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“细胞表面捕获”工作流程用于无标记定量分析细胞表面蛋白质组

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DOI：

10.3791/64952

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2023年3月24日

 ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, University of California, San Francisco, 2Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Bombay, 3Deptartment of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 4Chan Zuckerberg Biohub

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于表征多种细胞类型细胞表面蛋白质组的蛋白质组学工作流程。该工作流程包括细胞表面蛋白质的富集、后续样品制备、利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）平台进行分析，以及使用专用软件进行数据处理。

摘要

在过去十年中，基于质谱的蛋白质组学技术已实现对多种应用中生物系统的深入表征。人类疾病中的细胞表面蛋白质组（“表面组”）备受关注，因为细胞质膜蛋白是大多数临床批准药物治疗的主要靶点，同时也是用于诊断性区分病变细胞与健康组织的关键特征。然而，针对细胞膜及细胞表面蛋白的特异性表征仍然具有挑战性，主要原因是细胞裂解液成分复杂，其中高丰度蛋白会掩盖目标蛋白的检测。为突破这一技术障碍，并利用质谱蛋白质组学准确界定不同细胞类型的细胞表面蛋白质组，必须在质谱分析前对细胞裂解液中的细胞表面蛋白进行富集。本文介绍了一种详细的实验流程，用于标记癌细胞的细胞表面蛋白，从细胞裂解液中富集这些蛋白，并进行后续的质谱分析样品制备。

引言

蛋白质是执行大多数细胞功能的基本单位。对相关蛋白质的结构和功能进行表征，是理解生物学过程的关键步骤。在过去十年中，质谱技术、分析软件和数据库的进步使得能够在全蛋白质组水平上准确检测和定量蛋白质1。基于质谱的蛋白质组学可广泛应用于多种领域，从基础科学研究中的生化通路分析，到转化医学中新药物靶点的鉴定，再到临床疾病诊断与监测2。在筛选新药物靶点时，细胞表面蛋白质组的表征尤为重要，目前超过65%的获批人类药物均以细胞表面蛋白质为靶点3。癌症免疫治疗领域也完全依赖于肿瘤特异性细胞表面抗原，以实现对肿瘤细胞的靶向并特异性清除4。因此，基于质谱的蛋白质组学有望成为识别新的细胞表面蛋白并推动治疗干预的有力工具。

然而，利用传统的蛋白质组学方法对肿瘤细胞进行新型细胞表面蛋白靶点筛选时存在若干局限性。主要问题是，表面蛋白仅占细胞内总蛋白分子中极小的一部分。因此，在对全细胞裂解液进行质谱分析时，这些蛋白的片段会被大量存在的细胞内蛋白所掩盖5。这一限制使得采用传统蛋白质组学流程难以准确表征细胞表面的蛋白质组。为解决这一问题，有必要在质谱分析前建立富集细胞表面蛋白的方法，从全细胞裂解液中特异性分离这些蛋白。其中一种方法是在完整细胞中对糖基化的细胞表面蛋白进行氧化和生物素标记，随后利用链霉亲和素（neutravidin）下拉法从裂解液中富集这些生物素标记的蛋白，该过程被称为"细胞表面捕获"6。由于约85%的哺乳动物细胞表面蛋白被认为具有糖基化修饰7，因此该方法可有效实现从全细胞裂解液中富集细胞表面蛋白质组。本文描述了一个完整的实验流程，从培养细胞开始，进行细胞表面生物素标记，并进行后续质谱分析的样品制备（图1）。通过多次重复实验，该方法可对特定样本的细胞表面蛋白质组实现稳健而全面的覆盖。利用该方法对肿瘤细胞和正常细胞的细胞表面蛋白质组进行表征，有助于发现新的细胞表面抗原，从而识别潜在的免疫治疗靶点8。

