使用全内反射荧光显微技术对脂双层中单分子侧向迁移及离子通道活性进行成像

摘要

本方案描述了如何使用全内反射荧光显微镜（TIRF）追踪支撑脂质膜中的单个离子通道并测定其活性，从而阐明侧向膜运动与通道功能之间的相互作用。方案详细介绍了如何制备膜样品、记录数据以及分析结果。

摘要

高分辨率成像技术表明，许多离子通道并非静态结构，而是参与高度动态的过程，包括孔形成亚基与辅助亚基的瞬时结合、侧向扩散以及与其他蛋白质的聚集。然而，侧向扩散与功能之间的关系尚不清楚。为解决这一问题，我们描述了如何利用全内反射荧光（TIRF）显微镜监测并关联支撑脂质膜中单个通道的侧向移动性与活性。膜通过液滴界面双层（DIB）技术在超薄水凝胶基底上构建。与其他类型的模型膜相比，这些膜具有机械稳定性强、适用于高灵敏度分析技术的优点。本方案测量Ca²⁺ 通过观察Ca²⁺指示荧光染料的荧光发射来检测单通道离子流²⁺-敏感染料位于膜附近。与传统的单分子追踪方法不同，该技术无需使用可能干扰膜蛋白侧向运动和功能的荧光融合蛋白或标记物。与蛋白质构象变化相关的离子流改变仅由蛋白质在膜中的侧向运动引起。实验以线粒体蛋白转位通道TOM-CC和细菌通道OmpF为例展示了代表性结果。与OmpF相比，TOM-CC的门控行为对分子限域效应和侧向扩散性质高度敏感。因此，支撑性液滴界面双层膜是研究离子通道侧向扩散与其功能之间关联的有力工具。

引言

本实验方案旨在描述如何在聚合物支撑的液滴界面双层膜（DIB）膜中研究膜蛋白的膜流动性与离子通道通透性之间的相关性^1,2,3。

目前这一技术补充了一系列先进的光学和表面分析工具，例如单颗粒追踪^4,5、荧光相关光谱^6,7以及高速原子力显微镜^8,9,10。这些技术为膜的动态组成和结构提供了宝贵的见解，而这些组成和结构会影响基于膜的反应^11,12,13。蛋白质在膜中的运动和侧向扩散依赖于其在膜内的局部蛋白密度，同时单个蛋白质分子也可能被脂筏¹⁴或蛋白质-蛋白质相互作用^15,16所捕获。根据从膜延伸至胞外环境或胞质溶胶的蛋白质结构域不同，蛋白质的流动性可从高度可动到完全不可动不等。然而，由于膜及其周边结构的复杂性，通常难以解析侧向流动性特征与蛋白质功能之间的相互关系¹⁷。

DIB 膜已被证明是进行膜蛋白生物物理单分子分析的有效平台^{18,19,20,21,22}。它们通过水相液滴与脂质/油相中水凝胶支撑基底接触后发生脂质自组装而形成。与常用的支撑脂双层（SLBs）^1,23,24,25类似，当DIBs被修饰上合适的配体时，可通过蛋白质与聚合物基质的临时或永久结合，实现对侧向流动性的局部调控¹⁷。后者可作为细胞膜中蛋白质分布不均等生化过程的模型系统¹⁰。

本文所述的实验方法依赖于对 Ca²⁺ 敏感的荧光染料，利用全内反射荧光显微镜（TIRF）检测靠近细胞膜的单个通道中的 Ca²⁺ 离子流^2,22。这种光学方法通过渐逝波激发光的物理特性，将样品的照明范围限制在膜附近极短的距离内，从而显著降低荧光背景信号。这对于实现单分子检测所需的高空间和时间分辨率至关重要。与传统的电生理学方法^26,27不同，该方法无需施加膜电位即可研究单个通道的离子流动。此外，该方法无需对通道进行荧光染料或可能干扰其在膜内侧向移动的分子标记。

该方法特别适用于在单分子水平上研究嵌入膜中的蛋白质通道，而无需使用传统的电生理学技术。通过利用来自Neurospora crassa的线粒体蛋白质转运通道TOM-CC^28,29,30以及支持小分子亲水性物质跨Escherichia coli外膜扩散的OmpF通道^17,31，我们展示了如何研究并关联这两种蛋白质的膜流动性与通道活性。我们建议，尽管该方法已针对TOM-CC和OmpF进行了优化，但仍可轻松应用于其他蛋白质通道。

