用于细胞表面蛋白质组无标记定量的"细胞表面捕获"工作流程

Summary

在这里，我们描述了一种蛋白质组学工作流程，用于表征各种细胞类型的细胞表面蛋白质组。该工作流程包括细胞表面蛋白富集、后续样品制备、使用 LC-MS/MS 平台进行分析以及使用专用软件进行数据处理。

Abstract

在过去十年中，基于质谱的蛋白质组学已经能够在广泛的应用中对生物系统进行深入表征。人类疾病中的细胞表面蛋白质组（"表面组"）具有重要意义，因为质膜蛋白是大多数临床批准的治疗方法的主要靶标，也是诊断区分患病细胞和健康组织的关键特征。然而，细胞膜和表面蛋白的聚焦表征仍然具有挑战性，这主要是由于细胞裂解物的复杂性，它被其他高丰度蛋白质掩盖了目标蛋白质。为了克服这一技术障碍并使用质谱蛋白质组学准确定义各种细胞类型的细胞表面蛋白质组，有必要在质谱仪上分析之前富集细胞表面蛋白的细胞裂解物。本文介绍了从癌细胞中标记细胞表面蛋白、从细胞裂解物中富集这些蛋白质以及随后用于质谱分析的样品制备的详细工作流程。

Introduction

蛋白质是执行大多数细胞功能的基本单位。表征相关蛋白质的结构和功能是了解生物过程的重要步骤。在过去十年中，质谱技术、分析软件和数据库的进步使得在蛋白质组范围的范围内准确检测和测量蛋白质成为可能¹。基于质谱的蛋白质组学可用于多种应用，从生化途径的基础科学分析，到转化环境中新药物靶标的鉴定，再到临床疾病的诊断和监测²。在筛选新药物靶标时，细胞表面蛋白质组的表征尤为重要，目前批准的人类药物中有 65% 以上靶向细胞表面蛋白³。癌症免疫治疗领域也完全依赖于癌症特异性细胞表面抗原来靶向和特异性消除肿瘤细胞⁴。因此，基于质谱的蛋白质组学可以作为一种很有前途的工具，用于识别新的细胞表面蛋白以进行治疗干预。

然而，当利用传统的蛋白质组学方法研究肿瘤细胞中的新型细胞表面蛋白靶标时，存在一些局限性。一个主要问题是表面蛋白在细胞总蛋白质分子中只占很小的一部分。因此，在对全细胞裂解物进行质谱分析时，这些蛋白质的片段被高丰度的细胞内蛋白质所掩盖⁵。这一限制使得使用传统蛋白质组学工作流程准确表征细胞表面蛋白质组变得具有挑战性。为了应对这一挑战，有必要开发在质谱仪上分析之前从全细胞裂解物中富集细胞表面蛋白的方法。其中一种方法涉及完整细胞中糖基化细胞表面蛋白的氧化和生物素标记，然后通过中性亲和素下拉从裂解物中富集这些生物素化蛋白，这一过程被称为"细胞表面捕获"⁶。由于 ~85% 的哺乳动物细胞表面蛋白被认为是糖基化的⁷，因此这是从整个细胞裂解物中富集细胞表面蛋白质组的有效方法。本文描述了一个完整的工作流程，从培养的细胞开始，到细胞表面生物素标记，然后为质谱分析准备样品（图 1）。在几次重复中，该方法提供了对特定样品的细胞表面蛋白质组的稳健覆盖。利用这种方法来表征肿瘤细胞和健康细胞的细胞表面蛋白质组可以促进新型细胞表面抗原的发现，以确定潜在的免疫治疗靶点⁸。

Protocol

注：AMO1 浆细胞瘤细胞用于该细胞表面蛋白质组实验。相同的方案也可用于其他细胞类型，包括各种悬浮和贴壁细胞系⁹，以及各种类型的原代样品¹⁰。然而，细胞数量（实验的起始材料）通常必须优化等效的蛋白质组覆盖率。有关材料和设备的详细信息，请参阅材料表。有关缓冲液和试剂溶液及其组成的详细信息，请参见表 1。

