“细胞表面捕获”工作流程用于无标记定量分析细胞表面蛋白质组

摘要

本文介绍了一种用于表征多种细胞类型细胞表面蛋白质组的蛋白质组学工作流程。该工作流程包括细胞表面蛋白质的富集、后续样品制备、利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台进行分析，以及使用专用软件进行数据处理。

摘要

在过去十年中，基于质谱的蛋白质组学技术已实现对多种应用中生物系统的深入表征。人类疾病中的细胞表面蛋白质组（“表面组”）备受关注，因为细胞质膜蛋白是大多数临床批准药物治疗的主要靶点，同时也是用于诊断性区分病变细胞与健康组织的关键特征。然而，针对细胞膜及细胞表面蛋白的特异性表征仍然具有挑战性，主要原因是细胞裂解液成分复杂，其中高丰度蛋白会掩盖目标蛋白的检测。为突破这一技术障碍，并利用质谱蛋白质组学准确界定不同细胞类型的细胞表面蛋白质组，必须在质谱分析前对细胞裂解液中的细胞表面蛋白进行富集。本文介绍了一种详细的实验流程，用于标记癌细胞的细胞表面蛋白，从细胞裂解液中富集这些蛋白，并进行后续的质谱分析样品制备。

引言

蛋白质是执行大多数细胞功能的基本单位。对相关蛋白质的结构和功能进行表征，是理解生物学过程的关键步骤。在过去十年中，质谱技术、分析软件和数据库的进步使得能够在全蛋白质组水平上准确检测和定量蛋白质¹。基于质谱的蛋白质组学可广泛应用于多种领域，从基础科学研究中的生化通路分析，到转化医学中新药物靶点的鉴定，再到临床疾病诊断与监测²。在筛选新药物靶点时，细胞表面蛋白质组的表征尤为重要，目前超过65%的获批人类药物均以细胞表面蛋白质为靶点³。癌症免疫治疗领域也完全依赖于肿瘤特异性细胞表面抗原，以实现对肿瘤细胞的靶向并特异性清除⁴。因此，基于质谱的蛋白质组学有望成为识别新的细胞表面蛋白并推动治疗干预的有力工具。

然而，利用传统的蛋白质组学方法对肿瘤细胞进行新型细胞表面蛋白靶点筛选时存在若干局限性。主要问题是，表面蛋白仅占细胞内总蛋白分子中极小的一部分。因此，在对全细胞裂解液进行质谱分析时，这些蛋白的片段会被大量存在的细胞内蛋白所掩盖⁵。这一限制使得采用传统蛋白质组学流程难以准确表征细胞表面的蛋白质组。为解决这一问题，有必要在质谱分析前建立富集细胞表面蛋白的方法，从全细胞裂解液中特异性分离这些蛋白。其中一种方法是在完整细胞中对糖基化的细胞表面蛋白进行氧化和....

方案

注意：本细胞表面蛋白质组实验使用了AMO1浆细胞瘤细胞。该相同方案也可用于其他细胞类型，包括多种悬浮和贴壁细胞系⁹，以及多种类型的原代样本¹⁰。然而，通常需要优化细胞数量（实验起始材料），以获得相当的蛋白质组覆盖度。有关材料与设备的详细信息，请参见材料表。有关缓冲液和试剂溶液及其成分的详细信息，请参见表1。

1. 使用生物素进行细胞表面标记

1. 计数培养的细胞，并收集约 3.5 × 10⁷ 通过离心（500 × g 下 5 分钟）收集活细胞 g，24 °C）。
   注意：AMO1 浆细胞瘤细胞在收获前每 3 天用新鲜培养基传代一次。
2. 吸弃上清液，加入1 mL冷的（4 °C）无钙无镁杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），轻轻吹打重悬沉淀。
3. 再次离心收集细胞（同步骤1.1），并重复洗涤步骤（步骤1.2）一次（共洗涤两次）。
4. 第二次洗涤后，离心收集细胞（同步骤1.1），并用移液枪轻轻吹打，将细胞重悬于990 µL预冷的D-PBS中。
5. 配制 160 mM 偏高碘酸钠（NaIO₄）的储备液₄）之前，分装为50 µL等份，于-20....

