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通过转录组学研究温和噬菌体对其溶原宿主的影响

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DOI：

10.3791/64945

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2024年1月5日

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1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, Institute of Infection, Veterinary and Ecological Sciences (IVES), University of Liverpool, 2School of Science, Engineering, and Environment, University of Salford

本文内容

摘要

本方案能够揭示前噬菌体对其宿主的影响。通过采用最有利于溶原状态的条件同步细菌培养物，以限制其自发诱导。逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）可明确区分仅在前噬菌体状态下表达的基因、不受噬菌体调控的基因以及在裂解复制周期中表达的基因。

摘要

温和噬菌体在大多数细菌基因组中以原噬菌体形式整合存在。一些原噬菌体是隐性的，并稳定固定于细菌染色体中，而另一些则具有活性，可自发或在诱导因子作用下被激活进入复制状态。原噬菌体通常与赋予宿主细胞产毒能力或其他毒力相关性状的能力有关。近期研究显示，它们在改变宿主生理特性方面可能发挥更为广泛的作用。本文所述技术使我们能够探究原噬菌体如何影响机会性致病菌Pseudomonas aeruginosa的基因表达。

在本研究中，将野生型铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1菌株的生长情况与携带利物浦流行菌株（LES）LESB58不同组合原噬菌体的同基因溶原菌株进行了比较。在溶原菌培养物中，部分细菌细胞会进行裂解性噬菌体复制（自发诱导），每个细胞中晚期噬菌体基因（如与噬菌体颗粒组装相关的基因）高度表达， 从而掩盖了溶原菌限制性基因表达相关的低水平基因表达。 因此，自发诱导的影响可能掩盖整个溶原菌群体中原噬菌体基因的表达情况。 

通过生长表型实验鉴定自发诱导现象，发现在对数生长早期该现象极为微弱。本研究介绍了如何在对数生长早期制备样品培养物，并阐述了即使在细胞数量较低的情况下，如何设置适当的对照。这些实验方案可确保在不同条件下对野生型和溶原性细菌进行可靠且可重复的比较，从而提高前噬菌体基因组的转录组分析质量，并有助于发现此前未被识别的前噬菌体功能。

引言

近年来，噬菌体疗法在应对抗菌素耐药性1 方面的应用以及基于CRISPR-Cas的基因编辑技术2 重新激发了人们对噬菌体研究的兴趣。同时，生物技术的进步也使得对细菌与噬菌体之间相互作用的深入研究成为可能3。然而，噬菌体的治疗性应用（"噬菌体疗法"）仍受到一些担忧的限制，例如噬菌体可能作为可移动的遗传元件，具有横向转移毒力基因和耐药基因的能力4。大量存在的"暗物质"5 （即功能未知的基因）既令人困扰，又极具吸引力。这类“暗物质”被视为我们对噬菌体生物学认知中的一个空白 ，同时也是一种尚未被充分开发的分子工具及潜在新型治疗剂资源6。高通量测序技术的发展，结合更精确的基因注释7,8,9以及新的多肽折叠算法10，正在提升我们对噬菌体基因的检测、描述和功能预测能力。然而，科学界距离在培养体系或真实环境中验证大多数噬菌体基因的功能仍有很长的路要走。

RNA测序（RNA-Seq）可全面绘制噬菌体感染期间的基因表达图谱，显著加深了人们对裂解周期和溶原周期中涉及的噬菌体及细菌组分的理解11,12。在溶原过程中，温和噬菌体基因组整合到细菌DNA中，形成前噬菌体13。通过全基因表达谱分析实验，可鉴定出仅在溶原状态下表达、但编码于温和噬菌体基因组中的前噬菌体限制性基因11。这类基因不编码噬菌体结构蛋白，也不参与任何噬菌体感染过程。RNA-Seq可用于识别那些更可能影响细菌宿主生物学特性的基因，这些基因可能通过赋予宿主新的功能或调控已有的细菌基因，使细菌能够适应不断变化的环境。因此，可借此研究前噬菌体作为微生物“傀儡大师”的能力，即调控多种细菌功能的作用机制。

有效分析原噬菌体限制性基因表达存在两大主要障碍。首先，易感宿主的可获得性是一个关键问题。根据定义，原噬菌体已整合到其特定宿主的基因组中，因此很难找到一个易感的野生型宿主，以比较有无原噬菌体时的全局基因表达情况。这一问题可通过以下两种方式解决：对另一个易感宿主进行从头感染，或从原始野生型分离株中删除原噬菌体，同时不破坏宿主基因组的其余部分。第二个障碍在于溶原性群体的异质性。某些原噬菌体会因突变或重组而退化为"隐匿性"状态，意味着它们固定在细菌基因组的特定位置；而另一些原噬菌体则为"活性"状态，可自发或在诱导因子作用下被诱导进入复制性裂解周期。在许多溶原性培养物中，自发诱导的发生率意味着部分细菌细胞始终处于裂解性噬菌体复制过程中14，15，16。这些群体中晚期噬菌体基因的高水平表达会掩盖与溶原体限制性基因表达相关的低水平基因表达11，17。发生自发原噬菌体诱导的溶原体比例可能随生长状态、培养条件或其他触发因素而变化。因此，为研究原噬菌体对溶原体的影响，必须通过优化培养条件以利于维持溶原状态，尽可能减少自发的原噬菌体诱导事件。

