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使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

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DOI：

10.3791/64970

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2023年2月17日

 , 
1Biophysics Department, Institute of Biomaterials and Biomolecular Systems, University of Stuttgart

本文内容

摘要

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。

摘要

高分辨率成像技术表明，许多离子通道并非静态结构，而是参与高度动态的过程，包括孔形成亚基与辅助亚基的瞬时结合、侧向扩散以及与其他蛋白质的聚集。然而，侧向扩散与功能之间的关系尚不清楚。为解决这一问题，我们描述了如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜监测并关联支撑脂质膜中单个通道的侧向移动性与活性。膜通过液滴界面双层（DIB）技术在超薄水凝胶基底上构建。与其他类型的模型膜相比，这些膜具有机械稳定性强、适用于高灵敏度分析技术的优点。本方案测量Ca2+ 通过观察Ca²⁺指示荧光染料的荧光发射来检测单通道离子流2+-敏感染料位于膜附近。与传统的单分子追踪方法不同，该技术无需使用可能干扰膜蛋白侧向运动和功能的荧光融合蛋白或标记物。与蛋白质构象变化相关的离子流改变仅由蛋白质在膜中的侧向运动引起。实验以线粒体蛋白转位通道TOM-CC和细菌通道OmpF为例展示了代表性结果。与OmpF相比，TOM-CC的门控行为对分子限域效应和侧向扩散性质高度敏感。因此，支撑性液滴界面双层膜是研究离子通道侧向扩散与其功能之间关联的有力工具。

引言

本实验方案旨在描述如何在聚合物支撑的液滴界面双层膜（DIB）膜中研究膜蛋白的膜流动性与离子通道通透性之间的相关性1,2,3。

目前这一技术补充了一系列先进的光学和表面分析工具，例如单颗粒追踪4,5、荧光相关光谱6,7以及高速原子力显微镜8,9,10。这些技术为膜的动态组成和结构提供了宝贵的见解，而这些组成和结构会影响基于膜的反应11,12,13。蛋白质在膜中的运动和侧向扩散依赖于其在膜内的局部蛋白密度，同时单个蛋白质分子也可能被脂筏14或蛋白质-蛋白质相互作用15,16所捕获。根据从膜延伸至胞外环境或胞质溶胶的蛋白质结构域不同，蛋白质的流动性可从高度可动到完全不可动不等。然而，由于膜及其周边结构的复杂性，通常难以解析侧向流动性特征与蛋白质功能之间的相互关系17。

DIB 膜已被证明是进行膜蛋白生物物理单分子分析的有效平台18,19,20,21,22。它们通过水相液滴与脂质/油相中水凝胶支撑基底接触后发生脂质自组装而形成。与常用的支撑脂双层（SLBs）1,23,24,25类似，当DIBs被修饰上合适的配体时，可通过蛋白质与聚合物基质的临时或永久结合，实现对侧向流动性的局部调控17。后者可作为细胞膜中蛋白质分布不均等生化过程的模型系统10。

本文所述的实验方法依赖于对 Ca2+ 敏感的荧光染料，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）检测靠近细胞膜的单个通道中的 Ca2+ 离子流2,22。这种光学方法通过渐逝波激发光的物理特性，将样品的照明范围限制在膜附近极短的距离内，从而显著降低荧光背景信号。这对于实现单分子检测所需的高空间和时间分辨率至关重要。与传统的电生理学方法26,27不同，该方法无需施加膜电位即可研究单个通道的离子流动。此外，该方法无需对通道进行荧光染料或可能干扰其在膜内侧向移动的分子标记。

该方法特别适用于在单分子水平上研究嵌入膜中的蛋白质通道，而无需使用传统的电生理学技术。通过利用来自Neurospora crassa的线粒体蛋白质转运通道TOM-CC28,29,30以及支持小分子亲水性物质跨Escherichia coli外膜扩散的OmpF通道17,31，我们展示了如何研究并关联这两种蛋白质的膜流动性与通道活性。我们建议，尽管该方法已针对TOM-CC和OmpF进行了优化，但仍可轻松应用于其他蛋白质通道。

方案

1. 蛋白质生产

注意：本节描述了从大肠杆菌中分离OmpF的实验步骤 大肠杆菌 BE BL21(DE3) omp631,32，缺乏 LamB 和 OmpC，以及 TOM 核心复合物 Neurospora crassa (图1)28,29后者需要从分离的线粒体 N. crassa 菌株28 含有6xHis标记的TOM亚基Tom22形式图1A)，可按所述方法进行分离28以下方案通常可获得 1-2 mg 的 N. crassa TOM-CC 和 10 mg 的 E. coli OmpF。如果需要调整用量，必须精确保持蛋白质与去垢剂的比例。除非另有说明，所有步骤均应在 4 °C.

