本文介绍了一种用于在社会性群体笼养环境中采集个体自主发起行为实验数据的系统。通过使用自动化精细抓取评估方法，验证了该系统的有效性，可实现对中风后运动功能障碍、与动机相关的潜在行为改变、昼夜节律变化以及其他创新性依赖变量的表征。
本文内容
摘要
摘要
大鼠模型的行为测试常用于心理学、生物医学和行为学研究等多种目的。许多传统方法涉及研究人员与实验中每只动物之间的一对一单独测试。这种设置对研究人员而言可能非常耗时，且研究人员的存在可能以非预期的方式影响行为数据。此外，传统的大鼠饲养笼缺乏该物种通常所需的环境丰富性、运动和社交机会，这种环境背景也可能扭曲行为数据的结果。克服这些局限性对于包括获得性脑损伤研究在内的多项科研应用具有重要意义。本文介绍了一种在无需人员在场的情况下，于群体饲养笼中自动训练和测试个体大鼠行为的示例方法。可通过射频识别技术（RFID）针对个体大鼠定制测试会话。该系统的验证是在测量卒中前后前肢精细运动功能的示例背景下进行的。系统测量了卒中后行为障碍的传统特征以及新型指标，包括成功率、拉力的多个方面、行为片段分析、启动频率与模式、会话持续时间以及昼夜节律模式。这些变量可实现近乎全自动的采集，限制较少；尽管该装置无法控制暴露时间、测试时机和练习频率等实验条件，但验证结果显示个体间这些变量具有一致性。
引言
在从认知过程研究到疾病状态探索等众多研究领域中，利用大鼠模型进行行为学训练和测试至关重要1。通常，这类训练和测试以单只动物为对象，在一对一的实验环节中进行，研究人员需手动将动物从其居住笼中取出，并暂时安置于某种实验装置中。然而，这种方法存在若干困难和局限性。首先，行为学测试对研究人员而言耗时极长，若需进行训练，则所需时间更甚。其次，已有研究证实，该方法会自动影响——甚至可能干扰——所获取的数据2。当涉及与环境丰富化相关的变量时，这些干扰尤为显著。具体而言，实验大鼠传统上被饲养在仅够容纳一至两只大鼠的小型笼具中3，若未提供跑轮，它们可能终生缺乏有意义的运动机会。此外，对于大鼠这类社会性物种而言，单独饲养可能成为重要的应激源4。这些与福利相关的问题很可能影响大鼠的生理状态5,6，进而阻碍典型物种行为的正常发展4，并影响啮齿类动物模型在人类相关研究中的质量。
近年来，研究人员已针对这些问题提出了多种解决方案。最简单的解决方案是实现行为测试和训练的自动化7,8,9,10，从而无需单个研究人员专门照看单个动物。另一种解决方案是实现动物向实验舱的自动转移11,12，进一步减少对人工干预的需求。最后，已有若干实验装置被探索用于使动物在群体饲养笼中与其他动物共同生活，并拥有更多空间进行探索和环境丰富化13。尽管具有这些优势，此类群体饲养装置可能会限制或增加获取个体差异化行为数据的难度（尽管已有尝试利用计算机视觉技术解决该问题）14,15。如果需要获取个体行为数据，在行为实验阶段识别并取出群体饲养中的特定动物也可能更加困难或复杂。目前，能够从（丰富化）群体饲养环境中采集个体行为数据的系统仍然很少16,17,18。
这些缺点可能特别影响获得性脑损伤行为效应的研究。首先，显而易见的是，人类实验人员的存在与否及其性别，以及操作方式，均会影响啮齿类动物的行为2,19，这些变量可能在大鼠行为表现之前产生不同的影响 与卒中后，人类卒中后的功能行为结局可能因患者主动减少参与推荐剂量的康复训练而恶化。20目前，啮齿类动物实验往往无法模拟此类情境，因为大鼠无法自由选择参与或回避行为实验环节。