本研究报道了为探究来自利物浦流行菌株（LES）的一组共栖前噬菌体影响所进行的前期准备工作 铜绿假单胞菌. 从LES中诱导并分离出活性前噬菌体 并用于感染模型 P. aeruginosa 宿主菌株，PAO116,18,19野生型的全基因组 P. aeruginosa 菌株PAO1及其溶原菌PAO1Φ2进行了测序（测序深度为30倍覆盖度），以确认野生型菌株的身份，并验证该溶原菌为同基因型。 的 LES 与囊性纤维化患者的发病率和死亡率升高相关，而 LES 噬菌体19 有助于适应 囊性纤维化肺部环境16,19,20尽管有充分证据表明这些前噬菌体影响其宿主的生物学特性20,21，其大多数基因功能尚未被表征，相互作用的具体机制也尚不明确。转录组学方法可在受控的宿主背景下实证性地揭示前噬菌体的基因功能。由于自发诱导可能影响基因表达谱，本文描述了如何优化培养条件以促进溶原状态。这种培养同步化可通过实时PCR进行验证，以定量与PAO1中LES噬菌体复制关键阶段相关的重要遗传标志物的表达水平。该方法此前已被用于鉴定志贺毒素原噬菌体所特有、并影响细菌运动性、耐酸性及抗菌药物耐性的功能 大肠杆菌11,17,21,22.

方案

1. 构建可筛选的指示宿主（图1）

注意：噬菌体培养物裂解液中可能含有来自原始细菌宿主的污染细胞。使用抗生素抗性指示菌株可有效区分指示菌株与前噬菌体的原始细菌宿主。采用可筛选的指示菌株，可在噬菌体扩增步骤后无需通过离心或过滤步骤去除溶原性细胞中的噬菌体，即可准确计数感染性噬菌体颗粒。此外，可筛选的指示宿主菌株还减少了噬菌体计数所需的时间和操作步骤，从而能够同时开展多种条件的试验。

  1. 选择一种合适的指示宿主菌株，该菌株应可被目标温和噬菌体以裂解性和溶原性方式感染。本研究中使用了P. aeruginosa实验室菌株PAO118,20，其对三种LES噬菌体（LESΦ2、LESΦ3和LESΦ4）均敏感。
  2. 选择一种合适的筛选试剂（本实验中使用利福平），并通过液体稀释法测定该试剂对指示宿主的最低抑菌浓度（MIC）（PAO1的MIC为16 µg·mL−1）23,24。
  3. 在溶原性肉汤（LB）中，将指示宿主培养物依次暴露于逐渐增加浓度的筛选试剂中，起始浓度低于MIC（本例中为5 µg·mL−1），在37 °C条件下振荡培养18–24小时。
  4. 将能在最高浓度下生长的培养物以1:100的比例（接种物与培养基之比）转接到两倍浓度升高的筛选试剂中（每次培养18–24小时），直至MIC显著提高。PAO1最终在含300 µg·mL−1利福平的条件下进化为利福平抗性菌株（PAO1-RifR）。

2. 自发诱导的时间直接计数法（图2）

  1. 通过将单个菌落接种于5 mL LB培养基中，为溶原菌（例如，携带LES噬菌体的P. aeruginosa PAO1溶原菌）和指示宿主（PAO1-RifR）分别制备过夜起始培养物，并在37 °C、180 rpm振荡条件下培养18–24小时。
  2. 将过夜培养物按1:100的比例接种至100 mL LB培养基中，制备新鲜的溶原菌和指示宿主培养物，并在37 °C、180 rpm振荡条件下培养。
    1. 通过测定OD600并结合Miles Misra技术25进行活菌计数，监测溶原菌的生长情况。具体操作为：从接种时刻起，每隔1小时从每份溶原菌培养物中取1 mL样品，持续8小时。
    2. 取样后立即进行连续稀释：取100 µL样品加入900 µL相应培养基中，充分涡旋振荡（最大速度），每次稀释后更换移液枪头，依次完成从10−1到10−9的稀释系列。
    3. 取所需稀释度的样品各10 µL，每种做三个重复点样于LB琼脂平板上，待其自然干燥后，在37 °C培养18–24小时。
    4. 为计算活菌数量，选择菌落数量易于计数的稀释度，统计每个点样区域的菌落数，然后使用以下公式计算：
      CFU计算公式，CFU·mL⁻¹=平均菌落数×稀释倍数×100，稀释系列法。
      注：随着溶原菌的生长，噬菌体会通过自发诱导产生具有感染活性的噬菌体颗粒。感染性噬菌体的产生意味着溶原菌群体的转录组中已混入裂解复制周期相关的基因表达信号（来自裂解性噬菌体复制及其宿主细胞响应）。因此，确定溶原细胞与游离感染性噬菌体颗粒比例最高的生长阶段至关重要，以便最大限度减少数据集中由裂解性噬菌体转录组引起的背景转录噪声。
  3. 为定量各时间点样品中的感染性噬菌体颗粒，将100 µL处于对数中期的指示宿主（OD600：0.4–0.5；本例中为PAO1-RifR）接种至5 mL无菌的含0.4%细菌学琼脂的LB培养基（上层软琼脂）中，并加入适当的选择性试剂（本例中为50 µg·mL−1利福平；因PAO1宿主的MIC仅为16 µg·mL−1；参见材料表第8行和第9行）
    1. 取相同系列稀释液（见步骤2.2.2）各10 µL，点样至上层接种后的软琼脂层表面，待其干燥后于37 °C培养18–24小时。
    2. 为计算感染性噬菌体颗粒数量，选择噬菌斑数量易于计数的稀释度，统计每个点样区域的噬菌斑数量。
      PFU计算公式；病毒定量的噬菌斑测定方程；实验室。
    3. 确定在后续实验步骤中每CFU（菌落形成单位）自发诱导率最低的时间点或条件。