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方案

注意：本细胞表面蛋白质组实验使用了AMO1浆细胞瘤细胞。该相同方案也可用于其他细胞类型，包括多种悬浮和贴壁细胞系9，以及多种类型的原代样本10。然而，通常需要优化细胞数量（实验起始材料），以获得相当的蛋白质组覆盖度。有关材料与设备的详细信息，请参见材料表。有关缓冲液和试剂溶液及其成分的详细信息，请参见表1。

1. 使用生物素进行细胞表面标记

  1. 计数培养的细胞，并收集约 3.5 × 107 通过离心（500 × g 下 5 分钟）收集活细胞 g，24 °C）。
    注意：AMO1 浆细胞瘤细胞在收获前每 3 天用新鲜培养基传代一次。
  2. 吸弃上清液，加入1 mL冷的（4 °C）无钙无镁杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS），轻轻吹打重悬沉淀。
  3. 再次离心收集细胞（同步骤1.1），并重复洗涤步骤（步骤1.2）一次（共洗涤两次）。
  4. 第二次洗涤后，离心收集细胞（同步骤1.1），并用移液枪轻轻吹打，将细胞重悬于990 µL预冷的D-PBS中。
  5. 配制 160 mM 偏高碘酸钠（NaIO₄）的储备液4）之前，分装为50 µL等份，于-20 °C保存，可保存长达6个月。在步骤1.4的细胞悬液中加入10 µL 160 mM高碘酸钠溶液，充分混匀，并于4 °C在旋转摇床上孵育20分钟。
  6. 孵育完成后，离心收集细胞（同步骤1.1），弃去上清液，加入1 mL冷的D-PBS重悬细胞。重复洗涤两次（共洗涤三次）。第三次洗涤后，将细胞重悬于989 µL的D-PBS中。
  7. 预先配制100 mM生物胞素酰肼储备液，分装为50 µL每份，于-20 °C保存，可稳定保存长达6个月。在步骤1.6的细胞悬液中加入1 µL苯胺和10 µL 100 mM生物胞素酰肼，充分混匀，于4 °C在旋转摇床上孵育60分钟。
  8. 孵育结束后，离心收集细胞（同步骤1.1），弃去上清液，加入1 mL冷的D-PBS重悬细胞。重复洗涤两次（共洗涤三次）。
  9. 第三次洗涤后，用移液管小心吸去上清液，并通过将离心管置于液氮中快速冷冻细胞沉淀2将冻存的沉淀物置于 -80 °C 保存，直至准备进行裂解和下拉实验。