1. 用生物素标记细胞表面

1. 计数培养的细胞，并通过离心沉淀大约 3.5 × 10⁷ 个活细胞（在 500 × g，24 °C 下 5 分钟><）。 注：AMO1 浆细胞瘤细胞在收获前 3 天用新鲜培养基传代一次。
2. 吸出上清液，并通过加入 1 mL 冷 （4 °C） Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （D-PBS）（无钙，无镁）重悬沉淀，然后轻轻上下移液。
3. 再次沉淀细胞（如步骤 1.1 所示）并再次重复洗涤步骤（步骤 1.2）（总共两次洗涤）。
4. 第二次洗涤后，沉淀细胞（如步骤 1.1 所示），并通过轻轻移液将其重悬于 990 μL 冷 D-PBS 中。
5. 预先准备 160 mM 偏高碘酸钠 （NaIO₄） 的储备溶液。分成 50 μL 等分试样，在 -20 °C 下储存长达 6 个月。在步骤 1.4 中向细胞悬液中加入 10 μL 160 mM 偏高碘酸钠溶液，充分混合，并在 4 °C 下在端到端转子上孵育 20 分钟。
6. 孵育完成后，沉淀细胞（如步骤 1.1 所示），倒出上清液，并重悬于 1 mL 冷 D-PBS 中。重复此洗涤步骤两次（总共洗涤 3 次）。第三次洗涤后，将细胞重悬于 989 μL D-PBS 中。
7. 预先制备 100 mM 生物胞素酰肼的储备溶液。分成 50 μL 等分试样，在 -20 °C 下储存长达 6 个月。在步骤 1.6 中，向细胞悬液中加入 1 μL 苯胺和 10 μL 100 mM 生物胞素酰肼，充分混合，并在 4 °C 下在端到端转子上孵育 60 分钟。
8. 孵育完成后，沉淀细胞（如步骤 1.1 所示），倒出上清液，并重悬于 1 mL 冷 D-PBS 中。重复此洗涤步骤两次（总共洗涤 3 次）。
9. 第三次洗涤后，用移液管小心吸出上清液，并将试管放入液体 N₂ 中快速冷冻细胞沉淀。将冷冻沉淀置于 -80 °C，直到准备好进行裂解和下拉。

2. 细胞裂解和生物素下拉

1. 在冰上解冻冷冻细胞沉淀。
2. 向沉淀中加入 500 μL 2x 裂解缓冲液，充分混合，涡旋 30 s.
   注：可能需要用力移液和涡旋才能完全裂解沉淀。一些不溶性碎片（即 DNA）是可以接受的，因为它会在随后的超声处理步骤中去除。
3. 在冰上对细胞裂解物进行超声处理（3 次爆发，每次 20 秒，60% 占空比）。
4. 离心裂解物以沉淀任何残留的碎片（在 4 °C 下以 17,200 × g 离心 10 分钟）。
5. 在裂解物离心时，向过滤柱中加入 100 μL 中性亲和素琼脂糖树脂珠。将色谱柱连接到真空歧管上，施加温和的真空，然后在珠子上流 3 mL 洗涤缓冲液 1 来洗涤珠子。
6. 从真空歧管中取出过滤柱，盖上底部，然后将澄清的细胞裂解物添加到带有珠子的柱子中。盖上柱顶部，将裂解物与珠子在端到端转子上在 4 °C 下孵育 120 分钟><。 注：加盖色谱柱顶部时，请牢牢地固定底盖，否则在孵育过程中，底盖可能会脱落，细胞裂解物可能会泄漏。
7. 准备洗涤缓冲液 1、2 和 3（每个样品约 5 mL 的每种洗涤缓冲液，参见表 1），并将它们置于 42 °C 水浴中
8. 裂解液孵育完成后，将过滤柱放回真空歧管上，施加温和的真空，然后将 5 mL 洗涤缓冲液 1 流到磁珠上清洗磁珠。
   注：超过 5 mL 的洗涤缓冲液可用于洗涤;额外的洗涤可能会减少背景、非特异性结合到磁珠上。
9. 用 5 mL 洗涤缓冲液 2 重复洗涤步骤。
10. 用 5 mL 洗涤缓冲液 3 重复洗涤步骤。
11. 一旦最终洗涤缓冲液完全流过磁珠，从歧管中取出色谱柱。向磁珠中加入 100 μL"裂解"溶液，然后用移液管将其转移到 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。短暂旋转试管以沉淀珠子，并在不干扰沉淀珠子的情况下去除 50 μL 溶液><。 注：此步骤和所有后续步骤中的试剂均使用市售的蛋白质组学样品制备试剂盒。该试剂盒提供了优化、简化的样品制备工作流程。然而，这些步骤也可以独立于试剂盒执行，使用 Verma 等人^{9 中描述的传统蛋白质组学工作流程}。如果微珠仍然粘在色谱柱的侧面或底部，请让已转移到试管中的微珠沉降，并在试管中使用额外的"裂解"溶液来转移剩余的微珠。
12. 将试管放在 65 °C 的加热块/振荡器上，并以 1,000 rpm 摇动 10 分钟
    注：在消化前对半胱氨酸残基进行还原和烷基化时，需要执行此步骤。