3. 用于RNA提取的未诱导和诱导溶原菌培养物的制备（图3）

  1. 通过将溶原菌的单个菌落接种于5 mL LB培养基中，制备新鲜的过夜培养物，并在37 °C、180 rpm振荡条件下培养18–24小时。
  2. 将过夜培养物按1:100的比例接种至80 mL LB培养基中，分装于八个250 mL的锥形瓶中进行传代培养。
  3. 将第一个锥形瓶标记为“未诱导”，其余标记为“诱导”，并标注各样品应收获的时间点（例如，“诱导 t = 0”、“诱导 t = 10 min”、“诱导 t = 20 min”等；图3）。
  4. 在培养90分钟后，当OD600达到0.1–0.2之间，或处于自发诱导最低水平时（见讨论部分），向未诱导瓶中加入4 µL 1%冰醋酸（v/v）（图3）。
    注意：由于本研究中所用诱导剂以1%冰醋酸作为溶剂配制，因此单独加入等量溶剂作为对照。根据不同的诱导剂制备方式，也可考虑其他对照方案。
  5. 将未诱导瓶中的80 mL培养物加入720 mL无菌LB培养基中，立即加入终止液（冰上预冷的5% [v/v] 苯酚，pH 4.3，95% [v/v] 乙醇），终止液体积为培养物体积的20%（即160 mL），冰上孵育至少30分钟，但不超过2小时，以稳定RNA转录本12,26,27。此即为未诱导样品。
  6. 向其余七个250 mL锥形瓶中的培养物（图3）加入适当诱导剂的最低诱导浓度（本实验中为25 mg·mL−1诺氟沙星，用1%冰醋酸[w/v]配制，终浓度为1 µg·mL−1），充分混匀后，在37 °C、180 rpm振荡条件下继续培养1小时。
    注意：此步骤将促使溶原菌群体进入更协调的裂解复制状态，培养物中大多数细胞将开始产生具有感染性的噬菌体颗粒。
  7. 将诱导瓶中的80 mL培养物加入720 mL无菌LB培养基中，以稀释诱导剂，使细胞恢复生长。自0时起，每隔10分钟从各瓶中取样一次，直至1小时，每次取样均按步骤3.5所述加入终止液。
    注意：终止液可使RNA稳定达2小时。但为增强样品稳定性，后续所有操作均应在4 °C下进行。
  8. 尽快在4 °C条件下以10,000 x g离心15分钟收集细胞，处理后不得超过2小时，以防RNA降解。
  9. 弃去上清液，使用可调式自动移液器轻轻将细菌沉淀在残留液体中重悬，然后将各样品转移至1.5 mL微量离心管中。
  10. 在4 °C条件下，以高速（13,000 x g）在微量离心机中离心1分钟，弃去残余上清液。
  11. 将密封的微量离心管迅速浸入液氮中，对沉淀进行速冻。这有助于后续高效裂解细胞以提取RNA。
  12. 向每个冷冻沉淀中加入1 mL TRIzol，通过移液吹打混匀悬浮液（勿涡旋震荡）。所有样品在进行RNA提取前可储存于−80 °C。
    注意：本实验方案可在此处暂停。
  13. 对三个生物学重复样本重复执行步骤3.1–3.13。

4. 从未诱导和诱导的溶原性培养物中分离RNA

关键步骤：所有这些操作均应在无 RNase 的环境中进行28。实验台面应使用 10% NaClO 或商用 RNase 失活剂擦拭。实验器具应使用 RNase 抑制剂（如 DEPC 处理）进行处理，所有反应中均应使用无核酸酶的水。