本文介绍了一种在丰富化群体饲养笼系统框架内进行个体动物行为测试的实验方案。该方法不仅克服了当前实验实践中的局限性，还为探索创新性测量指标提供了可能。研究开发了一种单鼠转门装置（one-rat turnstile, ORT），可安装于群体饲养笼上，使动物能够自主进入行为测试舱，并自行启动训练和测试流程。该系统成本低廉，每个ORT装置均可通过3D打印机以较低成本组装完成。此前，该系统已在基础操作箱中完成验证，结果表明，在无需实验人员在场的情况下，动物能够被稳定地训练以执行简单的操作式杠杆按压任务16。然而，该配置是否适用于其他实验场景的问题尚未解决。本研究旨在验证此前建立的ORT-群体饲养笼组合系统在训练和量化与中风后运动功能障碍相关的熟练抓取行为方面的有效性。该配置被用于生成中风研究中通常未被探索的新变量，包括熟练抓取任务的表现指标以及自主启动行为的测量指标，后者可能与动机和决策过程相关。此外，该系统能够有效检测中风后动物在24小时全周期内每日自主启动行为的昼夜节律变化。
方案
所有实验程序和动物护理均经北德克萨斯大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。本研究所用的成年雄性和雌性Long-Evans大鼠（400–800 g，1.5岁）均饲养于群养笼具中。
1. 仪器设备准备
- 根据设计文件和组装说明获取或组装单鼠转门装置（ORT）（参见 补充文件 1 和 补充编码文件 1）。参见 Butcher 等。16 如需更多详细信息。
注意：操作限制装置（ORT）的尺寸需与大鼠体型相匹配，因此同一饲养笼内的动物体型应大致相近。若不希望自行组装ORT，也可购买预组装成品（参见 材料表). - 获取并安装射频识别（RFID，参见 材料表读取器并获取动物，注射RFID标签。
注意：注射射频识别全双工（FDX）标签时，当大鼠穿过操作反应箱（ORT）时，标签的朝向必须与射频识别天线呈垂直方向。在本项验证中，标签被皮下植入肩胛骨之间，且位于与脊柱平行的平面上。 - 将射频识别（RFID）天线固定到操作反应测试仪（ORT）的管子上。
- 构建或获取适合实验问题的行为装置和群体饲养笼具。在此示例中，使用定制的群体饲养笼具21,22 与市售的操作性条件反射箱联合使用（参见 材料表），尽管理论上可以使用任何设备。
注意：群养动物对行为实验装置的使用存在竞争 通过 应考虑使用ORT。预计每4至6只动物需要一个ORT加行为学装置。 - 将操作式条件反射箱（ORT）连接在行为实验装置与动物群养笼具之间。
- 使用Dremel旋转工具在行为实验装置和群体饲养笼上切割出通道孔（参见 材料表）或类似仪器，其内径应等于所构建的ORT隧道的外径。
注意：操作时 ORT 需抬高几英寸，因此需要一个小平台或支架来调节群养笼具与设备的高度对齐。 - 安装射频识别系统，以读取动物穿过目标识别测试装置时的信息，并可根据需要将其与行为学设备整合。
2. 术前行为学训练
- 获取相同大小的同窝大鼠，并将其引入群养笼具中。
注意：长期在隔离条件下饲养或与同种个体接触较少的动物在探索实验箱时可能会遇到更多困难，尤其是在需要穿越群养笼具社交区域的情况下。为避免这一问题，动物应在生命早期即接触群养环境。 - 移除行为装置内所有可操作物体的接触权限，并将实验舱设置为在占用期间平均每60秒自动递送一次奖励。
注意：本研究使用蔗糖水（30% 至 40%）作为奖励，但甜炼乳同样有效。 - 训练所有大鼠定期进入行为实验装置 通过 ORT
- 每天至少检查一次数据，以确保所有动物均进入操作反应箱（ORT）。若发现动物未进入，可将一支笔状物体插入锁定装置，暂时防止其锁闭，以便动物更自由地探索。如果动物仍然不进入，则移除旋转门，并安装临时侧壁，以允许动物自由通过隧道进入舱室。
- 当所有动物均能规律进入腔室后，重新安装门锁（及旋转门），并重新评估。
注意：动物也可能将ORT和实验舱作为暂时躲避其他大鼠的场所。为防止此类对实验舱的独占行为，可连接一个额外的ORT，将其与一个简单的隔离舱相连。 - 引入操纵装置——在此示例中为拉柄——并将其灵敏度设为最高。将手柄插入箱内（不超过2 cm）或置于箱外紧邻处。
