文章讨论：
Aishwarya， R. et al. 使用量子点介导的免疫标记，然后进行透射电子显微镜检查，可视化蛋白质在心脏中的亚细胞定位。可视化实验杂志。（187），e64085 （2022）。
Liu， B. et al. 用线粒体和溶酶体的荧光染料可视化线粒体自噬。可视化实验杂志。（189），e64647 （2022）。
Liu， C. Y.， Zhu， J.， Xie， Z. 用荧光蛋白标记物可视化酵母细胞器。可视化实验杂志。（182），e63846 （2022）。
Zhao， X.， Guo， S. 追踪斑马鱼放射状胶质细胞祖细胞不对称分裂过程中 Notch/Delta 内吞作用的抗体摄取测定。可视化实验杂志。65030 （2022 年）。
Park， S.， Zhuang， Y.， Shi， X. 标记保留扩展显微镜 （LR-ExM） 可实现超分辨率成像和高效标记。可视化实验杂志。（188），e63793 （2022）。
地球上所有多细胞生物，包括动物和植物，都是在~17亿年前从单细胞真核生物进化而来的1.与原始原核生物不同，真核细胞的细胞质内有一个膜结合的细胞核和许多膜封闭的细胞器，包括线粒体、高尔基体、内质网（ER）、溶酶体和囊泡。这些细胞器形成区室，其中专门的生物功能和高效的代谢活动被定位。由于光学显微镜的分辨率有限，大多数细胞内细胞器包含落在光衍射极限范围内的功能结构，使其可视化具有挑战性2。创新的显微和生物标记技术开始实现超精细结构和细胞器 体内动力学 的高分辨率可视化。该集合汇集了最近成功标记和成像不同物种不同细胞器的方法，从而进一步加深了我们对细胞器生物学时空调控的理解。
近几十年来，荧光传感器的发展和活细胞中蛋白质的标记极大地促进了我们对细胞内网络、信号转导和细胞间相互作用的动力学的理解。通过使用先进的无机合成方法，具有纳米级尺寸的荧光半导体纳米晶体（也称为量子点或量子点）已被发明为一类新型光学报告基因。通常，量子点颗粒的尺寸在2-10 nm以内，对细胞具有高光敏性、稳定性和低细胞毒性。量子点颗粒已成为有机染料和荧光蛋白的替代品，用于以高分辨率对细胞内过程进行成像。在Aishwarya等人的方案中，作者描述了QD介导的免疫标记，然后用透射电子显微镜（TEM）3进行成像。通过在TEM下以超分辨率进行抗体靶向QD标记和成像，作者成功地可视化了Sigmar1在成年小鼠心脏细胞中多个细胞器上的定位，并强调了其在溶酶体和线粒体膜上的富集。除了强调QD-TEM的高分辨率和高灵敏度外，作者还提到了该方法的几个缺点。例如，量子期介导的免疫标记中使用的四氧化锇会不可逆地破坏标本的特性，而固定和抗原揭蔽步骤的优化是确保高质量图像的关键但具有挑战性的因素。
除了量子点之外，许多其他不同的染料已成功应用于标记活细胞中的细胞器。这些方法促进了 体内细胞器转化或易位过程的实时成像。有时，使用多种细胞器特异性染料同时可视化不同类型的细胞器。在Liu，Li等人4的方案中，作者提供了详细的方案，用于使用两种不同的染料对小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）细胞中的线粒体和溶酶体进行活染色和成像：MitoTracker Green和LysoTracker Red4。在这项研究中，两种染料分别显示出线粒体和溶酶体特异性的高荧光灵敏度和稳定性。此外，作者使用该方案成功观察并记录了羰基氰化物-4（三氟甲氧基）苯肼（FCCP）在MEF细胞中诱导的线粒体自噬的关键 体内细胞过程 。在讨论中，作者提到，通过优化染料浓度和染色时间，该方案可以应用于不同的细胞系或来自组织的细胞。
通过利用由与荧光标签融合的细胞器特异性蛋白质组成的报告基因构建体，人们可以在没有免疫标记的情况下观察体内细胞器的动力学和表达模式。在Liu，Zhu等人5的方案中，作者提供了一个详细的方案，用于对活芽酵母酿酒酵母5中大多数类型的亚细胞器进行成像。对于使用出芽酵母的初学者来说，该协议有助于学习如何使用延时成像识别蛋白质亚细胞定位和跟踪感兴趣的细胞器。该协议的一个局限性是该协议中使用的大多数构建体不能用于标记其他物种中的细胞器。对于不同类型的真核细胞，荧光蛋白的细胞器特异性模式仍需要通过抗体免疫染色来验证。
首先开发了一种抗体摄取测定，用于对果 蝇 6 的感觉器官前体中的内体 Notch/Delta 信号传导进行特异性活标记。由于 Notch/Delta 信号传导的剂量敏感性，在细胞内表达报告基因构建体不适合在 体内可视化 Notch/Delta 信号传导，因为报告基因融合基因的额外拷贝会中断正常信号传导，进而中断细胞命运。在 Zhao 和 Guo7 的方案中，作者应用抗体摄取测定对发育中的斑马鱼大脑7 的径向神经胶质细胞祖细胞中的 Notch/Delta 内体运输进行成像。在方案中，将抗DeltaD-Atto647N偶联抗体精确注射到24 hpf（受精后小时）胚胎后脑室后，使用内化的抗DeltaD-Atto647N抗体记录内体运输的整个过程整个放射状神经胶质细胞祖细胞的有丝分裂。在研究中发现，抗体摄取测定不会干扰 Notch/Delta 信号传导。该协议可用于可视化其他膜配体受体信号传导，前提是目标蛋白质的细胞外结构域的抗体可用。
膨胀显微镜 （ExM） 的最新发展涉及在可溶胀水凝胶内物理膨胀样品，使传统的共聚焦显微镜能够用于超分辨率成像。自发明以来，ExM已经用许多不同类型的生物样品进行了测试8。ExM 的一个主要挑战是聚合和消解步骤中的荧光信号损失。最近开发的标签保留ExM解决了三功能锚9的问题。在Park等人10的协议中，作者描述了如何使用一组三功能锚点10执行标记保留ExM（LR-ExM）。该协议不仅通过防止信号丢失，还通过促进使用 SNAP 或 CLIP 标签进行高效标记来改进扩展显微镜成像。在他们的研究中，作者成功地展示了用于各种亚细胞结构的多色LR-ExM，并在将LR-ExM与超分辨率随机光学重建显微镜（STORM）相结合时实现了单分子分辨率。
随着超分辨率显微镜的快速发展和新型荧光标记技术的出现，我们可以预期以前所未有的分辨率可视化细胞内细胞器的方法和方案将进一步改进。这些努力有望在理解细胞内细胞器的动力学和功能方面带来新的突破。
作者没有什么可透露的。
该项目得到了美国国立卫生研究院 （NIH） 的支持，资助编号为 R01NS120218、加州大学旧金山分校 Mary Anne Koda-Kimble 创新种子奖和 Chan Zuckerberg 生物中心。
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