采集大鼠自主行为数据以表征卒中后功能缺损

摘要

本文介绍了一种用于在社会性群体笼养环境中采集个体自主发起行为实验数据的系统。通过使用自动化精细抓取评估方法，验证了该系统的有效性，可实现对中风后运动功能障碍、与动机相关的潜在行为改变、昼夜节律变化以及其他创新性依赖变量的表征。

摘要

大鼠模型的行为测试常用于心理学、生物医学和行为学研究等多种目的。许多传统方法涉及研究人员与实验中每只动物之间的一对一单独测试。这种设置对研究人员而言可能非常耗时，且研究人员的存在可能以非预期的方式影响行为数据。此外，传统的大鼠饲养笼缺乏该物种通常所需的环境丰富性、运动和社交机会，这种环境背景也可能扭曲行为数据的结果。克服这些局限性对于包括获得性脑损伤研究在内的多项科研应用具有重要意义。本文介绍了一种在无需人员在场的情况下，于群体饲养笼中自动训练和测试个体大鼠行为的示例方法。可通过射频识别技术（RFID）针对个体大鼠定制测试会话。该系统的验证是在测量卒中前后前肢精细运动功能的示例背景下进行的。系统测量了卒中后行为障碍的传统特征以及新型指标，包括成功率、拉力的多个方面、行为片段分析、启动频率与模式、会话持续时间以及昼夜节律模式。这些变量可实现近乎全自动的采集，限制较少；尽管该装置无法控制暴露时间、测试时机和练习频率等实验条件，但验证结果显示个体间这些变量具有一致性。

引言

在从认知过程研究到疾病状态探索等众多研究领域中，利用大鼠模型进行行为学训练和测试至关重要¹。通常，这类训练和测试以单只动物为对象，在一对一的实验环节中进行，研究人员需手动将动物从其居住笼中取出，并暂时安置于某种实验装置中。然而，这种方法存在若干困难和局限性。首先，行为学测试对研究人员而言耗时极长，若需进行训练，则所需时间更甚。其次，已有研究证实，该方法会自动影响——甚至可能干扰——所获取的数据²。当涉及与环境丰富化相关的变量时，这些干扰尤为显著。具体而言，实验大鼠传统上被饲养在仅够容纳一至两只大鼠的小型笼具中³，若未提供跑轮，它们可能终生缺乏有意义的运动机会。此外，对于大鼠这类社会性物种而言，单独饲养可能成为重要的应激源⁴。这些与福利相关的问题很可能影响大鼠的生理状态^5,6，进而阻碍典型物种行为的正常发展⁴，并影响啮齿类动物模型在人类相关研究中的质量。

近年来，研究人员已针对这些问题提出了多种解决方案。最简单的解决方案是实现行为测试和训练的自动化^7,8,9,10，从而无需单个研究人员专门照看单个动物。另一种解决方案是实现动物向实验舱的自动转移^11,12，进一步减少对人工干预的需求。最后，已有若干实验装置被探索用于使动物在群体饲养笼中与其他动物共同生活，并拥有更多空间进行探索和环境丰富化¹³。尽管具有这些优势，此类群体饲养装置可能会限制或增加获取个体差异化行为数据的难度（尽管已有尝试利用计算机视觉技术解决该问题）^14,15。如果需要获取个体行为数据，在行为实验阶段识别并取出群体饲养中的特定动物也可能更加困难或复杂。目前，能够从（丰富化）群体饲养环境中采集个体行为数据的系统仍然很少^16,17,18。

这些缺点可能特别影响获得性脑损伤行为效应的研究。首先，显而易见的是，人类实验人员的存在与否及其性别，以及操作方式，均会影响啮齿类动物的行为^2,19，这些变量可能在大鼠行为表现之前产生不同的影响 与卒中后，人类卒中后的功能行为结局可能因患者主动减少参与推荐剂量的康复训练而恶化。²⁰目前，啮齿类动物实验往往无法模拟此类情境，因为大鼠无法自由选择参与或回避行为实验环节。

本文介绍了一种在丰富化群体饲养笼系统框架内进行个体动物行为测试的实验方案。该方法不仅克服了当前实验实践中的局限性，还为探索创新性测量指标提供了可能。研究开发了一种单鼠转门装置（one-rat turnstile, ORT），可安装于群体饲养笼上，使动物能够自主进入行为测试舱，并自行启动训练和测试流程。该系统成本低廉，每个ORT装置均可通过3D打印机以较低成本组装完成。此前，该系统已在基础操作箱中完成验证，结果表明，在无需实验人员在场的情况下，动物能够被稳定地训练以执行简单的操作式杠杆按压任务¹⁶。然而，该配置是否适用于其他实验场景的问题尚未解决。本研究旨在验证此前建立的ORT-群体饲养笼组合系统在训练和量化与中风后运动功能障碍相关的熟练抓取行为方面的有效性。该配置被用于生成中风研究中通常未被探索的新变量，包括熟练抓取任务的表现指标以及自主启动行为的测量指标，后者可能与动机和决策过程相关。此外，该系统能够有效检测中风后动物在24小时全周期内每日自主启动行为的昼夜节律变化。