注意：若将美纹纸胶带贴在把手背面且处于够不到的位置，可诱发抓取尝试。 - 降低自动递送奖励（即30%蔗糖水）的频率（例如每90-120秒一次）。请注意，可根据实验人员需求及动物偏好选择任何适宜的奖励物。
- 每天检查数据，确保所有动物均已学会激活杠杆。通过引诱杠杆和/或调整插入深度，直至所有动物均能进行按压操作。
- 停止自动递送奖励，使其仅在特定条件下可用 通过 拉手的激活
- 若先前已插入杠杆，则每天需将其回撤一次（前提是所有大鼠均继续存活） 将拉杆向外拉动0.25 mm至0.5 mm，直至其到达最终位置，即位于腔室外1 cm至1.25 cm处。
注意：杠杆的具体位置取决于大鼠的体型。应选择一个能够产生理想抓取轨迹的位置。 - 启动一个百分位训练方案或其他训练程序，以逐步增加激活手柄所需的拉力。
注意：本研究采用基于百分位数的强化程序，将强化标准设定为此前15次反应的上四分位数。或者，也可采用逐步增加拉力标准的方法。7. - 当动物能够稳定达到120 g拉力的最终标准范围时，移除百分位训练程序，并将手柄激活的标准固定在120 g的恒定值。
- 在达到该力值要求后收集基线数据，直至成功率稳定（无趋势变化）约一周时间。
3. 诱导脑卒中
- 同时对所有群体饲养的动物进行手术以诱导脑卒中。
注意：本实验采用内皮素-1（endothelian-1）脑卒中模型来诱导脑卒中，该方法已在其他文献中描述23。 - 将动物置于传统饲养笼中单独隔离，恢复 3–7 天。
4. 术后行为学测试
- 恢复后，将动物放回饲养笼中，并连接ORT装置的熟练抓取设备。
- 进行行为学测试，保持拉力要求为最终的120 g（遵循步骤2），直至收集到足够的数据以评估卒中后的功能缺陷（持续数天，从一天到数天不等）。
- 在动物进入测试舱的后续几天内，实施任何与卒中后或恢复相关的自变量干预。
结果
动物在两个独立的群养笼中进行训练和测试，其中一个笼子饲养四只雌性大鼠，另一个笼子饲养四只雄性大鼠。所有大鼠均在四天或更短时间内学会通过ORTs。四只雌性大鼠达到 >在约6周的训练后，85%的试验达到120 g力度要求，而雄性大鼠则在10周内达到相同标准（相比之下，经过标准训练的剥夺型大鼠约需3周）7训练时长在第2至第6周期间因多种软硬件故障而显著延长，期间需持续进行故障排查。在解决这些问题后，训练得以顺利进行，预计后续的训练周期将与现有文献报道的时间相当。7雄性大鼠的训练时间也更长，以提供更多机会让其中一只雄性大鼠开始拉绳；然而，该大鼠始终未开始拉绳行为，因此在第7周后被排除于进一步的分析和手术之外。当大鼠的行为表现趋于稳定后，每只笼子均采集了5天的卒中前基线数据。数据仅限于OR设备全天保持连接至笼具的日子（部分日期因饲养相关操作需短暂断开连接而不计入）。雌性大鼠笼具的基线数据采集于卒中前第7、8、9、10和12天；雄性大鼠的基线数据采集于卒中前第8、9、10、11和13天。
在进行脑卒中诱导手术期间，本验证实验中的动物同时植入了电极，电极连接至无线接收芯片，分别位于其基底前脑（坐标：前后向 -5.8 mm，左右向 0.7 mm，背腹向 8.3 mm）或腹侧被盖区（坐标：前后向 -2.3 mm，左右向 3.3 mm，背腹向 7.0 mm）。这些植入装置用于后续的恢复实验，与本研究中报告的群养笼-物体识别测试（colony cage-ORT）验证无关。植入装置设计为可将皮肤覆盖其上，接收芯片置于左腋下皮下。
一名雌性动物在卒中诱导过程中死亡。另一名雌性动物在恢复后数天开始状况恶化，且卒中后从未拉动过手柄。在实施安乐死后发现，该动物可能在卒中后某个时间发生了脑出血。这两只动物的全部数据均被从数据集中剔除，包括卒中前的评估数据。