方案

1. 蛋白质生产

注意：本节描述了从缺乏 LamB 和 OmpC 的 Escherichia coli BE BL21(DE3) omp6^31,32 中分离 OmpF，以及从 Neurospora crassa 中分离 TOM 核心复合物（图1）^28,29 的实验步骤。后者需要从含有 6xHis 标记的 TOM 亚基 Tom22 的 N. crassa 菌株²⁸ 中分离线粒体（图1A），该菌株的制备方法已有描述²⁸。以下实验方案通常可获得 1–2 mg 的 N. crassa TOM-CC 和 10 mg 的 E. coli OmpF。若需调整产量，必须精确保持蛋白质与去垢剂的比例。除非另有说明，所有步骤均应在 4 °C 下进行。

1. TOM核心复合物的分离
   1. 溶解纯化的 N. crassa 根据 Bausewein 等人的方法，通过差速沉降法从约 1.5 kg（湿重）菌丝中获得线粒体（2 g 蛋白质）³⁰在4 °C下，于含有20 mM Tris-HCl（pH 8.5）、1%（w/v）DDM、20%（v/v）甘油、300 mM NaCl、20 mM咪唑和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）的缓冲液中，使蛋白浓度达到10 mg/mL，孵育30分钟。
      警告：PMSF 具有毒性。请佩戴适当的个人防护装备。
   2. 将溶解的线粒体转移至超速离心管中，通过在130,000 x g条件下超速离心，分离未溶解的膜成分与溶解的膜蛋白。 g 4 °C 下孵育 40 分钟，并使用标准级滤纸过滤。
   3. 用约5个柱体积（CV）的缓冲液A1平衡预装的Ni-NTA柱（柱体积为5 mL）表1使用自动化蛋白纯化系统进行操作。所有步骤中，以1 mL/min的恒定流速运行Ni-NTA柱。若蛋白来源于少于2 g的线粒体，则使用较小体积的柱子（1 mL）。
   4. 以1 mL/min的流速将溶解的蛋白样品上样至Ni-NTA柱。
   5. 用5个柱体积的缓冲液A1洗涤Ni-NTA柱（表1以去除未结合的蛋白质。
   6. 用30%缓冲液A2洗脱His标签的TOM-CC表1；300 mM 咪唑）并收集在280 nm色谱图中出现的蛋白峰（图1B).
   7. 为进一步纯化TOM-CC，使用缓冲液B1、B2和B1分别以5个柱体积（CV）对预装的阴离子交换柱（1 mL）进行平衡。表1使用自动蛋白纯化系统进行操作。在所有步骤中，以1 mL/min的恒定流速运行阴离子交换柱。
   8. 将TOM-CC峰组分（步骤1.1.6）上样至阴离子交换柱（流速为1 mL/min）。
   9. 用 5 个柱体积的缓冲液 B1 洗涤柱子以去除未结合的蛋白质（表1）以及0%–20%缓冲液B2的线性盐梯度表1).
   10. 用20%-35%的缓冲液B2线性盐梯度洗脱TOM-CC，并在280 nm色谱图中出现蛋白峰时收集相应馏分图1C).
   11. 通过SDS-PAGE评估样品纯度（图1D）并根据制造商提供的说明书，使用市售的蛋白质检测试剂盒测定蛋白质浓度（参见 材料表).
   12. 将蛋白质样品在液氮中速冻，随后于 -80 °C 保存，待后续使用。
       警告：液氮应在通风良好的区域操作，佩戴适当的个人防护装备。
        