  1. TOM核心复合物的分离
    1. 溶解纯化的 N. crassa 根据Bausewein等人的方法，通过差速沉降从约1.5 kg（湿重）菌丝中获得线粒体（2 g蛋白质）30，置于20 mM Tris-HCl（pH 8.5）、1%（w/v）DDM、20%（v/v）甘油、300 mM NaCl、20 mM 咪唑和1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）缓冲液中，蛋白浓度为10 mg/mL，4℃孵育30分钟 4 °C.
      警告：PMSF 具有毒性。请佩戴适当的个人防护装备。
    2. 将溶解的线粒体转移至超速离心管中，通过130,000 x g超速离心分离未溶解的膜组分与溶解的膜蛋白 g 40 分钟 4 °C 使用标准级滤纸进行过滤。
    3. 用约5个柱体积（CV）的缓冲液A1平衡预装的Ni-NTA柱（柱体积为5 mL）表1使用自动化蛋白纯化系统进行操作。所有步骤中，Ni-NTA 柱的流速保持恒定，为 1 mL/min。若蛋白来源于少于 2 g 的线粒体，则使用较小体积的层析柱（1 mL）。
    4. 以1 mL/min的流速将溶解的蛋白样品上样至Ni-NTA柱。
    5. 用 5 个柱体积的缓冲液 A1 洗涤 Ni-NTA 柱表1以去除未结合的蛋白质。
    6. 用30%缓冲液A2洗脱His标签的TOM-CC表1；300 mM 咪唑），并根据280 nm色谱图中出现的蛋白峰收集蛋白组分图1B).
    7. 为进一步纯化 TOM-CC，使用缓冲液 B1、B2 和 B1 各 5 个柱体积（CV）依次平衡预装的阴离子交换柱（1 mL）。表1使用自动化蛋白纯化系统进行操作。在所有步骤中，以1 mL/min的恒定流速运行阴离子交换柱。
    8. 将TOM-CC峰馏分（步骤1.1.6）上样至阴离子交换柱（流速为1 mL/min）。
    9. 用5个柱体积的缓冲液B1洗涤柱子以去除未结合的蛋白质（表1）以及0%–20%缓冲液B2的线性盐梯度表1).
    10. 用20%-35%缓冲液B2的线性盐梯度洗脱TOM-CC，并在280 nm色谱图中收集蛋白峰对应的组分图1C).
    11. 通过 SDS-PAGE 评估样品纯度（图1D）并根据制造商提供的说明书，使用市售的蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度（参见 材料表).
    12. 用液氮速冻蛋白质样品，并于 -80 °C 直至进一步使用。
      警告：液氮应在通风良好的区域操作，佩戴适当的个人防护装备。
       
  2. OmpF的分离
    1. 回收 E. coli 菌株 BE BL21(DE3) omp6，缺失 LamB 和 OmpC32，从冻存的甘油菌种在无菌条件下划线接种至Luria-Bertani（LB）琼脂平板上（表 2）。为此，需将样品逐渐均匀地涂布在整个平板上。
    2. 让样品在琼脂中浸泡5分钟，然后盖上皿盖倒置培养皿，在过夜培养 37 °C.
    3. 选择单个 E. coli 菌落，接种 7.5 mL LB 培养基（表2) 用无菌牙签挑取该单菌落，并在170 rpm振荡条件下培养过夜（14 h） 37 °C.
    4. 转移 2 × 1 mL 的 E. coli 使用无菌移液管将细胞加入 2 × 500 mL 的 LB 培养基中（表 2），并在 37 °C 在摇床中振荡（约170 rpm）。
    5. 通过在 5,000 x g 条件下离心收集细胞 g 20 分钟 4 °C，将沉淀物在液氮中速冻，并于-80 °C 直至进一步使用。
      注意：细胞沉淀的湿重通常为每 1 L 培养液 5 g。此时可暂停实验流程。
    6. 解冻细胞，并将细胞（2 g）重悬于 20 mL 裂解缓冲液 C1 中（表2），并将悬浮液在预冷至1,000 psi的条件下反复通过三次4 °C) 高压细胞破碎系统（最大样品体积为35 mL），按照制造商说明书操作。
      警告：使用French press可能导致严重伤害。切勿超过所用细胞的压力极限。须佩戴适当的个人防护装备。
    7. 通过在 4,000 x g 条件下离心去除裂解液中的未破碎细胞 g 孵育15分钟，收集上清液。
    8. 通过超速离心在 100,000 x g 条件下收集膜组分 g 1 小时。
    9. 将膜沉淀物重悬于10 mL缓冲液C2中（表2），与等体积的SDS缓冲液C3混合（表 2使用球轴承玻璃匀浆器进行匀浆。
      注意：C3 缓冲液中的 β-巯基乙醇具有毒性。请遵守所有相关的安全规定。
    10. 将悬液在水浴中孵育 50 °C 30 分钟。
    11. 以 100,000 x g 在 20 °C 1 小时。
    12. 将膜沉淀物重悬于 10 mL SDS 缓冲液 C4 中表2使用球轴承玻璃匀浆器进行匀浆，并将悬液置于水浴中孵育 37 °C 30 分钟。
      注意：如果沉淀无法重悬，可加入更多 SDS 缓冲液 C4，体积最多加至 20 mL。
    13. 以 100,000 x g 离心样品 g 在 20 °C 孵育30分钟，收集上清液。
    14. 将上清液与辛基聚氧乙烯醚（octyl POE）混合，使终浓度为 0.5%（w/v）的去垢剂，然后将样品在缓冲液 C5 中透析两次表 2) 在 4 °C 孵育24小时。为此，根据制造商说明，使用截留分子量为20 kDa的透析袋，将样品置于透析袋或透析装置中。
      注意：若透析其他分子质量的蛋白质，需调整透析管的截留分子量。
    15. 通过SDS-PAGE评估样品纯度，并根据制造商说明书使用 commercially available protein assay 测定蛋白浓度（材料清单).
      注意：样品加热至 95 °C 显示单体形式的 OmpF。未加热的样品显示 OmpF 以其三聚体形式存在（图1F).
    16. 将透析后的OmpF分装后在液氮中速冻，并于-80 °C保存。20 °C 直至进一步使用。
      警告：液氮应在通风良好的区域操作。请穿戴适当的个人防护装备。