2. 细胞裂解与生物素下拉

  1. 将冻存的细胞沉淀置于冰上解冻。
  2. 向沉淀中加入500 µL 2x裂解缓冲液，充分混匀，涡旋振荡30秒。
    注意：可能需要用力吹打和涡旋以彻底裂解沉淀物。一些不溶性残渣（如 DNA）可以接受，因为它们会在后续的超声处理步骤中被去除。
  3. 将细胞裂解物在冰上进行超声处理（3次脉冲，每次20秒，占空比60%）。
  4. 离心裂解液以沉淀任何残留的碎片（10 分钟，17,200 × g 在 4 °C 下。
  5. 在裂解液离心的同时，将100 µL中性亲和素琼脂糖树脂珠加入过滤柱中。将过滤柱连接至真空 manifold，施加轻柔的负压，用3 mL洗涤缓冲液1冲洗树脂珠。
  6. 从真空抽滤装置上取下过滤柱，封闭底部，将澄清的细胞裂解液加入含有珠子的柱中。封闭柱子顶部，在4 °C下将裂解液与珠子在旋转摇床上孵育120分钟。
    注意：封闭柱子顶部时，应牢固握住底部封帽，否则在孵育过程中可能导致封帽脱落，引起细胞裂解液泄漏。
  7. 配制洗涤缓冲液1、2和3（每个样品约需每种洗涤缓冲液5 mL，参见 表1，并将它们置于42°C水浴中
  8. 裂解液完成孵育后，将过滤柱重新放回真空装置上，施加轻柔的负压，使5 mL洗涤缓冲液1流经珠粒以洗涤。
    注意：洗涤缓冲液的使用量可超过5 mL；增加洗涤次数可能降低背景信号及珠子上的非特异性结合。
  9. 用5 mL洗涤缓冲液2重复洗涤步骤。
  10. 用5 mL洗涤缓冲液3重复洗涤步骤。
  11. 当最后一次洗涤缓冲液完全流经磁珠后，将层析柱从多通道支架上取下。加入 100 µL "裂解" 将溶液加入磁珠中，用移液器转移至1.7 mL低蛋白吸附的微量离心管中。短暂离心使磁珠沉降，随后小心移除50 µL上清液，避免扰动已沉降的磁珠。
    注意：本步骤及后续所有步骤中使用的试剂均来自市售的蛋白质组学样品制备试剂盒。该试剂盒提供经过优化且简化的样品制备流程。然而，这些步骤也可独立进行 试剂盒的，采用 Verma 等人所述的传统蛋白质组学工作流程9. 如果珠子仍粘附在柱子的侧壁或底部，让已转移至管中的珠子沉降，并使用额外的 "裂解" 将管中的溶液转移以回收剩余的珠子。
  12. 将试管置于65 °C的加热块/振荡器上，以1,000 rpm振荡10分钟。
    ​注意：此步骤是在消化前对半胱氨酸残基进行还原和烷基化的必要步骤。

3. 蛋白质消化

  1. 重悬干燥的胰蛋白酶（"消化" 试剂盒中的管子（于 -20 °C 保存），加入 210 µL 的 "重悬" 溶液。用移液器将溶液上下吹打数次，确保所有干燥的胰蛋白酶完全重悬。
  2. 孵育完成后，向珠子中加入50 µL重悬的胰蛋白酶溶液。将离心管置于37 °C孵育，以500 rpm振荡至少90分钟，以消化蛋白质。
  3. 消化完成后，将含有磁珠的溶液转移至离心柱中，并将离心柱插入一个1.7 mL低蛋白结合力的微量离心管中。离心（500 × g 室温（RT）下离心5分钟，以分离消化后的肽溶液与磁珠。
    注意：在此阶段，可对分离自肽段溶液的磁珠进行PNGase处理，以从链霉亲和素磁珠上洗脱生物素标记的肽段片段。该肽段样品可作为独立的次要样品，继续后续实验流程，并与磁珠上胰蛋白酶消化获得的主要样品进行分析和比较。由于PNGase方法能够基于质谱可检测的侧链修饰，特异性捕获N-糖基化天冬酰胺，因此该方法可能为磁珠上胰蛋白酶消化提供互补数据。12然而，这种逐级洗脱方法的缺点是每个样品分析需要两倍的质谱仪使用时间。
  4. 加入100 µL的 "停止" 用于终止消化反应并酸化肽溶液的溶液。

4. 肽段脱盐

  1. 使用管适配器，将脱盐柱置于一个 1.7 mL 低蛋白结合微离心管中。将全部酸化后的肽溶液加入柱中。离心（3,800 ×g，3 分钟），使溶液流经柱体。此时肽已结合在柱上；弃去穿流液。
  2. 向柱中加入 200 µL "洗涤液 1" 溶液，离心（3,800 ×g，3 分钟，室温）。弃去穿流液。
  3. 向柱中加入 200 µL "洗涤液 2" 溶液，离心（3,800 ×g，3 分钟，室温）。弃去穿流液。
  4. 将柱转移至一个新的、已标记的 1.7 mL 低蛋白结合微离心管中。向柱中加入 100 µL "洗脱液" 溶液，离心（3,800 ×g，3 分钟，室温）。再向柱中加入 100 µL "洗脱液" 溶液，离心（3,800 ×g，3 分钟，室温）。此时肽已从柱上洗脱进入管中。
  5. 将肽溶液置于真空离心浓缩仪中，过夜干燥。将干燥后的肽样品保存于 -80 °C，待定量后，进行质谱分析。