方案

所有实验程序和动物护理均经北德克萨斯大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。本研究所用的成年雄性和雌性Long-Evans大鼠（400–800 g，1.5岁）均饲养于群养笼具中。

1. 仪器设备准备

1. 根据设计文件和组装说明获取或组装单鼠转门装置（ORT）（参见 补充文件 1 和 补充编码文件 1）。参见 Butcher 等。¹⁶ 如需更多详细信息。
   注意：操作限制装置（ORT）的尺寸需与大鼠体型相匹配，因此同一饲养笼内的动物体型应大致相近。若不希望自行组装ORT，也可购买预组装成品（参见 材料表).
2. 获取并安装射频识别（RFID，参见 材料表读取器并获取动物，注射RFID标签。
   注意：注射射频识别全双工（FDX）标签时，当大鼠穿过操作反应箱（ORT）时，标签的朝向必须与射频识别天线呈垂直方向。在本项验证中，标签被皮下植入肩胛骨之间，且位于与脊柱平行的平面上。
3. 将射频识别（RFID）天线固定到操作反应测试仪（ORT）的管子上。
4. 构建或获取适合实验问题的行为装置和群体饲养笼具。在此示例中，使用定制的群体饲养笼具^21,22 与市售的操作性条件反射箱联合使用（参见 材料表），尽管理论上可以使用任何设备。
   注意：群养动物对行为实验装置的使用存在竞争 通过 应考虑使用ORT。预计每4至6只动物需要一个ORT加行为学装置。
5. 将操作式条件反射箱（ORT）连接在行为实验装置与动物群养笼具之间。
6. 使用Dremel旋转工具在行为实验装置和群体饲养笼上切割出通道孔（参见 材料表）或类似仪器，其内径应等于所构建的ORT隧道的外径。
   ​注意：操作时 ORT 需抬高几英寸，因此需要一个小平台或支架来调节群养笼具与设备的高度对齐。
7. 安装射频识别系统，以读取动物穿过目标识别测试装置时的信息，并可根据需要将其与行为学设备整合。

2. 术前行为学训练

1. 获取相同大小的同窝大鼠，并将其引入群养笼具中。
   注意：长期在隔离条件下饲养或与同种个体接触较少的动物在探索实验箱时可能会遇到更多困难，尤其是在需要穿越群养笼具社交区域的情况下。为避免这一问题，动物应在生命早期即接触群养环境。
2. 移除行为装置内所有可操作物体的接触权限，并将实验舱设置为在占用期间平均每60秒自动递送一次奖励。
   注意：本研究使用蔗糖水（30% 至 40%）作为奖励，但甜炼乳同样有效。
3. 训练所有大鼠定期进入行为实验装置 通过 ORT
4. 每天至少检查一次数据，以确保所有动物均进入操作反应箱（ORT）。若发现动物未进入，可将一支笔状物体插入锁定装置，暂时防止其锁闭，以便动物更自由地探索。如果动物仍然不进入，则移除旋转门，并安装临时侧壁，以允许动物自由通过隧道进入舱室。
5. 当所有动物均能规律进入腔室后，重新安装门锁（及旋转门），并重新评估。
   注意：动物也可能将ORT和实验舱作为暂时躲避其他大鼠的场所。为防止此类对实验舱的独占行为，可连接一个额外的ORT，将其与一个简单的隔离舱相连。
6. 引入操纵装置——在此示例中为拉柄——并将其灵敏度设为最高。将手柄插入箱内（不超过2 cm）或置于箱外紧邻处。
   注意：若将美纹纸胶带贴在把手背面且处于够不到的位置，可诱发抓取尝试。
7. 降低自动递送奖励（即30%蔗糖水）的频率（例如每90-120秒一次）。请注意，可根据实验人员需求及动物偏好选择任何适宜的奖励物。
8. 每天检查数据，确保所有动物均已学会激活杠杆。通过引诱杠杆和/或调整插入深度，直至所有动物均能进行按压操作。
9. 停止自动递送奖励，使其仅在特定条件下可用 通过 拉手的激活
10. 若先前已插入杠杆，则每天需将其回撤一次（前提是所有大鼠均继续存活） 将拉杆向外拉动0.25 mm至0.5 mm，直至其到达最终位置，即位于腔室外1 cm至1.25 cm处。
    注意：杠杆的具体位置取决于大鼠的体型。应选择一个能够产生理想抓取轨迹的位置。
11. 启动一个百分位训练方案或其他训练程序，以逐步增加激活手柄所需的拉力。
    注意：本研究采用基于百分位数的强化程序，将强化标准设定为此前15次反应的上四分位数。或者，也可采用逐步增加拉力标准的方法。⁷.
12. 当动物能够稳定达到120 g拉力的最终标准范围时，移除百分位训练程序，并将手柄激活的标准固定在120 g的恒定值。
13. 在达到该力值要求后收集基线数据，直至成功率稳定（无趋势变化）约一周时间。