2. OmpF的分离
   1. 回收 E. coli 菌株 BE BL21(DE3) omp6，缺失 LamB 和 OmpC³²，从冻存的甘油菌种在无菌条件下接种，并划线接种于Luria-Bertani（LB）琼脂平板上（表 2）。为此，需将样品逐渐均匀地铺展在整个平板上。
   2. 让样品在琼脂中浸泡5分钟，然后盖上皿盖，将培养皿倒置，在37 °C下过夜培养。
   3. 选择一个 E. coli 菌落，接种于7.5 mL LB培养基中（表 2用无菌牙签挑取单菌落，并在37 °C、170 rpm振荡条件下过夜培养（14 h）。
   4. 转移 2 × 1 mL 的 E. coli 使用无菌移液管将细胞接种至2 × 500 mL LB培养基中（表2），置于摇床中37 °C、约170 rpm振荡培养过夜（约14 h）。
   5. 通过在 5,000 x g 条件下离心收集细胞 g 4 °C下离心20分钟，将沉淀物用液氮速冻，然后于-80 °C保存备用。
      注意：细胞沉淀的湿重通常为每1 L培养液5 g。此时可暂停实验流程。
   6. 解冻细胞，并在20 mL裂解缓冲液C1中重悬细胞（2 g）表2），按照生产商说明书，将悬浮液通过预冷（4 °C）的高压细胞破碎系统在1,000 psi压力下反复处理三次，每次最大样品体积为35 mL。
      警告：使用French press可能导致严重伤害。切勿超过所用容器的压力极限。请穿戴适当的个人防护装备。
   7. 通过在 4,000 x g 条件下离心去除裂解液中的未破碎细胞 g 孵育15分钟，收集上清液。
   8. 通过超速离心在 100,000 x g 条件下收集膜组分 g 1小时。
   9. 将膜沉淀重悬于 10 mL 缓冲液 C2 中（表 2），与等体积的SDS缓冲液C3混合（表2使用球轴承玻璃匀浆器进行匀浆。
      注意：C3缓冲液中的β-巯基乙醇具有毒性，须遵守所有相关的安全规定。
   10. 将悬液在50 °C水浴中孵育30分钟。
   11. 以 100,000 x g 离心样品 g 在 20 °C 下孵育 1 小时。
   12. 将膜沉淀重悬于 10 mL SDS 缓冲液 C4 中表 2使用球轴承玻璃匀浆器进行匀浆，并将悬液在37 °C水浴中孵育30分钟。
       注意：如果沉淀无法重悬，可加入更多SDS缓冲液C4，体积最多至20 mL。
   13. 以 100,000 x g 离心样品 g 在20 °C下孵育30分钟，收集上清液。
   14. 将上清液与聚氧乙烯辛基醚（octyl POE）混合，使终浓度为 0.5%（w/v），然后将样品在缓冲液 C5 中透析两次（表 24 °C 下透析 24 小时。使用截留分子量为 20 kDa 的透析袋，按照制造商说明书操作，将样品置于透析袋或透析装置中。
       注意：若透析其他分子质量的蛋白质，需调整透析管的截留分子量。
   15. 通过SDS-PAGE评估样品纯度，并根据制造商说明书使用 commercially available protein assay 测定蛋白质浓度（材料表).
       注意：加热至 95 °C 的样品显示 OmpF 的单体形式，未加热的样品显示 OmpF 的三聚体形式（图1F).
   16. 将透析后的OmpF分装后在液氮中速冻，并于-20 °C保存备用。
       注意：液氮应在通风良好的区域操作，佩戴适当的个人防护装备。

2. 在DIB膜中对离子通道进行光学单通道记录

注意：本节描述了在微加工的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室²中制备双层脂膜（DIB）膜以监测单个离子通道中蛋白质的侧向运动和离子流的步骤¹⁷。制造该腔室的尺寸和精确图纸可参见Lepthin等人的研究²。图2概述了PMMA腔室²的组装过程以及DIB膜的形成。除非另有说明，所有步骤均在室温（RT）下进行。图3展示了DIB膜的示意图，以及如何利用单个通道蛋白中Ca²⁺的流动来监测膜内蛋白质的运动状态及通道的开闭状态。