5. 肽的重悬与定量

  1. 将干燥的多肽重悬于 20 µL 溶剂 A（0.1% 甲酸，2% 乙腈）中。
  2. 将重悬后的多肽离心（17,200 ×g，10 分钟），以沉淀任何不溶性杂质。
  3. 为比色法多肽定量检测制备多肽标准品。
    1. 取 5 µL 浓度为 1,000 mg/mL 的多肽储备液，加入 96 孔板的一个孔中。
    2. 使用去离子水（DI 水）在孔板中进行七步连续稀释，每孔加入 5 µL 标准品，浓度依次为：1,000 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、125 mg/mL、62.5 mg/mL、31.25 mg/mL 和 15.625 mg/mL。另设一个孔加入 5 µL 去离子水作为空白对照。
  4. 在 96 孔板的三个独立孔中各加入 4 µL 去离子水，再向每孔加入 1 µL 重悬的多肽溶液，总体积为 5 µL。
    注意：在移取用于定量的多肽溶液时，应小心从溶液上层吸取，避免扰动已沉淀的杂质。
  5. 计算所需工作液的总量（每孔需 45 µL）。配制足量的比色法检测工作液，并涡旋混匀，确保各组分充分混合。
  6. 向每个标准品孔和样品孔中加入 45 µL 工作液。
    注意：标准品需设复孔，并使用多通道移液器加液，以尽量减少各孔间加液时间的差异。
  7. 用铝箔纸包裹孔板，于 37 °C 孵育 15 分钟。
  8. 在自动酶标仪上分析孔板。利用标准品测得的吸光度值绘制线性标准曲线，确定标准曲线方程及 R2 值。若 R2 值合理（≥0.95），则使用该标准曲线计算重悬多肽的浓度，并校正比色法孔板中发生的五倍稀释效应。

6. 消化肽段的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析

  1. 通过添加溶剂A将肽样品的浓度调整至0.2 µg/µL，并将10 µL转移至0.6 mL低蛋白结合管中。
  2. 将管子放入液相色谱自动进样器中。
  3. 根据图2和图3设置液相色谱和质谱/质谱参数。
  4. 将5 µL（1 µg）肽样品注入液相色谱-串联质谱系统进行分析。
    注意：此处显示的液相色谱-串联质谱设置仅用于示意图说明。根据可用的液相色谱和质谱仪器情况，用户可调整液相色谱梯度及质谱/质谱参数，以实现深度蛋白质组覆盖。本文中，质谱数据分析使用MaxQuant软件（https://www.maxquant.org/）完成，二级数据分析使用Perseus软件（https://maxquant.net/perseus/）完成， 通路分析使用https://reactome.org/完成。

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结果

在本实验中，我们通过使用生物素标记完整细胞的N-糖基化膜蛋白，并利用链霉亲和素磁珠从全细胞裂解液中富集这些标记蛋白，从而对肿瘤细胞系的细胞表面蛋白质组进行表征（图1）。随后，我们采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对富集的细胞表面蛋白进行蛋白质组学分析。与全细胞蛋白质组分析不同，本实验的目标仅限于表征细胞表面蛋白。因此，我们起始使用的样本量为3.5 × 107个AMO-1浆细胞瘤细胞。根据比色法多肽定量检测结果，获得的最终多肽浓度约为630 ng/µL，总产量约为12.6 µg多肽（溶于20 µL溶液中）（图2A）。随后，我们将1 µg多肽样本注入LC-MS/MS系统，并进行三次技术重复进样。所使用的液相色谱和质谱参数均基于前期实验优化确定（图2C和 图3A）。我们采用了长达4小时的液相梯度分离，以确保实现最大程度的蛋白覆...