2. 在DIB膜中对离子通道进行光学单通道记录

注意：本节描述了在微加工的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室2中制备双层界面膜（DIB）以监测膜中蛋白质的侧向运动及单个离子通道中离子流的方法17。制造该腔室的尺寸和详细图纸可在 Lepthin 等人2的研究中找到。图2概述了PMMA腔室2的组装过程以及DIB膜的形成。除非另有说明，所有步骤均在室温（RT）下进行。图3展示了DIB膜的示意图，以及如何利用单个通道蛋白中Ca2+的流动来监测膜中蛋白质的运动状态及通道的开闭状态。

  1. 脂质的制备
    1. 移除含有1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（25 mg/mL DPhPC）溶于氯仿，从-80°C冰箱中取出20 °C，并在室温下复温。通常情况下，将样品用手缓慢复温几分钟即可。
      警告：氯仿具有毒性。应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行所有涉及氯仿的操作。
    2. 转移 380 µL 将DPhPC储备液（25 mg/mL DPhPC）加入玻璃小瓶中。避免使用带有橡胶密封的移液器，而应使用带有不锈钢推杆的微量玻璃注射器。
    3. 处理完脂质储备液后，用 Ar 或 N₂ 覆盖脂质储备液2 气体以防止脂质氧化。使用尽可能低的气体流速，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发或溶剂喷雾从瓶中飞溅。确保盛有脂质和有机溶剂的玻璃小瓶瓶盖内侧涂有聚四氟乙烯（PTFE）。
    4. 将脂质样品（步骤 2.1.2）在 N₂ 气流下干燥2，并使用无油真空泵在真空（2.0 mbar）条件下过夜去除脂质样品中残留的有机溶剂。
    5. 将等体积的十六烷和硅油加入脂质膜中，溶解于十六烷/硅油溶液中（500 µL 使用微量玻璃注射器将每种脂质加入至终浓度为9.5 mg/mL。
      注意：脂质溶液在室温下可稳定保存数周。
  2. 琼脂糖水凝胶的制备
    1. 在双蒸水中配制约 1 mL 低熔点琼脂糖溶液（0.75% [w/v]），加热至融化 85 °C 在加热块中加热20分钟，用于旋涂玻璃盖玻片。
      注意：琼脂糖溶液可在室温下保存数周，并可多次重新加热。
    2. 在0.66 M CaCl₂中配制2.5%（w/v）低熔点琼脂糖溶液2 和 8.8 mM HEPES（pH 7.2），并加热至 85 °C 在加热块中加热20分钟，确保琼脂糖完全融化。
      注意：琼脂糖溶液可在室温下保存数周，并可多次重新加热，如同用于旋涂的琼脂糖（步骤 2.2.1）一样。
  3. 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室组装及在水凝胶-十六烷/硅油界面形成脂单层
    1. 将若干玻璃盖玻片（40 mm × 24 mm × 0.13 mm）放入不锈钢盖玻片架中，置于玻璃烧杯内，加入足量丙酮浸没盖玻片，并在超声波清洗器中清洗10分钟。用玻璃片 loosely 覆盖烧杯，形成无压密闭系统，以减少清洗过程中蒸气逸出。
      警告：丙酮是一种高度易燃溶剂，闪点较低。其蒸气与空气的混合物具有爆炸性。超声波清洗仪应在通风良好的环境中操作。佩戴适当的个人防护装备，并遵守官方安全规范（如禁止明火和火花）。
    2. 用双去离子水冲洗玻璃盖玻片，并在氮气流下干燥2.
      注意：以这种方式清洗的盖玻片可保存数周。
    3. 使用氧气（0.5 mbar）在等离子清洗仪中进一步清洁并增强盖玻片的亲水性，处理5分钟。
      注意：由于等离子清洗产生的亲水效应会随时间减弱，因此应在等离子清洗后立即进行琼脂糖溶液的旋涂步骤。
    4. 将经过等离子处理的盖玻片安装在旋涂仪上（图2，步骤1）。
    5. 通过缓慢加入琼脂糖，在盖玻片上覆盖一层亚微米厚的薄膜 140 µL 以3,000 rpm转速涡旋振荡30秒，加入加热的0.75%（w/v）低熔点琼脂糖（步骤2.2.1） 200 µL 移液器图2，步骤1）。
      注意：琼脂糖薄膜的厚度可通过原子力显微镜（AFM）测定，具体方法如下所述17.
    6. 立即将涂有薄层琼脂糖水凝胶的旋涂盖玻片贴附到PMMA腔室的底面2确保琼脂糖水凝胶朝上图2，步骤 2。
    7. 用透明胶带将盖玻片边缘固定在PMMA微加工装置上。
    8. 将PMMA装置置于加热至指定温度的加热板上 35 °C (图2第3步。
    9. 小心倾倒 200 µL 将2.5%琼脂糖溶液（步骤2.2.2）用移液器加入到腔室的入口中（图2，步骤3），避免产生气泡，以便旋涂施加的薄水凝胶能与2.5%琼脂糖溶液的缓冲液充分平衡并保持水合状态。确保2.5%琼脂糖溶液分布在旋涂后的琼脂糖水凝胶周围，但不可覆盖其表面（图3A），可通过轻轻将PMMA腔室压在加热板上来避免。
    10. 立即用PMMA板的孔覆盖各孔图2，第4步）总共 60 µL 脂质/油溶液（步骤2.1.5），以在琼脂糖-油界面处启动脂质单层的形成，并防止PMMA腔室孔中旋涂的琼脂糖脱水。将装置置于加热板上 35 °C 约2小时。
      注意：根据先前发表的研究，PMMA 腔室中的圆形孔直径为 0.5 mm，深度为 1.8 mm2.
  4. 十六烷/硅油溶液中脂质包覆水相液滴的制备
    1. 放置 20 µL 将脂质十六烷/硅油溶液（步骤 2.1.5）加入至液滴孵育室的多个微加工孔中图2，步骤4）。用于脂质十六烷/硅油溶液的合适容器是薄型PMMA板上尺寸为40 mm × 30 mm × 3.5 mm的小凹槽2.
    2. 准备一根尖端开口直径为 20 µm 使用垂直或水平的微型移液器拉制仪（例如，用于制备膜片钳移液管或尖端玻璃电极的仪器）。在双目立体显微镜下，以7.5倍至35倍的变倍范围进行低倍观察，估算微毛细玻璃针的开口直径。
      注意：在拉制玻璃毛细管之前，预热模式的设置、拉制时的加热模式以及牵引力应根据拉制仪的制造商说明和毛细管类型，通过实验预先确定。
    3. 用微毛细玻璃针填充 5 µL 含8.8 mM HEPES（pH 7.2）的水性注射溶液 7 µM Fluo-8 400 µM EDTA、1.32 M KCl 和 30 nM TOM 核心复合物，或 alternatively 使用微毛细移液管尖端加入 20 nM OmpF。仅使用经螯合树脂处理过的双蒸水，该树脂可结合多价金属离子（Ca2+）以配制水性注射溶液。
    4. 将装有水性注射溶液的微毛细玻璃针安装到压电驱动的纳米注射仪上。
