Method Article

探索脂肪组织功能

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

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文章讨论：

Cho， D. S.， Doles， J. D. 从小鼠附睾脂肪组织中制备脂肪祖细胞。可视化实验杂志。（162），doi：10.3791/61694 （2020）。

Peics， J. et al. 从小鼠腹腔内脂肪库分离成脂和纤维炎基质细胞亚群。可视化实验杂志。（162），doi：10.3791/61610 （2020）。

Estrada-Gutierrez， G. et al. 从人内脏脂肪组织中分离活的脂肪细胞和基质血管组分，适用于 RNA 分析和巨噬细胞表型分析。可视化实验杂志。（164），doi： 10.3791/61884 （2020）。

Gilleron， J. et al. 通过甲基水杨酸清除和 3D 成像探索脂肪组织结构。可视化实验杂志。（162），doi： 10.3791/61640 （2020）。

Czepielewski， RS et al. 肥胖期间的淋巴和血液网络分析。可视化实验杂志。（165），doi：10.3791/61814 （2020）。

Jager， J.， Gaudfrin， M.， Gilleron， J.， Cormont， M.， Tanti， J. F.一种脂肪细胞培养模型，用于研究蛋白质和 micro-RNA 调节对脂肪细胞功能的影响。可视化实验杂志。（171），doi：10.3791/61925 （2021）。

Poret， JM， Molina， PE， Simon， L. 恒河猴脂肪来源干细胞的分离、增殖和分化。可视化实验杂志。（171），doi：10.3791/61732 （2021）。

Batista Jr.， ML， Meshulam， T.， Desevin， K.， Rabhi， N.， Farmer， SR 三维脂肪细胞培养作为研究恶病质诱导的白色脂肪组织重塑的模型。可视化实验杂志。（167），doi： 10.3791/61853 （2021）。

Akbar， N.， Pinnick， KE， Paget， D.， Choudhury， RP 使用过滤和超速离心分离和表征人脂肪细胞衍生的细胞外囊泡。可视化实验杂志。（170），doi： 10.3791/61979 （2021）。

Discussion

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肥胖的特点是脂肪组织 （AT） 质量增加和 AT 免疫细胞促炎重塑，已成为全球主要公共卫生问题，因为它会显着增加患心血管疾病、2 型糖尿病和肝病的风险。因此，探索AT的结构和功能已成为一项重要的临床挑战。在这个方法集中，我们提出了几种最先进的方法，用于研究生理和病理条件下的 AT 结构和功能。

AT 是由多种细胞群组成的异质组织，包括成熟脂肪细胞、脂肪祖细胞 （APC）、纤维炎症祖细胞 （FIP）、内皮细胞和免疫细胞。因此，为了表征该组织，可以进行单细胞表型分析。在他们的文章中，Cho等人和Peics等人提供了通过荧光激活细胞分选（FACS）分离和表征小鼠白色AT驻留APC的方案1,2。这一步不仅在计算驻留APC的数量方面至关重要，这是确定AT扩增能力的重要因素，而且对于进一步探索这些细胞在单细胞水平上的功能也至关重要。Peics等人还提供了一种分离小鼠白色AT驻留FIPs 2的方法，这些FIPs是非脂肪生成胶原蛋白的细胞，可能有助于促炎表型的发展，已知在AT功能障碍中发挥作用。类似地，Estrada-Gutierrez等人描述了一种同时从人内脏AT活检中分离活的成熟脂肪细胞和基质血管部分细胞的方案3。总而言之，这些方案是从人和小鼠AT中生成单细胞悬液的金标准，这是进一步计数和功能表型不同AT细胞亚群的第一个关键步骤。