中风后，动物并未立即恢复正常的杠杆按压行为，但继续进入实验箱 通过 ORT测试中，动物需要通过短暂的手动塑形训练（即缩短杠杆距离，并在动物接近或尝试拉动杠杆时给予奖励）来鼓励其操作。雌性大鼠在卒中后第4至7天未出现拉杆行为，因此在第8至11天接受了额外的杠杆引诱（即在杠杆上涂抹少量花生酱）和手动塑形训练，并于第11天开始自主拉杆。根据此前对雌性大鼠的实验经验，雄性大鼠被允许恢复至第6天，但在卒中后第6天仍未出现拉杆行为。于第7天给予额外引诱，从第8天起开始自主拉杆。th 卒中后一天。一旦动物再次因拉拽尝试而获得强化，便停止补充诱饵或行为塑造，开始收集卒中后的数据。雄性动物在第8天的拉拽次数不足以进行更复杂的因变量（昼夜节律指标和 bout 后暂停）的完整分析，因此允许它们在第9天继续进行拉拽。th, 10th，和 11th 天，在相同标准下。8th, 10th，和 11th 天指的是完整的天数。除昼夜节律分析和爆发间停顿分析外，所有分析均使用卒中后首次拉拽的第一天数据；对于昼夜节律分析和爆发间停顿分析，则使用雌性大鼠的1天数据和雄性大鼠的3个完整天数的数据。卒中后分析中，两只雌性大鼠在一天内分别完成了55次和844次拉拽，三只雄性大鼠在三天内分别完成了536次、153次和190次拉拽。
数据根据拉力和拉力序列进行整理。为避免记录到设备自身产生的颤动，使用5 g阈值并设置±1 g滞后来测量拉力。当动物施加的拉力超过6 g时记录为一次拉力，当手柄记录到的力低于4 g时则停止记录。动物通常以多个快速拉力组成的序列进行拉拽。一旦单次拉力达到120 g，即给予强化刺激。拉力序列定义为一系列峰值间隔小于1 s的拉力集合。该阈值的选择基于先前的数据，表明峰值间间隔小于1 s的聚类自然形成，而其他峰值间间隔则明显更长。大鼠通常会在一次取食前连续进行多次拉拽，即使序列中较早的拉力已触发了取食装置。
共分析了7个因变量。采用配对 t检验 在基线平均值与卒中后测量值之间进行了比较，结果报告如下 图1, 图2，以及 图3这些图表还展示了每只动物的个体数据，以反映各项指标在不同天数及个体间可能存在的变异情况。
图1展示了中风前后在多项典型熟练抓取评估指标下的表现7,8,10。所有中风后的数据均被汇总为单个数据点，即使收集足够试验量耗时数天。该方案结合自动化自发起动系统，成功评估了每次尝试的成功率、每次拉拽的平均力量以及每次尝试中的拉拽次数，这些指标均对中风表现出不同程度的统计学显著性敏感性。
图2展示了来自群体饲养笼-操作性条件反射转棒（colony cage-ORT）实验设置的两个新变量：会话启动次数和累积会话持续时间。令人意外的是，脑卒中并未影响会话启动次数。无论在脑卒中发生前还是发生后，雌性大鼠启动会话的次数均显著多于雄性大鼠，但两性在脑卒中后启动会话的频率均未发生改变。相反，大多数大鼠在实验箱内的停留时间有所增加，这可能归因于尝试成功率的下降（导致奖励获取率降低的结果）
启动实验（代表在群体笼中可获得的丰富环境刺激与社交奖励以及食物强化之间做出选择）以及在实验箱内停留的时间（在条件性位置偏爱实验中，反映奖励价值）也可作为动机的指标24,25,26,27。此外还包括其他基于动机的测量指标，例如通过每分钟实验时段内的拉杆次数来量化“努力程度”28，以及两次行为序列之间的暂停时间29，如图3所示。这些变量均受到脑卒中的影响。正如预期，每分钟内的拉杆次数减少，且行为序列之间的暂停持续时间延长。然而，后一指标的变化较为复杂。行为暂停的分布似乎变得更加紊乱，表现为更频繁的长时间暂停、少数极长的暂停，以及更多短暂停顿。这可能提示原有熟练运动单元的功能受损；若如此，该现象或许可作为此类功能障碍的一个易于测量的指标。