  1. 将步骤 3.12 中经 TRIzol 处理的冷冻沉淀物在冰上解冻，加入 400 µL 分子生物学级氯仿。
  2. 将小管充分倒置振荡10秒，以彻底裂解所有细胞（操作时需 不 涡旋混匀，然后在室温（21 °C）下孵育 2–5 分钟。
  3. 通过使用制冷台式微量离心机在 4 °C、13,000 x g 条件下离心，将水相层从 TRIzol/氯仿混合物中分离出来 g 15分钟。
  4. 使用1,000 µL移液器收集水相（约500 µL，上层），注意勿扰动中间相或有机相（下层）。转移至新的1.5 mL微量离心管中。
  5. 向分离后的水相中加入450 µL分子生物学级异丙醇，颠倒充分混匀（不要 不 涡旋混匀，在室温（21 °C）下孵育30分钟。
  6. 在4 °C下，使用冷冻离心机以13,000 x g离心回收RNA g 30分钟。
  7. 弃去上清液，注意不要扰动RNA沉淀，然后用800 µL用无核酸酶水配制的70%乙醇洗涤沉淀两次（不要上下吹打）。每次洗涤后，通过再次离心5分钟以确保RNA沉淀的稳定性。
  8. 弃去乙醇，将沉淀物空气干燥。
    注意：使用10 µL微量吸头小心吸去沉淀周围的乙醇，并将离心管倒置在干净的吸水纸上使沉淀干燥。RNA沉淀应变为无色，边缘呈皱褶状且可见。干燥不充分可能导致残留乙醇，影响后续实验；而过度干燥则会使沉淀难以重悬。
  9. 将RNA在无核酸酶的水中（50 µL）重悬，于65 °C在恒温振荡器中孵育，期间每隔30秒混匀一次，总时长为3–5分钟。
    关键点：RNA 的 2'-羟基（2'-OH）在高于 65 °C 且 pH 较高的条件下可催化 RNA 链的自剪切。温度低于 65 °C 会延缓残留 DNA 的重悬，从而减少后续 DNase I 消化阶段需要消化的 DNA 量。因此，将温度维持在 65 °C 对获得最佳样品至关重要。
    注意：此步骤可暂停，样品可在 −80 °C 保存。

5. 通过DNase处理去除RNA中的污染性DNA

  1. 在进行第一链 cDNA 合成之前，为去除总 RNA 中的污染性 DNA，向 10 μg 总 RNA 中加入 0.1 体积的 10× DNase 缓冲液和 1 μL DNase 酶。轻轻混匀后，在 37 °C 下孵育 30 分钟。
  2. 重悬 DNase 去活化试剂，并加入至少 2 μL 或相当于总反应体积 10% 的该试剂。充分混匀，在室温（21 °C）下孵育 5 分钟，期间确保 DNase 去活化试剂完全再分散。
  3. 使用台式微量离心机在 10,000 × g 条件下离心 1.5 分钟，使 DNase 试剂沉淀。
  4. 将含有 RNA 的上清液转移至新管中，注意不要扰动沉淀。
    注意：按照制造商说明，使用 1 μL 量程紫外分光光度计和基于微流控的核酸计算机分析仪检测 RNA 质量；纯化的总 RNA 可在 −80 °C 下保存。对于 qRT-PCR，此时可直接使用 RNA。对于 RNA 测序等对样品质量要求更严格的下游实验，必须达到 A260/230 比值 ≥ 2.0 才能继续后续操作。
  5. 用无核酸酶水将去除了 DNA 的 RNA 溶液补至 500 μL。
  6. 加入 50 μL 无核酸酶的 3 M 醋酸钠（pH 5.3）和 495 μL 异丙醇。充分混匀后，在室温下孵育 30 分钟。
    注意：此步骤将使 RNA 沉淀。
  7. 在 13,000 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟，回收 RNA。
  8. 每次用预冷的 70% 乙醇洗涤 RNA 沉淀后，在 13,000 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟，共洗涤三次，以彻底去除盐分。
  9. 按照制造商说明，使用 1 μL 量程紫外分光光度计和基于微流控的核酸计算机分析仪检测 RNA 质量；纯化的总 RNA 可在 −80 °C 下保存。
    注意：参照指南29 确保 RNA 质量达标。如果 A260/230 比值 <2.0，则需重复步骤 5.5–5.9。

6. 无DNase RNA的定性与定量分析

  1. 使用16S rRNA引物（表2）对每份样品的总RNA取1 μg进行定量PCR，以验证DNase处理的效率，并确认无扩增产物生成。
    注：用于评估基因组DNA污染的理想引物应设计为在原核生物的内含子-外显子交界区、调控区域或转录非活性位点处退火30,31。
  2. 按照制造商说明书，使用基于微流控技术的核酸计算机分析仪测定RNA完整性数值（RIN）。
    注：应选用RIN ≥ 9的样品进行第一链cDNA合成；若样品RIN < 9，则应弃用，并重复核酸提取步骤（1.1–5.4）。
  3. 根据制造商说明书，使用高灵敏度RNA检测试剂盒和荧光计测定总RNA浓度。