    5. 注入100-200 nL的水相液滴（图2，第4步）含8.8 mM HEPES（pH 7.2）， 7 µM Fluo-8 400 µM EDTA、1.32 M KCl 和 30 nM TOM 核心复合物（步骤 1.1.12），或 alternatively 20 nM OmpF（步骤 1.2.16），使用纳米注射器加入已填充脂质十六烷/硅油溶液（见 2.1.5）的液滴孵育室的各孔中。确保液滴之间相距数毫米，避免相互接触。>10 mm）的间距加入到孔中。否则，如果在油/缓冲液界面尚未形成脂单层，它们会合并成更大的液滴。
      注意：若无班级毛细管和纳米注射器，也可使用单通道微升移液器手动制备液滴，适用于以下体积范围 0.1 µL 和 0.5 µL，如所述2然而，在这种情况下，液滴体积的准确性较低。
    6. 在 PMMA 和液滴培养室中孵育约 2 小时，使液滴/油界面形成单层脂质膜图2，第4步）置于加热至 35 °C.
  5. DIB 膜中单离子通道的制备与成像
    1. 在体视显微镜下，将液滴孵育室各孔中的单个水相液滴手动转移至PMMA室的各孔中（图2，步骤5），使用单通道微量移液器和 10 µL 一次性聚丙烯吸头。让液滴沉降至水凝胶-油界面处形成的脂单层上，静置约5 min，以形成脂双层（图3) 液滴与琼脂糖水凝胶之间。
    2. 将带有DIB膜的PMMA腔室安装在倒置光学显微镜的样品台上，使用10倍Hoffman调制对比物镜观察膜的形成情况图2，步骤6）。DIB膜的形成以液滴与水凝胶界面处出现清晰的白色环状结构为标志（图 4A）。破裂的 DIB 膜不会显示出此环（图4B).
      注意：也可以通过相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜在10倍放大倍数下观察DIB膜。
    3. 如果已形成 DIB 膜，将 PMMA 腔室安装在全内反射荧光显微镜的样品载台上（图2，步骤7）配备用于落射荧光照明的常规光源和488 nm激光器，P最大 = 100 mW）和背照式电子倍增CCD相机（512 × 512像素； >95% QE）以实现约 ~ 的像素尺寸0.16 µm.
    4. 使用GFP滤光片组，在落射荧光照明下以高强度光源和10倍物镜聚焦DIB膜的边缘。
    5. 使用100倍/数值孔径1.49复消色差油浸TIRF物镜，在落射荧光照明下，利用高强度光源配合GFP滤光片组，对DIB膜的同一边缘进行高倍率精细调焦，以观察液滴中荧光染料Fluo-8产生的微弱背景荧光图4C).
    6. 将滤光片设置从 GFP 更改为四通道 TIRF 滤光片组。
    7. 打开488 nm激光器，并将激光在物镜处的强度设置为8 mW至10 mW之间的值。
      注意：由于物镜处的激光强度通常缺乏定量信息，因此应根据制造商的说明，使用配备光电二极管传感器的光学激光功率计，在单独的测量中预先校准物镜处的激光强度设置。
      警告：为确保激光器安全操作，操作人员必须了解激光辐射的潜在危险以及事故预防规定。
    8. 为观察单个离子通道，调节TIRF角度和EMCCD相机增益（例如，EM增益倍增设置：285），使DIB膜中开放的离子通道在暗背景下呈现为高对比度的荧光亮点（图 4D- G），在目视检查时，信噪比达到最大值。确保对应于Ca的斑点2+单离子通道的荧光呈点状，保持聚焦且形态圆整，中心强度高，向边缘逐渐减弱。无通道的膜区域仅显示背景荧光。图 4C).
    9. 在记录单个通道随时间变化的运动及开闭活动之前，需检查荧光斑点是否处于焦平面，以确保离子通道已成功重组至DIB膜中，并在膜平面内进行侧向移动。若未观察到此现象，则可能表明荧光分子正在进出激光在膜附近产生的衰逝场。
    10. 记录一系列膜图像，以准确定位单个离子通道的位置并监测其开闭状态。为确定侧向运动类型（例如自由运动与瞬时锚定[参考文献见16]) 以及通道活性状态（例如，开放或关闭），需获取足够长（例如，30 秒至 1 分钟）且采样充分的轨迹数据（例如，帧率为 48 s-1).
      注意：对通道化、受限或跳跃扩散现象的观察16 要求采样速率足够快，以测量受限边界内的自由扩散。此外，确保数据采样时间足够长，以测量从非受限扩散到受限扩散的转变过程（详见 Jacobson 等人）。16).
  6. 图像与数据处理
    注：开源图像处理软件包33 或自编程序17 基于商业软件包可用于分析DIBs中单个离子通道的时空动态。为了能够将膜侧向移动性与单个通道的离子流相关联，不应应用滤波算法。
    1. 通过应用标准流程校正图像时间序列的漂白效应34 使用自编程序，通过拟合平均帧强度 静态平衡方程 ⟨I(t)⟩_raw；物理实验中数据分析的方法 完整图像的 指数函数方程，f(t, a_k) = a_1exp(a_2t) + a_3exp(a_4t)，数学分析，其中 t 是帧索引（时间）且 ak 是拟合参数。然后，根据这些参数校正时间序列 使用原始强度和调整因子进行强度校正的公式，符号表示为 I(t)=I_raw(t)/f(t,a_k)。，其中 I(t）为强度。或者，在初步数据分析时，可使用带有已实现的滚动球算法的开源软件进行背景校正33 以及一个滚动球半径，具体取决于相机的光斑和像素大小（例如，50 像素）。
    2. 通过拟合确定荧光斑点在定义的兴趣区域（ROI）（例如，30 × 30 像素）内的空间位置和强度 I(t在特定时间点 t 二维高斯函数结合平面倾斜，以校正可能存在的局部光照梯度 高斯分布公式，统计分析，研究方程，学术研究，数据拟合。在此处， x = (x, y) 是带有荧光强度信息的感兴趣区域（ROI）， A 和 σ 是高斯函数的振幅和宽度， pk 是表征感兴趣区域（ROI）背景强度的参数，以及 μ = (x0, y0) 定义了高斯分布的位置。单个通道中的离子流由参数给出 A通道的轨迹由以下给出 x，可用于测定通道的侧向移动性。或者，可以使用开源平台来确定单个斑点的位置和强度33 以及如所述的插件35,36. 估算位置精度37 在将EMCCD相机读出数据转换为光子数之后38.
    3. 绘制荧光强度幅值 A 与时间的关系及相应的轨迹 x 以确定通道扩散率与通道内离子流之间可能存在的相关性。使用任意图形软件完成此步骤。若通道存在自由侧向移动，则测定侧向扩散系数 D 通过时间延迟的线性回归 τ，并计算这些斑点的均方位移 x 根据 扩散系数方程；变量包括位置（x, y）和时间（τ）；数学公式。.
      注：典型的扩散系数17 在DIB膜中自由移动的TOM-CC和OmpF的范围介于0.5至 1.5 µm2 s-1扩散常数小于 0.01 mm 的分子2·s-1 被定义为固定的17.