尽管样本量较小，仍开展了一项分析，以确定所测量的变量中是否存在与成功率相关的因素，从而提示其可能的功能意义。采用Shapiro-Wilk检验评估成功率、平均峰值拉力、每分钟搏动次数、累积会话时长、搏动间停顿时间以及每次搏动中的拉力次数等变量的数据分布是否符合正态分布。Shapiro-Wilk检验结果显示，部分变量的分布与正态性存在显著偏离。因此，采用Spearman等级相关分析来评估卒中前或卒中后成功率与以下变量之间的关系：平均峰值拉力、每分钟搏动次数、累积会话时长、搏动间停顿时间以及每次搏动中的拉力次数。除平均拉力外，卒中前其他变量均未显示出与成功率具有显著相关性（见表1）。卒中后，大多数变量同样未显示与成功率有显著相关性，仅平均拉力例外（表1）。
最后，OR 装置不仅可用于分析熟练的运动行为，还可用于分析昼夜节律模式。图4展示了在基线期和卒中后各天，每只笼子中动物使用OR装置的每小时占比，以平均值形式呈现。图中蓝线表示全天每小时进入次数的平均计数。卒中前，动物在早晨会高度参与熟练抓取任务，随后全天参与时长逐渐减少。在开灯前数小时，动物的参与程度会出现再次升高（雌性）或略有增加（雄性），随后在开灯后不久即停止。这种双峰型的昼夜节律分布模式在卒中后发生了彻底改变。动物早晨的参与程度降低，其在装置内的活动时间峰值延迟至一天中较晚时段。此类节律变化可能反映了卒中后常见的总体睡眠及昼夜节律紊乱30,31,32,33。
图1：使用ORT方法测量卒中后熟练抓取行为的典型表现变化。 测量了卒中前后熟练抓取行为的表现。显示了每只动物在基线期5天和卒中后1天（左图）每次训练回合的成功率、每次拉力的平均力量以及每回合拉力次数的日均值，以及基线期平均值与卒中后1天（卒中后）的比较结果，并报告了配对t检验。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：卒中后不同自主启动会话参数表现出不同的变化趋势。 ORT 操作程序实现了对卒中前后熟练抓取行为会话自主启动情况的测量。图中显示了每只动物在基线期5天及卒中后1天的每日平均会话启动次数和每日累计会话持续时间（左侧），以及基线期平均值与卒中后1天（右侧）的配对比较结果，并报告了配对t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：与动机相关的变量在中风后发生变化。 分析了动物在中风前后熟练抓取行为会话中与动机相关的各项表现指标。左侧展示了每只动物在基线期5天和中风后1天的每次行为间暂停持续时间的日均值，以及每分钟会话中的行为次数日均值；右侧比较了基线期平均值与中风后1天（中风后）的差异，并报告了配对t检验结果。行为间的暂停在这些日均值上发生了变化，但更显著的是，中风后个体暂停时长的分布也在平均值两侧均发生了改变。所有动物的个体暂停时长被合并后，以对数坐标轴显示其分布情况（最右侧）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：中风后自发性操作会话的昼夜节律模式发生变化。 本研究测定了所有动物、雌性动物和雄性动物在中风前（左）和中风后（右）自发性熟练抓取行为会话的昼夜节律模式。这些数据包括所有笼舍中动物进入行为箱的所有记录及停留时间，按中风前和中风后的天数取平均值。随后将两个笼舍的数据再次取平均，以显示总体分布情况（第一行）。中风前的活动模式表现为早晨活跃度较高，随后在清醒期间逐渐下降，并在睡眠期前出现一个新的小高峰。中风后的模式则显示会话持续时间在白天逐渐增加，并在睡眠期前达到峰值。实验大鼠饲养环境采用反转的光照周期，图中灰色阴影区域表示光照期，即大鼠正常的非活跃期。请点击此处查看该图的放大版本。