7. 第一链 cDNA 合成

  1. 通过将1 μg总RNA与1 μL随机六聚体（50 ng·μL−1）和1 μL 10 mM dNTP混合物混合，为每个样品制备RNA引物混合液。然后用无核酸酶的水将总体积调整至10 μL。
  2. 在65 °C孵育反应5分钟，然后置于冰上1分钟。
  3. 按以下顺序为每个样品加入2 μL 10x RT缓冲液、4 μL 25 mM MgCl2、2 μL 0.1 M DTT、1 μL RNase抑制剂（40 U·μL−1）和1 μL逆转录试剂（200 U·μL−1），制备cDNA合成混合液。
  4. 将cDNA合成混合液加入RNA/引物混合液中。轻轻混匀，并短暂离心以使组分收集到管底。
  5. 通过在25 °C孵育10分钟，随后在50 °C孵育50分钟来启动反应。在85 °C孵育5分钟以终止反应，然后置于冰上冷却。
  6. 向每管中加入1 μL RNase H，在37 °C孵育20分钟，以去除DNA:RNA杂合体中的RNA。
  7. 最后，将cDNA合成反应稀释至总体积80 μL，并在−80 °C保存以备后续使用。
    注：本方案可在此处暂停。

8. 标准曲线与定量（q）PCR检测以确定指示噬菌体不同复制阶段的标志基因表达水平

  1. 确定一组可作为目标噬菌体复制各阶段标志物的靶基因。在本研究中，这些基因如表2所述。
  2. 使用相应的引物和PCR，以模板基因组DNA扩增每个靶基因，扩增条件如下：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒；退火温度根据引物而定（本实验采用58 °C）退火30秒；72 °C延伸1分钟；最后72 °C终延伸5分钟。
  3. 使用PCR纯化试剂盒纯化每个扩增产物，并按照制造商说明将其克隆至TA克隆载体中。通过Sanger测序验证每个克隆产物的序列。
    注意：本步骤可暂停实验流程。
  4. 使用以下公式20计算各个质粒的拷贝数：
    DNA拷贝数计算公式；分子生物学研究与分析中的方程。
  5. 通过将质粒DNA在分子级无核酸酶的无菌H2O中从109 拷贝/μL连续稀释至102 拷贝/μL，为每个标记基因制备标准模板。
  6. 根据所选qPCR系统的制造商说明进行定量PCR，每个样本取1 μL cDNA（来自步骤7.7），每个样本及相应的质粒标准品均设三个复孔；每个靶基因在96孔板中进行PCR反应。
  7. 以DNA拷贝数的对数（x轴）对循环阈值（y轴，Ct）作图，并使用Excel或R等适当平台进行线性回归分析，获得决定系数（R2）和线性方程。
    注意：决定系数应高于0.98。
  8. 利用线性回归（步骤8.7）所得的线性方程（y = mx + b）估算每个靶基因的拷贝数，其中y为估计的Ct值；x为DNA拷贝数的对数值；m为直线斜率，表示Ct值随DNA拷贝数变化的速率；b为y轴截距，代表单个DNA拷贝的估计Ct值32。
  9. 利用标准曲线线性回归所得参数及以下公式计算每个标记基因的PCR扩增效率（E），其中m为步骤8.7和8.8所得的斜率：
    静态平衡公式 E=10^(1/m)，用于物理教学的方程图示。
  10. 使用以下公式评估所有引物的扩增效率百分比：
    注意：扩增效率应在90%–110%范围内。
    扩增效率百分比公式：(E-1)×100，数学方程。
  11. 使用以下公式计算DNA的绝对拷贝数：
    绝对拷贝数公式：E^(b-Ct)，用于定量PCR分析。
    其中Ct（步骤8.8）为循环阈值，b为截距（步骤8.8），m为斜率（步骤8.8），E为PCR扩增效率（步骤8.9）。
    关键：在通过qPCR比较两个或多个靶标的扩增情况时，必须分别计算每个靶标的PCR扩增效率，以便比较其绝对DNA拷贝数。
  12. 在本研究中，16S rRNA、proC和rpoD基因被用作通用内参基因，gyrB被用作诱导对照基因33,34,35。
    注意：从RNA-seq数据中选择内参基因时，应优先选择在测试条件下表达水平无显著变化的基因。合理选择内参基因对于结果的科学解释至关重要。

结果

本研究通过直接测定在非诱导条件下培养的PAO1 LESΦ2溶原菌株中噬菌体产生的时序变化，评估了LESΦ2自发诱导的影响。在转入新鲜培养基后2小时（即对数生长早期），噬菌体密度最低，平均约为~2.61 × 106 蚀斑形成单位 (PFU)·mL−1，表明此时溶原状态占主导地位。随后，LESΦ2滴度在4小时内迅速上升至平均约~2.4 × 108 PFU·mL−1，并在6小时达到最高密度（平均约为~5.83 × 109 PFU·mL−1；图4）。