1. 脂质的制备
   1. 去除含有1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（25 mg/mL DPhPC）溶于氯仿，从-20 °C冰箱中取出后，升至室温。通常只需用手缓慢温育数分钟即可。
      警告：氯仿具有毒性。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行所有涉及氯仿的实验步骤。
   2. 将380 µL DPhPC储备液（25 mg/mL DPhPC）转移至玻璃小瓶中。避免使用带橡胶密封的移液器，应使用带有不锈钢推杆的微升玻璃注射器。
   3. 处理脂质储备液后，用 Ar 或 N₂ 覆盖脂质储备液₂ 使用气体以防止脂质氧化。应使用尽可能低的气体流速，以避免溶解脂质的有机溶剂蒸发或溶剂从瓶中飞溅。确保装有脂质和有机溶剂的玻璃小瓶瓶盖内侧涂有聚四氟乙烯（PTFE）。
   4. 将脂质样品（步骤 2.1.2）在氮气流下干燥₂，并使用无油真空泵在真空（2.0 mbar）条件下过夜去除脂质样品中残留的有机溶剂。
   5. 使用微量玻璃注射器向脂质膜中加入等体积的十六烷和硅油（各500 µL），溶解于十六烷/硅油溶液中，最终脂质浓度为9.5 mg/mL。
      注意：脂质溶液在室温下可稳定保存数周。
2. 琼脂糖水凝胶的制备
   1. 在双蒸水中配制约1 mL低熔点琼脂糖溶液（0.75% [w/v]），置于加热块中85 °C加热20 min，用于旋涂玻璃盖玻片。
      注意：琼脂糖溶液可在室温下保存数周，并可多次重新加热。
   2. 在0.66 M CaCl₂中配制2.5%（w/v）低熔点琼脂糖溶液₂ 以及 8.8 mM HEPES（pH 7.2），在加热块中于 85 °C 加热 20 分钟。确保琼脂糖完全融化。
      注意：琼脂糖溶液可在室温下保存数周，并可多次重新加热，如同用于旋涂的琼脂糖（步骤 2.2.1）一样。
3. 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室组装及在水凝胶-十六烷/硅油界面形成脂单层
   1. 将若干玻璃盖玻片（40 mm × 24 mm × 0.13 mm）放入不锈钢盖玻片架中，置于玻璃烧杯内，加入足量丙酮浸没盖玻片，并用玻璃片松散覆盖烧杯口，形成无压密闭系统，以减少清洗过程中蒸气逸出。在超声波清洗器中用丙酮清洗10分钟。
      警告：丙酮是一种高度易燃溶剂，闪点较低。其蒸气与空气的混合物具有爆炸性。超声波清洗仪应在通风良好的环境中操作。佩戴适当的个人防护装备，并遵守官方安全规范（例如，禁止明火和火花）。
   2. 用双蒸水冲洗玻璃盖玻片，并在氮气流下吹干₂.
      注意：以这种方式清洗的盖玻片可保存数周。
   3. 在等离子清洗仪中用氧气（0.5 mbar）进一步清洁并增强盖玻片的亲水性，处理5分钟。
      注意：由于等离子清洗产生的亲水效应会随时间减弱，因此应在等离子清洗后立即进行琼脂糖溶液的旋涂步骤。
   4. 将经过等离子处理的盖玻片安装在旋涂仪上（图2，步骤1）。
   5. 使用200 µL移液器，在3,000 rpm转速下缓慢加入140 µL加热的0.75%（w/v）低熔点琼脂糖（步骤2.2.1），使盖玻片表面形成一层亚微米级厚度的琼脂糖薄膜图2，步骤1）。
      注意：琼脂糖薄膜的厚度可通过原子力显微镜（AFM）测定，方法如下所述¹⁷.
   6. 立即将涂有薄层琼脂糖水凝胶的旋涂盖玻片粘附到PMMA腔室的底面²确保琼脂糖水凝胶朝上图2，步骤 2）。
   7. 用透明胶带将盖玻片边缘固定在PMMA微加工器件上。
   8. 将PMMA装置置于加热至35 °C的加热板上（图2，步骤 3）。
   9. 用移液器小心地将 200 µL 2.5% 琼脂糖溶液（步骤 2.2.2）倒入腔室的入口中图2，步骤3），避免产生气泡，以便旋涂施加的薄水凝胶能与2.5%琼脂糖溶液的缓冲液充分平衡并保持水合状态。确保2.5%琼脂糖溶液分布在旋涂后的琼脂糖水凝胶周围，但不可覆盖其表面（图3A），可通过轻轻将PMMA腔室压在加热板上来避免。
   10. 立即用PMMA腔室的孔板覆盖各孔（图2，加入总共60 µL的脂质/油溶液（步骤2.1.5），以在琼脂糖-油界面处启动脂质单层的形成，并防止PMMA腔室孔中旋涂琼脂糖脱水。将装置置于35 °C的加热板上保持约2小时。