| 相关性 | ||||||
| 变量 | 比较变量 | 斯皮尔曼 | ||||
| n | 卒中前 rs | p | 卒中后 rs | p | ||
| 平均拉力 | 成功率 | 5 | 1 | <0.001 | -0.975 | 0.005 |
| 每分钟拉拽次数 | 成功率 | 5 | 0.3 | 0.624 | -0.154 | 0.805 |
| 累积训练时长 | 成功率 | 5 | -0.1 | 0.873 | 0.564 | 0.322 |
| 组间暂停时间 | 成功率 | 5 | -0.6 | 0.285 | 0.205 | 0.741 |
| 每组拉拽次数 | 成功率 | 5 | 0.1 | 0.873 | -0.821 | 0.089 |
表1：变量间的斯皮尔曼相关系数。采用斯皮尔曼等级相关分析，评估卒中前或卒中后成功率与以下变量之间的关系：平均峰值、每分钟拉拽次数、累积会话时长、拉拽之间的暂停时间以及每次拉拽序列中的拉拽次数。在进行相关性分析前，先进行Shapiro-Wilk检验以评估所有测试变量成功率的分布是否均匀，结果表明部分变量显著偏离正态分布。除平均拉拽力外，卒中前其他变量与成功率均无显著相关性。本表展示了斯皮尔曼相关系数（ρ）的分析结果，用于判断成功率与五个测试变量之间是否存在相关关系。
补充文件1：构建单鼠转门装置的步骤。 本文件提供了打印和组装“单鼠转门”的详细说明，包括所需全部材料清单以及带图片的分步操作指南。此外，文件还包含安装微动开关以记录进出事件的说明，以及连接RFID读取器所需的布线和编程方法。请点击此处下载该文件。
补充代码文件 1：包含 3D 打印“单鼠转门”的所有组件。该文件可直接使用，或根据补充文件 1中的说明进行访问。此文件中的所有组件必须使用其中包含的“标尺”部件进行缩放（详见补充文件 1）。请点击此处下载此文件。
讨论
本方案具有多种用途。首先，也是最广泛的应用，操作式反应箱（ORT）的开发旨在实现社会性、丰富化饲养环境下对单个受试动物的自动化行为训练与数据采集。尽管本研究旨在验证在脑卒中背景下收集典型行为指标并对其进行拓展分析的可行性，但该系统同样适用于其他应用场景和行为任务。甚至本验证研究中采集的指标也可根据需要进行调整，以纳入替代性强化程序、替代性行为等。其次，本研究评估了该系统在采集脑卒中后精细抓取能力受损相关数据方面的性能。此前已有研究验证了当前方案在教学和测量基本杠杆按压行为方面的有效性16。现有数据表明，该方法是采集脑卒中相关运动功能缺陷数据的有效手段，既可获取传统精细抓取评估中的典型指标，也可获得新型指标。在对群养笼位操作式反应箱系统进行调试过程中，一个关键问题是动物是否会以足够高的频率自主启动行为实验，以及它们在不同实验条件下（尤其是在脑卒中后）是否仍能维持这一行为。研究发现，所有或几乎所有的动物均可被充分激励，积极参与简单操作式行为程序，目前也已成功应用于脑卒中后的行为测试。脑卒中后阶段虽需一定程度的人工行为塑造，但动物能迅速恢复自主参与行为任务，且无需实验人员在场。
在故障排查过程中，发现了若干可提高成功率的操作要点，这些要点已被整合到本方案中。其中包括需要根据大鼠体型调整操作箱（ORT）的尺寸，并确保动物体型相近且在社交环境中共同饲养。此外，研究发现，由于可能存在较高的箱体竞争，单个操作箱最适合容纳4至6只大鼠。值得注意的是，与传统方法相比，这种竞争似乎并不会引起更大的应激反应；先前的一项实验记录显示，在群体饲养装置中，大鼠的皮质醇水平低于传统行为测试条件下的水平16。此外还发现，对于胆怯的动物，在初始训练阶段移除旋转门或使其保持 unlocked 状态，有助于允许多只大鼠共同探索箱体环境。