结果

实时无电极光学单通道记录揭示了DIB膜中侧向蛋白质运动与单个离子通道功能之间的相互作用。将线粒体TOM核心复合物（图1A）重构至DIB膜（图4D）中，显示出侧向移动性与离子通透性之间存在显著的时间相关性（图5A）。TOM-CC的门控似乎对侧向运动模式敏感17。移动中的通道表现出通过其孔道的Ca2+流以及较高的荧光点强度；而被束缚、不移动的分子则显示低至中等荧光强度。对于线粒体蛋白质导入通用孔道TOM-CC，该单分子方法揭示了其侧向移动性与离子通透性之间存在强烈的时间相关性，提示TOM-CC通道具有机械敏感特性17。自由移动的TOM-CC分子发生侧向停止时，伴随着TOM-CC通道的部分或完全关闭。对嵌入OmpF（图1E 和 图4F）的DIB膜进行成像，由于OmpF几乎完全嵌入膜内，未观察到“走-停”效应（图5B）。OmpF的随机停止不伴随荧光强度变化，因此也不涉及其孔道的关闭。根据荧光信号38，可估计单个通道的位置精度在5至10 nm之间。然而需要注意的是，若通道因与琼脂糖水凝胶发生移动锚定而轻微晃动，则无法达到该精度，例如在中间状态下的TOM-CC分子，其均方位移可达120 nm（图5A）。