在溶原菌对数生长早期（2小时后），观察到极低水平的自发诱导。然而，培养基中可检测到的噬菌体存在是此前多个事件累积的结果，包括：核酸被包装至蛋白质头部、蛋白质组装成噬菌体颗粒、晚期噬菌体基因、中期噬菌体基因以及早期调控性噬菌体基因的表达。为在噬菌体相关复制事件表达之前捕获被感染的细胞，因此选择在诱导前让培养物生长90分钟。为获取PAO1、LESΦ2溶原菌样本的基因表达谱，按照步骤3.4所述，从培养物中分别在诱导前和诱导后每10分钟收集样本，持续90分钟。该90分钟时间点远早于通过步骤2.3.2中的噬斑实验检测到内源前噬菌体出现高水平自发诱导的时间。由于细菌在早期指数生长期的细胞密度较低，因此将培养体积放大至800 mL，以确保基因表达研究有足够的材料。从非诱导培养物和诱导培养物中每10分钟收集一次样本，并提取RNA，以绘制溶原状态和裂解复制关键标志物在细菌生长过程中的表达谱。通过靶向16S rRNA基因的qPCR实验纯化并验证总RNA中无基因组DNA污染（步骤6.1）。RIN ≥ 9的样本通过质量控制，并被逆转录为cDNA。

对注释后的LESΦ2基因组进行分析，以鉴定在温和噬菌体溶原和裂解复制周期中起关键作用的已知基因。随后利用这些鉴定出的基因，验证qRT-PCR在检测诱导与未诱导培养物中溶原周期特异性基因及裂解周期相关基因表达谱方面的有效性。我们定量了DNA的绝对拷贝数，并使用R36进行Wilcoxon符号秩检验，以比较未诱导和诱导培养物中的基因表达水平（图5）。结果显示，裂解复制早期标志基因cro的表达量从未诱导培养物中的约2.31 × 109拷贝显著上升至诱导后30分钟的约3.02 × 1011拷贝（Wilcoxon符号秩检验：p < 0.01）。类似地，作为裂解复制中期标志并预测参与噬菌体基因组复制的O蛋白和P蛋白，其表达量也分别从约1.74 × 108拷贝增至约1.25 × 1010拷贝（Wilcoxon符号秩检验：p < 0.01），以及从约6.05 × 102拷贝增至约5.68 × 105拷贝（Wilcoxon符号秩检验：p < 0.01）。最后，使用尾部相关结构基因作为裂解复制周期晚期的标志。同样观察到其表达量从未诱导培养物中的约2.31 × 106拷贝显著增加至诱导后30分钟的约4.38 × 108拷贝（Wilcoxon符号秩检验：p < 0.01）。因此，定量RT-PCR数据证实，已确立的裂解复制标志基因的表达符合预期趋势，早期、中期和晚期标志基因按预测顺序呈现出多倍差异表达（图5）。由于裂解复制标志基因在恢复后30分钟即出现表达上调，该时间点被视为研究活跃态温和噬菌体及其细菌宿主在裂解周期期间转录组景观的代表性时刻。

在未诱导条件下，我们观察到裂解基因存在一定程度的表达，这证实即使在优化培养条件下，仍会始终发生一定比例的自发诱导，此时溶原菌的数量在对数早期表现出最高的CFU与释放PFU之比。这意味着转录组学数据中始终会存在一定水平的“背景噪声”，因此强调了设置严谨对照的重要性，包括诱导和未诱导的培养样本。选择合适的内参基因以确定表达倍数变化，依赖于对转录组数据的仔细分析，以鉴定在未诱导和诱导样本中表达水平保持一致的基因。我们的初步结果表明，与16S rRNA或proC基因相比，rpoD是所测试基因中最可靠的内参基因，其表达最为稳定（诱导前约为1.71 × 105拷贝，诱导后30分钟约为3.33 × 105拷贝；Wilcoxon符号秩检验：p = 0.3594）（图5）。由于内参基因表达存在变异性，因此我们采用了转录本绝对数量的测定方法。未来对转录组数据的进一步分析将有助于选择合适的内参基因，以进行后续验证。

在我们的基因表达谱分析实验中，使用了cI基因，因为它是溶原状态的一个公认标志。与裂解复制标志物相比，cI基因的表达相对稳定（图5），但在未诱导的培养物中，该基因的拷贝数明显高于裂解复制标志物的拷贝数。这些数据与同一样本中较低的PFU数值一致，从而证实高水平的阻遏蛋白表达与噬菌体产量降低相关。本文报道的数据表明，对于这种特定噬菌体，cI转录本的表达在诱导后并未显著下调，这与志贺毒素噬菌体（Stx phages）的情况不同11,17。阻遏蛋白的活性通常在转录水平和翻译后水平共同调控，因此阻遏基因虽可被转录，但其产生的蛋白会立即发生自切割。还需进一步实验以验证转录及翻译后调控机制。此外，根据我们的标准曲线，qPCR的最低检测限约为~102拷贝。