尽管该方法在评估卒中后运动功能障碍方面是有效的，但必须认识到一些局限性。首先，卒中后的动物可能不会立即重新开始拉拽动作，可能需要经过数次手动塑形和/或诱饵引导训练。由于这一问题以及其他特定方法的限制，训练和测试的完全自动化可能更加困难。然而，这一局限性并非ORTE-群养笼装置所独有，在由实验人员启动的行为测试中，动物通常也会出现同样的问题。
另一个局限性是这些实验舱可能被用于非预期用途。据观察，曾多次出现动物进入行为实验舱并在其中停留较长时间，却未积极参与行为任务的情况。这种情况在所有动物中偶尔都会发生，但尤其多见于雄性动物。这可能仅仅是因为当动物不愿进行社交时，ORT为其提供了一定的隐私空间。尽管如此，通过使用其他ORT在群体饲养笼中增设“独处”房间，可缓解这一问题。
还观察到，动物有时会在隧道中停下，此时ORO处于半开启状态，并在此停留一段时间。因此，最好将RFID读取器放置在行为学实验箱附近，以确保只有当动物完全进入时才会被记录。可以推测，停留在ORO中的体验可能与挤压 chute 带来的感受类似，令人舒适。但无论如何，动物的此类停留行为并不会影响数据采集，特别是当有其他连接ORO的隔离舱可供选择时。
另一个局限性在于，自发起始的实验会话可能更难在群体个体之间均衡行为会话时间或行为反应机会。考虑到累积训练时间与功能恢复之间的关系，这一局限性在与中风相关的研究中可能尤为突出。然而，这一局限性至少可在一定程度上得到解决。如果实验需要，可以对许多行为装置进行编程，使其在达到目标时长或目标反应次数时终止会话（例如，通过停止给予奖励或收回操作装置）。这种解决方案无法解决个体未能达到目标次数的倾向问题。但需要再次强调的是，这一局限性并非该实验设置所独有。
这种设置还具有一个优势，即行为训练或暴露可以在全天进行，而不仅限于几个固定的时间段。这在多种情境下可能具有应用价值；特别是在中风研究中，可用于探究行为康复方法的剂量效应。
最后，OR测试可能不适用于厌恶性实验操作，例如社交挫败、强迫游泳、条件性恐惧等。OR测试要求行为范式具有趋近性；否则，动物很可能只会简单地回避行为实验箱。
尽管存在一些局限性，该方法仍为目前大鼠行为学研究范式带来了显著优势。首先，该装置可实现持续的高通量数据采集，同时节省实验人员的时间。尽管需要持续监控设备和动物状态，但实验人员每天仅需短暂到场数次即可。若采用传统方法，对8只动物进行行为学实验每天需要4至10小时的人工操作。而采用新物体识别测试-群体饲养笼（ORT-colony cage）方法后，所需人工操作时间几乎为零（假设设备正常且已实现自动化），并且可在周末持续采集数据，无需额外人工干预；这种在周末也能持续进行的行为活动记录，同时也增加了动物所能获得的环境丰富度总量。
ORT-群体笼具实验方案不仅在数据获取方面具有优势，而且在操作层面也具备便利性。该方案可提供多种传统方法难以获得的因变量，包括自主行为会话的节奏、持续时间或其他相关参数，如本研究中所探讨的内容。尽管昼夜节律相关变量通常通过跑轮活动进行测量，但该方案使得研究者能够进一步分析其他类型行为的模式特征及选择性参数。ORT装置甚至可用于连接不同群体笼具，使动物获得对异性个体的视觉或嗅觉接触，从而不仅能够评估其动机水平，还可研究求偶行为的昼夜节律模式。本研究已表征出多个可能对脑卒中研究具有价值的新因变量，包括昼夜节律相关变量以及与行为启动相关的变量，这些变量有助于深入探索脑卒中后可能出现的动机缺失和抑郁等临床转化问题。34,35尽管本文未予讨论，但其他与脑卒中相关的重要变量（例如抓取运动学的定性分析）也可通过该ORO实验箱群养方案轻松实现。 通过 运动激活相机