TOM复合物结构、层析洗脱谱、SDS-PAGE凝胶；蛋白质分析结果。
图1：TOM-CC的分离。（A）N. crassa TOM-CC的冷冻电镜结构30,39。对表达带有6xHis标签Tom22的N. crassa菌株来源的线粒体，使用DDM进行溶解，并依次进行Ni-NTA亲和层析（B）和阴离子交换层析（C）。（D）分离得到的TOM-CC的SDS-PAGE结果。（E）晶体结构（PDB，1OPF）以及（F）纯化的E. coli OmpF的SDS-PAGE结果。请点击此处查看该图的放大版本。

应用琼脂糖水凝胶并结合全内反射荧光显微镜的DIB膜形成过程示意图。
图 2：PMMA腔室组装流程图。 步骤1：将玻璃盖玻片通过旋涂法涂覆琼脂糖水凝胶。步骤2：将旋涂后的盖玻片安装至定制的PMMA显微镜腔室中。步骤3：在35 °C加热板上，向PMMA腔室的进样口加入额外的低熔点琼脂糖。步骤4：在缓冲液/油相界面（左侧）和琼脂糖水凝胶/油相界面（右侧）处，于水相液滴周围形成脂单层。步骤5：使用移液器将单个水相液滴加入PMMA腔室的孔中，当两个脂单层接触时形成脂双层。步骤6：通过霍夫曼调制对比显微镜验证DIB膜的形成。步骤7：利用全内反射荧光（TIRF）显微镜获取插入离子通道的DIB膜特定区域的图像。绿色：0.75%琼脂糖；黄色：含Ca2+离子的2.5%琼脂糖；品红色：脂质/油相；深蓝色：含有Ca2+敏感染料和蛋白的水相液滴缓冲液。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞膜动态、通过 Fluo-8 的钙离子内流（Ca²⁺）、光谱图、蛋白质运动。
图 3：实验装置示意图。（A）PMMA 孔板中 DIB 膜的示意图。双层膜置于超薄 0.75% 琼脂糖薄膜上，以便利用 TIRF 成像技术，在 trans 侧使用 Ca2+ 敏感型荧光染料（Fluo-8）随时间监测离子通道中的 Ca2+ 流动。（B）Ca2+ 流动完全由从 cis 到 trans 的渗透压控制。这使得能够同时确定通道在膜中的位置及其开/关状态。此处所示通道为 N. crassa 线粒体的蛋白质传导通道 TOM-CC30。（C）单个 TOM-CC 通道的运动轨迹。绿色：移动中的通道；黄色：静止的通道。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米盘蛋白质分析、强度映射、荧光显微镜、光谱强度图
图 4：在 DIB 膜中对 TOM-CC 和 OmpF 进行成像。 （A）通过霍夫曼调制对比显微镜成像的 DIB 膜，显示水凝胶与液滴之间的双层接触区域。（B）如（A）所示方式成像的断裂 DIB 膜。箭头：PMMA 腔室边缘。（C）无蛋白质通道的 DIB 膜，通过 TIRF 显微镜成像。（D）通过 TIRF 显微镜成像的含有重建 TOM-CC 的 DIB 膜。白色方框标记了高强度（SH）、中等强度（SI）和低强度（SL）的区域。（E）将（A）中标记的三个区域的荧光强度分布拟合为二维高斯函数，可揭示单个 TOM-CC 的位置及其通道中的 Ca2+ 流。(F) 含有重建 OmpF 的 DIB 膜。（G）对（F）中标记的荧光斑点进行高斯拟合。与具有两个孔道的 β-桶状蛋白复合物 TOM-CC 不同，具有三个孔道的 β-桶状蛋白 OmpF 仅表现出一种通透性状态。像素大小：0.16 μm。请点击此处查看此图的放大版本。

蛋白质动力学图；振幅与时间关系；显示 TOM-CC、OmpF；实验结果与分析。
图 5：通道活性与 TOM-CC 的侧向移动性相关。（A）TOM-CC 的荧光振幅轨迹（上图）及其对应的运动轨迹（下图）表明，TOM-CC 的开-关通道活性与其复合物在膜中的侧向移动性相关。轨迹显示出三种通透状态：绿色表示完全开放状态；黄色表示中间通透状态；红色表示通道关闭状态；红色星号表示处于中间状态的 TOM-CC 在其平均位置附近约 ±60 nm 范围内摆动。基于完全开放状态和中间状态荧光信号计算的位置精度37在 5 nm 至 10 nm 之间。（B）OmpF 的荧光振幅轨迹（上图）及其对应的运动轨迹（下图）。无论 OmpF 处于运动状态还是被捕获状态，均仅显示一个强度水平。对应于分子被捕获时间段的轨迹片段以灰色标出。请点击此处查看该图的放大版本。