综合斑块分析和qRT-PCR实验的结果表明，我们所采用的培养及RNA样本制备策略能够为RNA-Seq实验提供严格控制的输入样本。在对数生长期早期的未诱导培养物中，自发诱导水平以及裂解基因表达水平均较低，提示溶原状态占主导地位。相比之下，在诱导后30分钟采集的培养物中，指示裂解复制占主导地位的标志基因表达显著升高。

利福平浓度实验示意图，显示试管中黄色逐渐加深，持续7天。
图1： 构建利福平耐药指示宿主的实验方案 （使用 BioRender.com 创建）。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于CFU和PFU计数的连续稀释示意图；显示溶原菌和指示菌培养物。
图2： 从同一样本中对溶原菌的PFU和CFU进行计数的实验设计。（使用BioRender.com创建） 请点击此处查看该图的放大版本。

使用诺氟沙星处理的诱导型与非诱导型细菌培养物进行RNA提取的双流程示意图。
图3：采集诱导型与非诱导型培养物用于RNA分离的实验设计。 （由BioRender.com创建） 请点击此处查看该图的放大版本。

细菌生长与噬菌体相互作用图；Log PFU mL⁻¹ 与时间（小时）的关系；实验结果。
图 4：自发诱导过程的时间动态分析。利用PAO1 Φ2溶原菌的噬斑形成单位（PFU）对自发性LES前噬菌体产生的过程进行时间序列定量分析，并同步测定菌落形成单位（CFU），n = 8（两次生物学重复和四次技术重复）；误差线表示标准差。深红色数据点表示LB培养基中的CFU·mL−1；深蓝色数据点表示LB培养基中的PFU·mL−1。溶原菌自发释放具有感染性的φ2噬菌体，在接种后2小时处于可检测的最低水平。请点击此处查看该图的放大版本。

显示噬菌体2基因标记随时间变化的DNA拷贝数变异的箱线图；实验结果。
图5： 目标标记基因的绝对拷贝数。噬菌体标记基因的绝对拷贝数验证了通过RT-qPCR预测的基因表达模式，这些基因预计在溶原周期和裂解周期中发挥重要作用。每个点代表三个生物学重复和三个技术重复（n = 9）。（A）红色方框表示溶原周期标记基因cI；（B）绿色表示早期裂解标记基因cro；（C,D）蓝色表示中期裂解标记基因，即DNA复制相关基因；（E）洋红色表示晚期裂解标记基因，即尾部结构基因；（F–H）灰色表示用作内参对照的宿主标记基因；（I）白色表示DNA旋转酶B亚基（gyrB），用作诱导对照。实心水平线表示数据分布的中位数。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：本研究中设计的引物。 本研究中使用的标记基因和内参基因的特异性引物序列及其对应的NCBI登录号如下所示。请点击此处下载该表格。

表2：利用qPCR标准曲线计算的本研究中所用引物的扩增效率。 请点击此处下载该表格。

讨论

本文描述了可选择性指示宿主的构建方法，该方法此前曾用于噬菌斑检测，以更准确地量化大肠杆菌（E. coli）MC1061中志贺毒素噬菌体（Stx phage）的自发诱导37,38,39，现已被应用于铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）噬菌体LESΦ2。该改进方法额外具有减少样品处理步骤和时间的优势，从而能够同时评估多种培养条件下噬菌体的自发诱导率。在构建利福平抗性变异株的过程中存在产生其他突变的风险40；然而，在本研究中，所获得的菌株仅用作目标培养物中噬菌斑计数的指示宿主，并未参与转录组学分析。只要可选择性指示菌株对目标噬菌体的感染敏感性保持一致，则其他获得性突变不会造成影响。此外，通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）对PAO1WT和PAO1RIF进行分析，未检测到限制性片段长度多态性图谱的差异（数据未显示）。

在选择宿主细胞时，很少能找到不携带前噬菌体的指示菌株。例如，PAO1 就携带丝状前噬菌体 Pf4。本研究的实验对照设计旨在直接检测特定噬菌体（本例中为 LES 前噬菌体 2）的基因表达，以及该噬菌体对细菌基因表达的影响。通过比较携带 LES 前噬菌体 2 与不携带 LES 前噬菌体 2 的 PAO1 转录本（两种菌株均为溶原性或非溶原性，且均携带内源性 Pf4），可作为内部对照，以排除 Pf4 对宿主的影响。此外，已有研究表明，Pf4 通常不会导致其宿主细胞裂解41，因此不会干扰本实验的结果。