最后，本方案的一个显著优势在于，它能够使动物在其生命的大部分时间里生活在大型、丰富且具有社交性的环境中。动物福利的进步在基础实验室中不仅具有伦理学意义，也具有重要的科学意义。能够自由活动并进行社交的动物，应能为那些自然状态下不涉及限制或剥夺的疾病状态提供更佳的模型。此外，本方案中行为学实验具有自给自足的特性，意味着在采集行为学数据时无需人员在场。实验室中人员的出现可能会影响行为学数据，这种影响有时会因具体人员的不同、其训练水平的差异以及对待动物的方式而有所变化2,19。采用当前的实验方案，可最大限度地减少这些不可控且可变因素对数据造成的影响。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分由北德克萨斯大学（UNT）神经操作关系研究领域的Beatrice H. Barrett捐赠基金资助。我们感谢神经可塑性与修复实验室所有成员的建议与协助，特别是Valerie Rojas、Mary Kate Moore、Cameron Scallon和Hannah McGee。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | 咨询当地创客空间 | ||
| 螺栓 | Boltdepot | 1346 | 6-32 或 8-32，长度 0.5" |
| 螺栓 | Boltdepot | 1348 | 6-32 或 8-32，长度 0.75" |
| 门铰链 | XJS (Amazon) | 43398-16234 | 1" 柜用不锈钢门铰链套装；可选（若未打印“完美铰链”""） |
| 电钻 | 任何电动电钻均可使用 | ||
| 拉伸弹簧 | Nieko (Amazon) | 50456A | 根据 ORT 尺寸和所需张力选择并调整弹簧 |
| 颗粒糖 | |||
| 锁紧螺母 | Boltdepot | 2551 | 6-32 或 8-32 |
| 卷尺 | |||
| 微控制器 | Arduino | A000066 | Arduino Uno |
| 微动开关 | Sparkfun | KW4-Z5F | 微型微动开关（SPDT-滚轮杠杆型） |
| 单鼠转门（ORT） | Vulintus | 如不自行组装，请联系该公司获取报价 | |
| 用于行为评估的任选操作箱：本实验使用 Vulintus 提供的自动等长拉力操作箱 | Vulintus | 无货号：请联系 Vulintus | 请联系 Vulintus 获取报价 |
| PLA 耗材丝 | OVERTURE (Amazon) | UK-MATTEPLA17511 | |
| 有机玻璃 | Lesnlok (Amazon) | B09P74K7BR | 透明，厚度 1/8"，按需裁切 |
| 有机玻璃切割刀 | |||
| Python 程序 | Python 软件基金会 | 软件可应要求提供 | |
| RFID 读取器 | Priority 1 Design | RFIDRW-E-USB | 带天线 |
| RFID 标签 | Unified Information Devices | UC-1485-10 | |
| 杆 | Boltdepot | 23632 | 裁切至长度> 3.5" |
| 旋转工具 | 用于在装置和群体饲养笼中钻孔以安装 ORT；任何可用的五金工具均可 | ||
| 砂纸 | HSYMQ (Amazon) | TOMPOL-1118-1915-11 | |
| 套筒扳手组 | 任何套筒扳手组均可使用 | ||
| 电烙铁 | |||
| 强力胶 | 234790 | ||
| 导线 | Plusivo (Amazon) | EAN0721248989789 |
参考文献
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