缓冲液 试剂浓度体积
A1*20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 % (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 10% (v/v) 甘油, 300 mM NaCl, 和 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)100 mL
A2*20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) DDM, 10% (v/v) 甘油, 1 M 咪唑 和 1 mM PMSF100 mL
B1*20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 2% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)100 mL 
B2*20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)100 mL
* 使用前脱气并经 0.22 μm 滤膜过滤。

表1：TOM-CC 分离用缓冲溶液。

缓冲液 试剂浓度体积
LB*1% (w/v) 胰蛋白胨、1% (w/v) NaCl 和 0.5% (w/v) 酵母提取物 1100 mL
C12 mM MgCl2、约 750 单位 DNase 以及 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）  20 mL
C250 mM Tris-HCl，pH 7.550 mL 
C34% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）、2 mM β-巯基乙醇和 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）50 mL
C42% (w/v) SDS、500 mM NaCl 和 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）50 mL
C50.5% (w/v) 辛基聚氧乙烯醚（octyl POE）、1 mM EDTA 和 20 mM Tris（pH 8.5） 1000 mL
* 使用前灭菌。

表2：OmpF 分离用缓冲溶液。

讨论

本文介绍的实验方案旨在利用单分子全内反射荧光显微镜，通过DIB膜研究侧向离子通道运动与通道功能之间的相互作用。为了获得最佳数据，制备稳定且含有尽可能多分离良好的通道的DIB膜至关重要，这是获取可被充分分析的单个粒子时间序列的前提。

需要优化的关键参数包括脂质的选择、油相中的脂质浓度，以及水相液滴中蛋白质和去垢剂的浓度。所使用的脂质具有特殊性，因其在低温下无明显的相变。DPhPC 是一种常用于构建稳定膜系统的脂质40。原则上，任何在低温下仍能维持其流动性环境的脂质均可能适用于此用途。此外，该脂质应不易被氧化。液滴中的去垢剂浓度应尽可能低，以避免膜破裂。通常在去垢剂浓度低于临界胶束浓度（cmc）时，可实现稳定的膜结构和良好的蛋白质整合效率，前提是膜蛋白不会发生沉淀。

如果DIB膜不能耐受特定去垢剂21,41，或者当蛋白质无法从低去污剂溶液中直接整合到DIB膜时，可先将蛋白通道重构至小型单层脂质体（SUVs）中，再从液滴侧使SUVs与DIB膜融合，该方法已成功应用于 E. coli MscL42有时，由于油相中的脂质浓度过低，无法形成DIB膜。为防止DIB膜破裂，还应注意水凝胶与液滴之间的渗透压必须精确平衡，且不能影响Ca2+-flux 来自 顺式 到 转 过度。优化琼脂糖的厚度和孔径大小对于观察膜蛋白的扩散似乎至关重要。应避免琼脂糖层的任何干燥。厚度可使用原子力显微镜测定。17通过调整琼脂糖浓度、体积以及旋涂过程中的旋转速度，可优化水凝胶的孔径大小和厚度。但需注意，水凝胶层的厚度会影响成像对比度。为在DIBs中捕获膜蛋白，可将普通琼脂糖水凝胶替换为定制合成的非交联、镍-NTA修饰的低熔点琼脂糖，以实现对目标蛋白的捕获。 通过 一个His标签17过高的荧光背景通常由DIB膜破裂引起。对于多孔培养板而言，这一问题尤为突出，因为Ca2+-敏感染料扩散进入水凝胶。此时应避免使用相邻的孔。Ca的荧光漂白2+- 敏感性染料在膜上方不应成为显著的限制因素，因为它会被液滴主体中未激发的染料所置换（图3A）位于TIRF隐逝场之外。该蛋白质的定位精度由斑点拟合的准确度和像素大小决定。

微弱的荧光信号可能是由于通过通道的 Ca2+ 流量较低所致。可能的原因包括：(i) TIRF 设置不准确（例如激光强度），(ii) 跨膜的渗透性 Ca2+ 压力，或 (iii) 通道本身的 Ca2+ 通透性过低。针对第一个问题，需要优化激光强度、TIRF 角度和相机增益。后两个问题可通过在膜两侧施加电势来克服2,43。然而，施加外部电压可能扭曲实验结果，因为电学效应可能影响那些实际上不受电压调控的配体门控或机械敏感性离子通道的开放状态。此类通道的例子包括线粒体蛋白转运酶 TOM-CC27 及其形成通道的亚基 Tom4026,44,45,46。最后需要指出的是，将膜蛋白以特定方向插入 DIB 膜以实现预期功能具有较大挑战性，相关定量研究极为罕见47,48。在某些情况下，整合蛋白的方向是随机的。这对于膜蛋白研究而言是一个严重问题，因为某些膜蛋白仅在膜的一侧被激活。