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讨论

基于质谱的蛋白质组学是一种强大的工具，能够在前所未有的规模上对数千种未知蛋白质进行无偏倚的表征。该方法通过分析特定样本中存在的多种蛋白质，使我们能够鉴定并定量这些蛋白质，同时获得有关细胞和组织结构及信号传导能力的广泛信息。质谱技术不仅限于对样本中蛋白质的全局分析，还可用于表征这些蛋白质上的多种翻译后修饰（PTMs），从而更深入地揭示信号通路阶段和蛋白质动态变化，而这些信息在DNA或RNA水平的分析中是无法获得的1。在开发新型癌症治疗药物的过程中，基于质谱的蛋白质组学使我们能够比较恶性肿瘤细胞与健康组织的蛋白质谱，以识别潜在的可靶向治疗靶点。

癌症免疫治疗这一快速发展的领域依赖于恶性细胞表面表达的抗原来识别并选择性地摧毁肿瘤。由于缺乏仅存在于肿瘤组织而不存在于健康组织中的独特癌症特异性抗原，限制了新型癌症免疫疗法的开发，因此鉴定更多肿瘤细胞特异性的新抗原至关重要15。肿瘤特异性抗原不一定是肿瘤细胞独有的完整蛋白质，也可以是健康组织中不存在的特定蛋白质构象或翻译后修饰（PTMs）

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

感谢 Kamal Mandal 博士（加州大学旧金山分校实验室医学系）在建立 LC-MS/MS 运行方法方面的帮助，Deeptarup Biswas（印度理工学院孟买分校生物科学与生物工程系）在数据分析方面的帮助，以及 Audrey Reeves 博士（加州大学旧金山分校实验室医学系）在数据分析方面的协助。A.P.W. 实验室的相关工作由美国国立卫生研究院（NIH）R01 CA226851 项目和陈-扎克伯格生物中心（Chan Zuckerberg Biohub）提供资助。图 1 和 图 2B 使用 BioRender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂盒
96X iST 样品制备试剂盒PreOmicsP.O.00027蛋白质组学样品制备试剂盒。包含还原、烷基化和消化所需的试剂，以及脱盐柱和相关试剂。 
Pierce 定量比色肽检测试剂盒Thermo23275肽定量试剂盒。包含肽标准品及工作试剂的组分。 
试剂
乙腈FisherA955-1
碳酸氢铵Millipore Sigma09830-1KG
生物胞素酰肼Biotium90060
D-PBS（不含钙和镁盐）UCSF 细胞培养中心CCFAL003-225B01
甲酸Honeywell94318
Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂单次使用混合液Thermo1861280
高容量 Neutravidin 琼脂糖树脂Thermo29204
磷酸盐缓冲液UCSF 细胞培养中心CCFAL001-22J01
RIPA 裂解缓冲液，10 倍浓度Millipore Sigma20-188
氯化钠FisherBP358-212
偏高碘酸钠Alfa Aesar13798
台盼蓝染液（0.4%）Gibco15250-061
超纯 0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575-038
尿素（蛋白质组学级）VWRM123-1KG
设备
TC20 自动细胞计数仪Bio-Rad1450102
PrismR 微型离心机Labnet InternationalC2500-R-230V
超声破碎仪VWRBranson Sonifier 240
真空 manifold 装置PromegaPromega Vac-Man
振荡加热金属浴EppendorfEppendorf Thermomixer C
端对端旋转混合仪LabnetRevolver 可调旋转仪
液相色谱仪ThermoUltimate 3000 HPLC 和 UHPLC
Q Exactive Plus 混合四极杆 Orbitrap 质谱仪ThermoIQLAAEGAAPFALGMBDK
酶标仪BiotekBiotek Synergy 2 
真空浓缩仪Labconco7810010
耗材
1.5 mL 蛋白低吸附管Eppendorf22431081
1.7 mL 微量离心管
过滤柱Bio-Rad7326008
离心柱Thermo69725

参考文献

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