3. 蛋白质消化

1. 通过添加 210 μL 的"重悬"溶液，重悬干燥的胰蛋白酶（试剂盒中的"消化"管，储存在 -20 °C）。上下吹打溶液数次，以确保所有干燥的胰蛋白酶都被重悬。
2. 孵育完成后，向磁珠中加入 50 μL 重悬的胰蛋白酶溶液。将试管在 37 °C 下孵育，以 500 rpm 振荡至少 90 分钟以消化蛋白质。
3. 消化完成后，将含有磁珠的溶液转移到离心柱中，然后将柱插入 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。旋转试管（在室温 [RT] 下 500 × g 5 分钟），以将消化的肽溶液与珠子分离><。 注：在此阶段，一旦珠子从肽溶液中分离出来，就可以对珠子进行 PNGase 处理，以从链霉亲和素珠子上洗脱生物素化肽片段。然后，该肽样品可以作为单独的二级肽样品进行分析，并与磁珠上胰蛋白酶消化的初级样品进行比较。鉴于基于 MS 可检测侧链修饰捕获的 N-糖基化天冬酰胺具有额外的特异性12。然而，这种顺序洗脱方法的缺点是每次样品分析需要两倍的质谱仪仪器时间。
4. 加入 100 μL "Stop" 溶液以终止消化反应并使肽溶液酸化。

4. 肽脱盐

1. 使用试管适配器，将脱盐柱放入 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。将整个酸化肽溶液加入色谱柱中。旋转色谱柱（3,800 × g 3 min），使溶液流过色谱柱。肽现在已结合到色谱柱上;丢弃流出物。
2. 向色谱柱中加入 200 μL "Wash 1"溶液并离心（3,800 × g，3 分钟，RT）。丢弃流通件。
3. 向色谱柱中加入 200 μL "洗涤 2"溶液并离心（3,800 × g，3 分钟，RT）。丢弃流通件。
4. 将色谱柱转移至新的标记 1.7 mL 低蛋白结合微量离心管中。向色谱柱中加入 100 μL "洗脱"溶液并离心（3,800 × g，3 分钟，RT）。向色谱柱中再加入 100 μL "洗脱"溶液并离心（3,800 × g，3 分钟，RT）。肽现在从色谱柱上洗脱到试管中。
5. 将肽溶液放入真空离心机中，使其干燥过夜。将干燥的肽置于-80°C，直到准备好定量，并在质谱仪上进行分析。

5. 肽重悬和定量

将
1. 干燥的肽重悬于 20 μL 溶剂 A（0.1% 甲酸、2% 乙腈）中。
2. 离心重悬的肽（17,200 × g 10 分钟）以沉淀任何不溶性碎片。
3. 制备用于比色肽定量测定的肽标准品。
   1. 将 5 μL 1,000 mg/mL 肽储备液放入 96 孔板的一个孔中。
   2. 在板中用去离子 （DI） 水进行七步连续稀释，如下所示，每孔使用每种标准品 5 μL：1,000 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL 和 15.625 mg/mL。将 5 μL 去离子水放入空白的第八个孔中。
4. 将 4 μL 去离子水放入 96 孔板的三个独立孔中。向每个孔中加入 1 μL 重悬的肽溶液，总体积为 5 μL。
   注：移液肽溶液进行定量时，请小心地从溶液顶部移液，以防止干扰任何沉淀的碎片。
5. 计算需要多少工作试剂（每孔需要 45 μL）。准备所需体积的比色测定工作试剂;涡旋工作试剂以确保组分正确混合。
6. 向每个标准品和样品孔中加入 45 μL 工作试剂。
   注：将标准品一式两份，并使用多通道移液器，以确保将试剂添加到孔中的时间差异最小。
7. 用铝箔覆盖板，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
8. 在自动读板器上分析板。使用为标准样品记录的吸光度值生成线性标准曲线。确定标准曲线和 R² 值的方程。如果 R² 值合理 （≥0.95），则使用标准曲线确定重悬肽的浓度，考虑比色测定板中的五倍稀释。

6. 液相色谱-串联质谱 （LC-MS/MS） 分析消化肽

1. 通过添加溶剂 A 将肽样品的浓度调节至 0.2 μg/μL，并将 10 μL 转移到 0.6 mL 低蛋白结合管中。
2. 将试管放入 LC 自动进样器中。
3. 根据 图 2 和 图 3 设置 LC 和 MS/MS 参数。
将
4. 5 μL （1 μg） 肽样品注入 LC-MS/MS 设置中进行分析><。 注：此处显示的 LC-MS/MS 设置仅代表图示。根据 LC 和 MS 仪器的可用性，用户可以修改 LC 梯度和 MS/MS 参数的设置，以获得较深的蛋白质组覆盖度。在本文中，使用 MaxQuant https://www.maxquant.org/ 进行 MS 数据分析，使用 Perseus https://maxquant.net/perseus/ 进行二次数据分析，使用 https://reactome.org/ 进行通路分析。