全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种研究平面支撑膜中单分子事件的有力方法49。相关实例包括利用该技术阐明通道蛋白（如α-溶血素50、产气荚膜梭菌溶素O51和OmpG52）的组装与折叠途径，这些研究同时结合了FRET作为辅助技术。此外，机械敏感性离子通道MscL的激活此前已通过电流测量方法，在机械刺激支撑的DIB双层膜系统中得到研究42。基于上述工作，未来的研究可将本文所述平台与单分子FRET实验相结合，以光学方式在单分子水平上研究机械敏感性通道17。通过向液滴中注入缓冲液、拉伸内层DIB单层膜，或靶向结合单个通道至底层水凝胶，可进一步研究不仅响应膜张力和/或曲率的机械激活通道的物理机制——此类通道包括MscL和MscS、双孔域K+通道TREK-1、TREK-2和TRAAK，以及PIEZO通道（综述见53）——还可研究通道与细胞骨架的局部结合，正如在触觉敏感离子通道NOMPC中所展示的那样54,55。

披露

我们声明不存在利益冲突。

致谢

感谢 Beate Nitschke 在蛋白质制备方面的帮助，感谢 Robin Ghosh、Michael Schweikert（Stuttgart）和 Maximilan Ulbrich（Freiburg）富有见地的讨论。本工作由斯图加特系统生物学研究中心（SRCSB）以及巴登-符腾堡基金会（资助号：BiofMO-6，授予 SN）的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱Avanti Polar Lipids850356C
100x 油镜 Apochromat N.A. 1.49NikonMRD01991TIRF 显微镜 
10x 霍夫曼调制反差物镜 NA 0.25 Nikon用于评估 DIB 膜形成的显微镜  
10x 物镜 N.A. 0.25NikonMRL00102TIRF 显微镜 
40x 霍夫曼调制反差物镜 NA 0.55Nikon用于评估 DIB 膜形成的显微镜  
488 nm 激光器，100 mW  VisitronTIRF 显微镜 
胶带
Äkta pure  Cytiva蛋白质纯化系统
Bradford 检测试剂盒，PierceThermo Fisher 23236
CaCl2Roth5239.2
Chelax 100 树脂Biorad143-2832
氯仿 Sigma-AldrichMC1024452500
透析盒 Slide-A-Lyzer 20 k MWCOThermo Fisher 87735
DIB 腔室 定制用于 DIB 膜的 PMMA 腔室
数字功率计和能量控制台ThorlabsPM100D激光功率计 
二甲基亚砜Roth 4720.1
双蒸 H2O
Eclipse TS 100 霍夫曼调制反差显微镜 Nikon用于评估 DIB 膜形成的显微镜  
EDTARoth8042.2
EMCCD 相机 iXon Ultra 897AndorTIRF 显微镜 
乙醇Sigma-Aldrich32205-M
固定角转子 Ti70Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTMSanta Cruz BiotechnologySC-362561Ca2+敏感染料
法国压细胞破碎均质器IgneusIgneus 40000 psi
GFP 滤光片AHF用于白光光源落射荧光激发 DIB 膜的滤光片设置 
玻璃毛细管World Precision Instruments4878
玻璃盖玻片 40 mm x 24 mm x 0.13 mmRoth1870.2
甘油Roth3783.2
Hamilton 注射器 10 mLRothX033.1
Hamilton 注射器 100 mLRothX049.1
Hamilton 注射器 500 mLRothEY49.1
加热块 EppendorfThermomixer comfort
加热板Minitube HT200
HepesRoth 9205.3
十六烷Sigma-Aldrich296317
His Trap HP 1 mLCytiva29051021Ni-NTA 柱
咪唑Sigma-Aldrich1.04716.1000
KClHoneywell10314243
KLM 旋涂仪 Schaefer TecSCV-10
List medical L/M-3P-A 垂直移液器拉制仪Artisan Technology Group57761-1
低熔点琼脂糖Sigma-Aldrich A9414
M8 体视显微镜Wild体视显微镜 
Matlab MathWorksR2022a
甲醇Sigma-Aldrich34860
MicroFil 移液器吸头World Precision InstrumentsMF34G-5
N2 气体
NaClRoth3957.1
Nanoliter 2010 注射器 World Precision InstrumentsNanoliter 2010 
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷Glycon BiochemicalsD97002-C
Ni-NTA 琼脂糖，非交联型Cube Biotech124115393定制
NIS-Elements AR 软件NikonMQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930成像软件
n-辛基-聚氧乙烯Sigma-Aldrich40530
O2 气体
苯甲基磺酰氟Roth 6367.3
光电二极管传感器  Si，400 - 1100 nm，500 mWThorlabsS130C激光功率计传感器 
等离子清洗机Diener ElectronicsZepto
制备型超速离心机 OptimaBeckman Coulter
四通道 TIRF 滤光片 446/523/600/677 HCAHF用于 488 nm 激光激发 DIB 膜的滤光片设置 
Resource Q 1 mLCytiva17117701阴离子交换柱
硅油 AR 20Sigma-Aldrich10836
十二烷基硫酸钠Roth2326.2
Super LoLux 相机JVC体视显微镜 
热振荡器GerhardtTHL 500/1
Ti-E 荧光显微镜  NikonMEA53100
Tris-HClSigma-Aldrich9090.3
胰蛋白胨Roth8952.2
超声波清洗仪 Bandelin SonorexRK 100
真空泵VacuubrandMD 4C NT
落射荧光照明用白光光源（100 W）NikonMBF72655TIRF 显微镜 
酵母提取物Roth2363.2
β-巯基乙醇Sigma-AldrichM3148

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