结果

在本实验中，我们通过标记对一种肿瘤细胞系的细胞表面蛋白质组进行了表征 N-利用生物素标记完整细胞的糖基化膜蛋白，并通过链霉亲和素（neutravidin）下拉法从全细胞裂解液中富集这些标记蛋白图1）。此外，我们采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组分析，以表征富集的细胞表面蛋白。与全细胞蛋白质组分析不同，本实验的目标仅为表征细胞表面蛋白。因此，我们起始样品输入量为 3.5 × 10⁷ AMO-1 浆细胞瘤细胞。我们获得了约 630 ng/μL 的最终肽浓度。µL 基于比色法多肽定量分析，总得率约为 ~12.6 µg 肽（在 20 µL) (图2A）。然后我们注射了 1 µg 将肽样品注入LC-MS/MS系统，并重复进样三次以获得技术重复。所用的液相色谱（LC）和质谱（MS）参数均基于前期实验进行优化（图2C 和 图3A

讨论

基于质谱的蛋白质组学是一种强大的工具，能够在前所未有的规模上对数千种未知蛋白质进行无偏倚的表征。该方法通过分析特定样本中存在的多种蛋白质，使我们能够鉴定并定量这些蛋白质，同时获得有关细胞和组织结构及信号传导能力的广泛信息。质谱技术不仅限于对样本中蛋白质的全局分析，还可用于表征这些蛋白质上的多种翻译后修饰（PTMs），从而更深入地揭示信号通路阶段和蛋白质动态变化，而这些信息在DNA或RNA水平的分析中是无法获得的¹。在开发新型癌症治疗药物的过程中，基于质谱的蛋白质组学使我们能够比较恶性肿瘤细胞与健康组织的蛋白质谱，以识别潜在的可靶向治疗靶点。

癌症免疫治疗这一快速发展的领域依赖于恶性细胞表面表达的抗原来识别并选择性地摧毁肿瘤。由于缺乏仅存在于肿瘤组织而不存在于健康组织中的独特癌症特异性抗原，限制了新型癌症免疫疗法的开发，因此鉴定更多肿瘤细胞特异性的新抗原至关重要¹⁵。肿瘤特异性抗原不一定是肿瘤细胞独有的完整蛋白质，也可以是健康组织中不存在的特定蛋白质构象或翻译后修饰（PTMs）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂盒
96X iST 样品制备试剂盒	PreOmics	P.O.00027	蛋白质组学样品制备试剂盒。包含还原、烷基化和消化所需的试剂，以及脱盐柱和相关试剂。
Pierce 定量比色肽检测试剂盒	Thermo	23275	肽定量试剂盒。包含肽标准品及工作试剂的组分。
试剂
乙腈	Fisher	A955-1
碳酸氢铵	Millipore Sigma	09830-1KG
生物胞素酰肼	Biotium	90060
D-PBS（不含钙和镁盐）	UCSF 细胞培养中心	CCFAL003-225B01
甲酸	Honeywell	94318
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂单次使用混合液	Thermo	1861280
高容量 Neutravidin 琼脂糖树脂	Thermo	29204
磷酸盐缓冲液	UCSF 细胞培养中心	CCFAL001-22J01
RIPA 裂解缓冲液，10 倍浓度	Millipore Sigma	20-188
氯化钠	Fisher	BP358-212
偏高碘酸钠	Alfa Aesar	13798
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
超纯 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575-038
尿素（蛋白质组学级）	VWR	M123-1KG
设备
TC20 自动细胞计数仪	Bio-Rad	1450102
PrismR 微型离心机	Labnet International	C2500-R-230V
超声破碎仪	VWR	Branson Sonifier 240
真空 manifold 装置	Promega	Promega Vac-Man
振荡加热金属浴	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
端对端旋转混合仪	Labnet	Revolver 可调旋转仪
液相色谱仪	Thermo	Ultimate 3000 HPLC 和 UHPLC
Q Exactive Plus 混合四极杆 Orbitrap 质谱仪	Thermo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
酶标仪	Biotek	Biotek Synergy 2
真空浓缩仪	Labconco	7810010
耗材
1.5 mL 蛋白低吸附管	Eppendorf	22431081
1.7 mL 微量离心管
过滤柱	Bio-Rad	7326008
离心柱	Thermo	69725