众所周知，在样本制备过程中进行严格的质控对于获得有意义的组学数据至关重要42。然而，正如先前所述11，在为这类研究制备溶原性菌株培养物时，很少对前噬菌体的活性进行细致表征。本文中，我们详细描述了用于转录组学研究的 一套严格控制且优化的培养方法 ，以更深入地探究细菌与温和噬菌体之间的相互作用。为控制群体的同步性，在使用诱导性抗生素诺氟沙星处理前，需使菌液经历至少四次倍增。通过测定该菌株对诺氟沙星的最低抑菌浓度（MIC），可确保“诱导”处理时所用诱导剂浓度略高于MIC。处理后的细胞经1:10稀释，使诺氟沙星浓度在1小时处理后降至MIC以下，从而允许细胞恢复并完成噬菌体复制过程，最终导致细胞裂解并释放具有感染性的子代噬菌体。只有在恢复期将诺氟沙星浓度降至MIC以下后，细胞才会在诱导刺激下进入裂解复制周期。在此情况下，若诺氟沙星浓度超过1 µg·mL−1，则药物无法被有效稀释至MIC以下，因为诺氟沙星对PAO1菌株的MIC为0.19 µg·mL−1。诱导剂的稀释程度必须与溶原菌恢复需求以及RNA收集时所需培养物密度的维持之间取得平衡。本文讨论的数据表明，可以通过同步培养获得以溶原状态为主导的样本，从而减少自发诱导带来的背景噪声，并能够检测到真正由溶原状态驱动的基因表达变化。由于在细菌细胞密度较低的对数早期阶段，溶原状态占主导地位，因此我们建议扩大培养规模，以收获足量RNA用于后续基因表达研究，例如RNA-Seq。

已有大量文献报道使用诺氟沙星作为诱导剂促使菌群进入裂解周期43,44；然而，该处理过程也会影响其他细菌基因的表达45,46。为减轻这一影响，在RNA-Seq实验中应纳入在相同诱导与非诱导条件下培养的对照野生型菌株的RNA文库。使用内参对照以及关键标志基因通过qRT-PCR验证噬菌体复制各阶段，对于实现准确比较也至关重要。定量RT-PCR表达谱分析不能通过比较不同时间点各基因转录本的绝对数量来解读；真正重要的是表达谱的形态特征。首先，任何基因转录本仅被取样了很小的一段区域，因此无法确定其为短寿命或较长寿命的RNA分子27。显然，RNA-Seq转录本比对结果显示，比对数据的密度在基因长度范围内存在显著差异。其次，应解读与裂解周期、溶原生活方式相关，甚至脱离噬菌体调控回路的标志基因的表达谱形态11。溶原菌培养中的自发诱导是一个实际存在的问题，总会导致与裂解周期相关基因的表达。然而，表达谱分析确实表明，与裂解复制周期相关的基因在诱导前其表达受到抑制（至少两个数量级），而在诱导后则被上调。

先前对志贺毒素噬菌体与E. coli相互作用开展的转录组学分析，有助于深入理解参与维持溶原状态及触发裂解循环的噬菌体基因11,17。目前，P. aeruginosa的LES噬菌体虽已完成注释，但其关键基因功能尚不明确。转录组学研究将有助于对LES前噬菌体进行重新注释，并加深我们对参与溶原及裂解循环相关基因的理解。将基因序列与功能关联起来是新型前噬菌体研究中的主要挑战，这进一步凸显了开展更多研究以确认噬菌体基因功能、从而开发更优注释工具的必要性47。本视频文章中详述的实验方案及其附加的质量控制措施若能被更广泛地应用与优化，将有助于揭示多种前噬菌体功能，进而改进注释流程，并推动我们对噬菌体与细菌生物学的认知。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PAO16
LESB586
LES 噬菌体使用诺氟沙星从 LESB58 中诱导并纯化获得。本研究
LB 培养基（Lysogeny Broth）Merck1.10285.500
LB 琼脂Merck1.10283.500
琼脂粉（Agar Agar）FisherA/1080/53
顶层琼脂（Top Agar）每 100 mL 水中加入 0.4 g 琼脂粉和 2.5 g LB 培养基，高压灭菌后使用。-
利福平（Rifampicin）Sigma（储存液：50 mg/mL 溶于甲醇；充分混匀，用 0.22µm 滤器过滤除菌，-20°C 保存备用）R3501
冰醋酸（Glacial Acetic Acid）Fisher，水中 1% (v/v)10060000
诺氟沙星（Norfloxacin）Sigma（储存液：25 mg/mL 溶于 1% 冰醋酸；充分混匀，用 0.22µm 滤器过滤除菌，-20°C 保存备用；为避免反复冻融，请分装保存）N9890
柠檬酸缓冲液饱和酚，pH 4.3SigmaP-4682
分子生物学级乙醇Fisher16695992
TRIzolInvitrogen12044977
氯仿Fisher11398187
异丙醇Fisher17150576
无核酸酶水（Nuclease-free H2O）Invitrogen10526945
10X TURBO DNaseAmbionAM1907
Qubit RNA HS 和 BR 试剂盒InvitrogenQ10210
Agilent RNA 6000 Nano 试剂盒Agilent5067-1511
SuperScriptIII 第一链 cDNA 合成试剂盒Invitrogen18080051
PCR 试剂Bioline Mytaq Red 2XBIO-25043
qPCR 试剂Sensifast SYBR Hi RoxBIO-92020
PCR 纯化试剂盒Isolate II PCR 和凝胶纯化试剂盒BIO-52060
TA 克隆试剂盒TA 克隆试剂盒，含 pCR 2.1 载体，不含感受态细胞K202040
StepOne 实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific4376600

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PCR RNA

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