调节和固定。请点击此处查看此图的放大版本。

图6：用于清醒回声实验的零食。 将果汁、代餐饮料或酸奶与谷物、标准饲料、饼干和/或果味棒组合后冷冻，制成持久耐吃的冷冻零食槽。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：从清醒动物获得的代表性M型超声扫描图像。 基于M型成像计算左心室射血分数的示例图像分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：从清醒动物获得的代表性B型超声扫描图像。 基于B型超声成像计算左心室射血分数的示例图像分析。请点击此处查看该图的放大版本。

均值 ± 标准差	舒张末期左室内径 (cm)	收缩末期左室内径 (cm)	射血分数 (%)
清醒状态超声心动图 (N=4/2)	3.8 ± 0.5	2.5 ± 0.5	64.3 ± 5.4
镇静状态超声心动图 (N=4/2)	3.9 ± 0.2	3.0 ± 0.0	48.5 ± 7.9
EF，射血分数；SD，标准差。
N = 来自两只动物的 4 次超声心动图扫描

表1：在麻醉小型猪与在推车上约束的清醒小型猪中记录的M型图像所生成参数的比较。

	LV-MALd (cm)	LV-MALs (cm)	LV-CAd (cm2)	LV-CAs (cm2)	EF (%)
清醒状态超声心动图 (N=8/2)	5.8 ± 0.8	4.5 ± 0.6	18.6 ± 5.0	10.7 ± 2.8	57.3 ± 5.2
镇静状态超声心动图 (N=8/2)	5.9 ± 0.5	4.8 ± 0.4	21.8 ± 2.7	13.1 ± 2.4	55.3 ± 9.0
LV-MAL，左心室长轴长度；LV-CA，左心室腔面积；
EF，射血分数；SD，标准差。N=8 次超声心动图扫描来自 2 只动物

表2：在麻醉小型猪与在推车上约束的清醒小型猪中记录的B型超声图像所生成参数的比较。

视频1：使用超声心动图推车在真实大小的迷你猪模型上模拟清醒状态下的超声心动图记录操作。 请点击此处下载该视频。

讨论

超声心动图推车代表了一种易于复制的方法，可用于监测重要心脏研究模型——小型猪的心脏结构和功能。该推车的创新之处在于能够获取超声心动图图像，同时避免了其最大的缺陷：即必须使用麻醉剂或镇静剂，而这些药物会改变动物的心脏功能，进而影响用于评估心脏治疗效果的测量结果。此外，该推车安全、成本低廉，且便于对猪进行训练使用。

作者首先确定了推车所需的功能特性，然后与木工密切合作设计该产品。采用标准的正向强化训练技术，可快速、简便地教会猪无惧地接受推车并使用它。通过超声检查训练，作者能够迅速找到并记录标准的二维超声心动图成像切面，以供后续处理。在这些站立位超声心动图检查过程中，从未给予镇静剂或麻醉剂，因此所获得的视频和图像能够真实反映清醒状态下的心脏功能。

对于有经验的木匠或维修人员而言，在确定了研究团队关注的关键特性（例如尺寸可调性、高度或超声探头接入位置）后，搭建超声心动图推车的过程相对简单。在建造过程中，可根据各个实验室的具体需求对推车的特性进行调整。所需材料成本普遍较低，自制推车可能有助于降低实施超声心动图检查时对常用镇静剂和麻醉剂的依赖及相关费用。

该技术的局限性包括动物的活动以及获取图像的时间窗口有限。尽管运输车可根据需要调整尺寸以限制猪的活动，且动物无法转身，每个方向仅能移动几英寸，但它们仍能在运输车的范围内产生一定程度的运动。使用头夹、挤压通道或颈夹栏（类似于农场动物所用的装置），并辅以额外的训练，可能能够提供更有效的固定。同样，成功成像依赖于动物在进行超声心动图检查时被饲料或冷冻零食分散注意力。通常情况下，这仅能维持约15分钟的成像时间，而该时长并不总是足以获取所有期望的图像。若能在动物被固定期间方便地更换食槽或添加饲料，或许可延长成像持续时间。最后，由于上述两项限制，在站立式超声心动图运输车上实施更为敏感的成像技术（如组织多普勒成像）变得十分困难。

其他猪的实验模型通常采用非麻醉处理技术，例如市售的Panepinto吊带¹⁷。然而，作者发现该吊带技术在训练猪只时更为繁琐，且无法为超声心动图检查提供所需的成像切面。超声心动图推车的其他潜在应用还可包括其他无痛操作，如腹部超声检查、皮肤病变观察，或通过血管通路装置采集血样。例如，作者常利用该推车方便地固定猪只，以进行心电图检查和起搏器编程。

综上所述，所述的清醒状态下超声心动图技术操作简便，对于获取心脏基本超声图像具有重要价值，且避免了麻醉或镇静使用时典型的心血管抑制作用。该技术可用于在大型动物中比较麻醉状态与清醒状态下的图像，也可用于珍贵的猪类心力衰竭与心脏病临床前转化模型中，对心脏疾病进展进行日常监测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
通道坡道	N/A - 商店定制	58" 长 × 18" 宽。升高19"，倾斜角度不得超过22.5度。	任何可拆卸的铝制坡道，能够承受猪只的重量
带夹具的围栏饲喂器	DuraFlex	E011772	带夹具的饲料槽，可悬挂在链式围栏上，用于放置冷冻零食或饲料，以在超声心动图检查期间分散猪只注意力
重型手推车	Baxter Medical Equipment & Supplies	手推车编号未知 / 45×25×33"；管道，sch 40 PVC	由高强度塑料制成，带有三层搁板
图像分析软件	Image J FIJI	https://imagej.net/software/fiji/	免费的科学图像分析软件
配备S4-1相控阵换能器的Lumify超声设备	Philips	FUS6884	手持式床旁超声设备，配备心脏探头，需与平板设备及专用软件配合使用
视频编辑软件	Adobe Premiere Pro 2022	https://www.adobe.com/products/premiere.html	Adobe Creative Cloud 中常用的软件。