3. 诱导脑卒中

1. 同时对所有群体饲养的动物进行手术以诱导脑卒中。
   注意：本实验采用内皮素-1（endothelian-1）脑卒中模型来诱导脑卒中，该方法已在其他文献中描述²³。
2. 将动物置于传统饲养笼中单独隔离，恢复 3–7 天。

4. 术后行为学测试

1. 恢复后，将动物放回饲养笼中，并连接ORT装置的熟练抓取设备。
2. 进行行为学测试，保持拉力要求为最终的120 g（遵循步骤2），直至收集到足够的数据以评估卒中后的功能缺陷（持续数天，从一天到数天不等）。
3. 在动物进入测试舱的后续几天内，实施任何与卒中后或恢复相关的自变量干预。

结果

动物在两个独立的群养笼中进行训练和测试，其中一个笼子饲养四只雌性大鼠，另一个笼子饲养四只雄性大鼠。所有大鼠均在四天或更短时间内学会通过ORTs。四只雌性大鼠达到 >在约6周的训练后，85%的试验达到120 g力度要求，而雄性大鼠则在10周内达到相同标准（相比之下，经过标准训练的剥夺型大鼠约需3周）⁷训练时长在第2至第6周期间因多种软硬件故障而显著延长，期间需持续进行故障排查。在解决这些问题后，训练得以顺利进行，预计后续的训练周期将与现有文献报道的时间相当。⁷雄性大鼠的训练时间也更长，以提供更多机会让其中一只雄性大鼠开始拉绳；然而，该大鼠始终未开始拉绳行为，因此在第7周后被排除于进一步的分析和手术之外。当大鼠的行为表现趋于稳定后，每只笼子均采集了5天的卒中前基线数据。数据仅限于OR设备全天保持连接至笼具的日子（部分日期因饲养相关操作需短暂断开连接而不计入）。雌性大鼠笼具的基线数据采集于卒中前第7、8、9、10和12天；雄性大鼠的基线数据采集于卒中前第8、9、10、11和13天。

在进...

讨论

本方案具有多种用途。首先，也是最广泛的应用，操作式反应箱（ORT）的开发旨在实现社会性、丰富化饲养环境下对单个受试动物的自动化行为训练与数据采集。尽管本研究旨在验证在脑卒中背景下收集典型行为指标并对其进行拓展分析的可行性，但该系统同样适用于其他应用场景和行为任务。甚至本验证研究中采集的指标也可根据需要进行调整，以纳入替代性强化程序、替代性行为等。其次，本研究评估了该系统在采集脑卒中后精细抓取能力受损相关数据方面的性能。此前已有研究验证了当前方案在教学和测量基本杠杆按压行为方面的有效性¹⁶。现有数据表明，该方法是采集脑卒中相关运动功能缺陷数据的有效手段，既可获取传统精细抓取评估中的典型指标，也可获得新型指标。在对群养笼位操作式反应箱系统进行调试过程中，一个关键问题是动物是否会以足够高的频率自主启动行为实验，以及它们在不同实验条件下（尤其是在脑卒中后）是否仍能维持这一行为。研究发现，所有或几乎所有的动物均可被充分激励，积极参与简单操作式行为程序，目前也已成功应用于脑卒中后的行为测试。脑卒中后阶段虽需一定程度的人工行为塑造，但动物能迅速恢复自主参与行为任务，且无需实验人员在场。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D 打印机			咨询当地创客空间
螺栓	Boltdepot	1346	6-32 或 8-32，长度 0.5"
螺栓	Boltdepot	1348	6-32 或 8-32，长度 0.75"
门铰链	XJS (Amazon)	43398-16234	1" 柜用不锈钢门铰链套装；可选（若未打印“完美铰链”""）
电钻			任何电动电钻均可使用
拉伸弹簧	Nieko (Amazon)	50456A	根据 ORT 尺寸和所需张力选择并调整弹簧
颗粒糖
锁紧螺母	Boltdepot	2551	6-32 或 8-32
卷尺
微控制器	Arduino	A000066	Arduino Uno
微动开关	Sparkfun	KW4-Z5F	微型微动开关（SPDT-滚轮杠杆型）
单鼠转门（ORT）	Vulintus		如不自行组装，请联系该公司获取报价
用于行为评估的任选操作箱：本实验使用 Vulintus 提供的自动等长拉力操作箱	Vulintus	无货号：请联系 Vulintus	请联系 Vulintus 获取报价
PLA 耗材丝	OVERTURE (Amazon)	UK-MATTEPLA17511
有机玻璃	Lesnlok (Amazon)	B09P74K7BR	透明，厚度 1/8"，按需裁切
有机玻璃切割刀
Python 程序	Python 软件基金会		软件可应要求提供
RFID 读取器	Priority 1 Design	RFIDRW-E-USB	带天线
RFID 标签	Unified Information Devices	UC-1485-10
杆	Boltdepot	23632	裁切至长度> 3.5"
旋转工具			用于在装置和群体饲养笼中钻孔以安装 ORT；任何可用的五金工具均可
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套筒扳手组			任何套筒扳手组均可使用
电烙铁
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