结构和功能之间的关系在 AT 中高度相关。肥胖期间 AT 功能障碍的一个标志与脂肪细胞大小的增加和 AT 的深刻重塑有关。这种重塑不仅影响脂肪细胞和免疫细胞群，还影响淋巴管和血管网络。为了了解整个AT的这些变化，Gilleron等人开发了一种非常简单，廉价且快速的AT清除方案4。这种简单的方案三维可视化了全小鼠AT和大型人AT活检的形态。这包括神经元和血管网络、脂肪细胞以及先天和适应性免疫细胞分布，这些都是研究肥胖及其相关病理的重要参数。为了表征肥胖对AT淋巴和血管的影响，Czepielewski等人提供了一种 体内 方法，通过注射荧光染料偶联凝集素5同时对淋巴树丛和血管进行染色。该协议提供了一种分析两个网络的 体内 形态的方法，包括它们的密度、体积和分支。有趣的是，将这种标记策略与AT清除程序4 相结合，可以在三维（3D）5中对整个小鼠AT进行高分辨率映射。总之，这些方法可以表征 AT 在生理和病理生理条件下的结构，深入了解 AT 结构与功能之间的相关性。

由于其高度的异质性和巨大的重塑能力，在 体内 分析AT内脂肪细胞的功能并不简单，因此已经开发了几种培养系统。所有这些细胞培养系统的主要优点是对细胞群和微环境的高度控制。Jager等人开发了一种简单的方案来纵3T3-L1分化成熟脂肪细胞中的RNA表达6。尽管该培养系统远非理想的生理条件，但 3T3-L1 脂肪细胞在胰岛素信号传导、葡萄糖摄取、脂肪生成和脂肪分解方面仍然具有功能。因此，该协议提供了一个强大的工具来纵蛋白质和非编码RNA表达并研究它们对脂肪细胞功能的作用。为了更接近理想的生理条件，Poret等人描述了一种使用从恒河猴AT7中获得的脂肪来源干细胞（ADSC）生成功能性成熟脂肪细胞的方法。该协议解释了如何分离原代ADSC以及如何诱导它们的增殖和分化。作者进一步建议，该程序可以适用于其他物种。尽管与3T3-L1细胞系相比，该培养系统更接近理想的生理条件，但源自原代ADSC的成熟脂肪细胞在二维中生长，这与 体内不同。为了解决这个问题，Batista Jr.等人为三维打印组织培养系统提供了一种有效的方案8。在这项工作中，作者从小鼠基质血管部分细胞中生成脂肪体，并直接在该 3D 培养系统中分化脂肪细胞前体。这种方法比 2D 培养方法不可逆转地更接近理想的生理条件，但应考虑缺乏可能将营养物质带到球体中心的脂肪细胞的血管。如所述6，在这些培养系统中调节蛋白质和非编码 RNA 表达可能会导致进一步了解这些靶标在更具生理相关性的脂肪细胞中的功能作用。然而，这样一个复杂的系统仍有待建立。这些 离体/体外 培养系统的主要兴趣是对微环境的高度控制，其中还包括细胞分泌的因子。在这方面，Akbar等人的方案分离并表征了人脂肪细胞分泌的细胞外囊泡（EV）9。最近，EV被发现是重要的代谢调节剂;该方法对于分析这些脂肪细胞衍生的EV在不同代谢情况下的代谢影响是强制性的。

在本方法集中，我们概述了涵盖AT分析的几个方面的最先进的方案，包括离 体 和 体外 培养系统，3D全组织探索和单细胞分析。尽管没有一个培养系统是完美的，但选择适合生物学问题的培养系统很重要。因此，该方法集合提供了一个大型程序工具箱，用于 在体外分离、区分和作脂肪细胞。结合这里描述的所有不同方法将导致对 AT 的形态和功能的深入了解。

Disclosures

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作者没有什么可透露的

Acknowledgements

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作者感谢 Jean-Francois Tanti 和 Mireille Cormont 的科学支持和投入。这项工作得到了 INSERM、蔚蓝海岸大学的支持，以及法国国家研究署 （ANR） 通过未来投资 Labex SIGNALIFE （ANR-11-LABX-0028-01）、UCA JEDI 计划 （ANR-15-IDEX-01） 和 JG 的青年研究员计划 （ANR18-CE14-0035-01-GILLERON） 和 JJ （ANR-20-CE14-0010-01）。

References

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  1. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

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