Results

在这个实验中，我们通过用生物素标记完整细胞的 N-糖基化膜蛋白，并用中性亲和素下拉从全细胞裂解物中富集这些标记的蛋白质来表征肿瘤细胞系的细胞表面蛋白质组（图 1）。此外，我们使用 LC-MS/MS 进行了蛋白质组分析，以表征富集的细胞表面蛋白。与全细胞蛋白质组分析不同，这里的目标是仅表征细胞表面蛋白。因此，我们从 3.5 × 10^{个 7} 个 AMO-1 浆细胞瘤细胞的样品起始量开始。根据比色肽定量测定法，我们获得的最终肽浓度为 ~630 ng/μL，总产量为 ~12.6 μg 肽（20 μL）（图 2A）。然后，我们将 1 μg 肽样品注入 LC-MS/MS 系统中，重复进样 3 次以进行技术重复。使用的 LC 和 MS 参数根据先前的实验进行了优化（图 2C 和 图 3A）。我们利用 4 小时的长 LC 梯度来确保最大覆盖率。...

Discussion

基于质谱的蛋白质组学是一种强大的工具，它能够以前所未有的规模对数千种未知蛋白质进行无偏见的表征。这种方法使我们能够识别和量化蛋白质，并通过表征特定样品中存在的各种蛋白质来收集有关细胞和组织结构和信号传导能力的一系列见解。除了样品中的全局蛋白质分析之外，质谱法还使我们能够表征这些蛋白质上的各种翻译后修饰 （PTM），从而更深入地了解 DNA 或 RNA 水平¹ 分析时无法获得的信号通路和蛋白质动力学的阶段。为了开发新的癌症疗法，基于质谱的蛋白质组学使我们能够比较恶性肿瘤细胞与健康组织的蛋白质谱，以确定潜在的可成药靶点。

快速发展的癌症免疫治疗领域依靠恶性细胞表面表达的抗原来识别和选择性地破坏肿瘤。由于新型癌症免疫疗法的开发受到缺乏健康组织中不存在的独特癌症特异性抗原的限制，因此识别更多肿瘤细胞特异性的新型抗原至关重要¹⁵。肿瘤特异性抗原不一定是肿瘤细胞特有的全蛋白，也可以是健康组织中不存在的特定蛋白质构象或PTM^16,17

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂盒
96X 宜特样品制备试剂盒	PreOmics	P.O.00027	蛋白质组学样品制备试剂盒。包括用于还原、烷基化和酶解的试剂。还包括脱盐柱和试剂。
Pierce 定量比色肽测定	Thermo	23275	肽定量试剂盒。包括肽标准品和工作试剂组分。
<强>试剂
乙腈	Fisher	A955-1
碳酸氢铵	Millipore Sigma	09830-1KG
生物胞素酰肼	生物素	90060
D-PBS（不含钙和镁盐）	UCSF 细胞培养设施	CCFAL003-225B01
甲酸	霍尼韦尔	94318
终止蛋白酶和磷酸酶抑制剂一次性使用混合物	Thermo	1861280
高容量中性亲和素琼脂糖树脂	Thermo	29204
磷酸盐缓冲盐水	UCSF 细胞培养设施	CCFAL001-22J01
RIPA 裂解缓冲液，10x	Millipore Sigma	20-188
氯化钠	Fisher	BP358-212
偏高碘酸钠	Alfa Aesar	13798
台盼蓝染色剂 （0.4%）	Gibco	15250-061
超纯 0.5 M EDTA，pH 值 8.0	Invitrogen	15575-038
尿素（蛋白质组学级）	VWR	M123-1KG
strong>设备
TC20 自动细胞计数仪	Bio-Rad	1450102
PrismR 微量离心机	Labnet International	C2500-R-230V
超声波仪	VWR	Branson Sonifier 240
真空歧管	Promega	Promega Vac-Man
振荡加热块	Eppendorf	Eppendorf Thermomixer C
端到端旋转器	Labnet	Revolver 可调旋转器
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC 和 UHPLC
Q Exactive Plus 混合型四极杆 Orbitrap 质谱仪	Thermo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
酶标仪	Biotek	Biotek Synergy 2
真空浓缩仪	Labconco	7810010
耗材
1.5 mL 蛋白质 LoBind 离心管	Eppendorf	22431081
1.7 mL 微量离心管
过滤柱	Bio-Rad	7326008
离心柱	Thermo	69725