       注意：根据先前发表的研究，PMMA 腔室中的圆形孔直径为 0.5 mm，深度为 1.8 mm².
4. 十六烷/硅油溶液中脂质包被水相液滴的制备
   1. 将20 µL脂质十六烷/硅油溶液（步骤2.1.5）加入至液滴培养室中若干微加工小孔内图2，步骤4）。用于脂质十六烷/硅油溶液的合适容器是薄型聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）板上尺寸为40 mm × 30 mm × 3.5 mm的小凹槽².
   2. 使用垂直或水平的微电极拉制仪（例如用于制备膜片钳电极或尖锐玻璃电极的仪器）制备尖端开口直径为20 µm的微毛细玻璃针。在双目光学立体显微镜下，以7.5倍至35倍的变焦范围低倍放大观察，估算微毛细玻璃针的开口直径。
      注意：在拉制玻璃毛细管之前的预热模式设置、拉制时的加热模式以及牵引力应根据拉制仪的制造商说明和毛细管类型，通过实验预先确定。
   3. 用微量移液枪头将含有8.8 mM HEPES（pH 7.2）、7 µM Fluo-8、400 µM EDTA、1.32 M KCl和30 nM TOM核心复合物的5 µL水相注射溶液填充至玻璃微毛细管针中，或 alternatively 使用20 nM OmpF替代TOM核心复合物。仅使用经螯合树脂处理过的双蒸水，该树脂可结合多价金属离子（Ca²⁺) 以制备水性注射溶液。
   4. 将装有水相注射溶液的微毛细玻璃针安装到压电驱动的纳米注射仪上。
   5. 注射100-200 nL的水相液滴（图2，步骤4）含有8.8 mM HEPES（pH 7.2）、7 µM Fluo-8、400 µM EDTA、1.32 M KCl以及30 nM TOM核心复合物（步骤1.1.12），或 alternatively 20 nM OmpF（步骤1.2.16），使用纳米注射器将其加入已填充脂质十六烷/硅油溶液（见2.1.5）的液滴孵育室的孔中。确保液滴之间相隔数毫米，避免相互接触（>10 mm）的距离加入到孔中。否则，如果在油/缓冲液界面尚未形成脂单层，它们将合并成更大的液滴。
      注意：若无毛细管类移液器和纳米注射器，也可使用单通道微升移液器手动制备液滴，适用于0.1 µL至0.5 µL的体积，具体方法如下所述²然而，在这种情况下，液滴体积的准确性较低。
   6. 在PMMA和液滴孵育室中保持约2小时，使脂质单层在液滴/油界面处形成图2在35 °C的加热板上进行第4步操作。
5. DIB 膜中单离子通道的制备与成像
   1. 在体视显微镜下，将液滴孵育板各孔中的单个水相液滴手动转移至PMMA板的各孔中（图2，步骤5），使用带10 µL一次性聚丙烯吸头的单通道微量移液器。让液滴沉降至水凝胶-油界面处形成的脂单层上，静置约5分钟，以形成脂双层（图3) 液滴与琼脂糖水凝胶之间。
   2. 将带有DIB膜的PMMA腔室安装在倒置光学显微镜的样品台上，使用10倍Hoffman调制对比物镜观察膜的形成情况图2，步骤6）。DIB膜的形成以液滴与水凝胶界面处出现清晰的白色环为标志。图4A）。已破损的DIB膜不会显示此环（图4B).
      注意：也可以通过相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜在10倍放大倍数下观察DIB膜。
   3. 如果已形成 DIB 膜，将 PMMA 腔室安装在 TIRF 显微镜的样品台上（图2，第7步）配备用于落射荧光照明的常规光源和488 nm激光器（P_最大值 = 100 mW）和背照式电子倍增CCD相机（512 × 512像素； >95% 量子效率）以实现约 0.16 µm 的像素尺寸。
   4. 使用GFP滤光片组，在落射荧光照明和高强度光源下，用10倍物镜聚焦DIB膜的边缘。
   5. 使用100倍/数值孔径1.49复消色差油浸TIRF物镜，在落射荧光照明下，利用高强度光源配合GFP滤光片组，对DIB膜同一边缘进行高倍精细调焦，以观察液滴中荧光染料Fluo-8产生的微弱背景荧光图4C).
   6. 将滤光片设置从GFP更换为四通道TIRF滤光片组。
   7. 打开488 nm激光器，并将激光在物镜处的强度设置为8 mW至10 mW之间的值。
      注意：由于物镜处的激光强度通常缺乏定量信息，因此应根据制造商的说明，使用配备光电二极管传感器的光学激光功率计，在单独的测量中预先校准物镜处的激光强度设置。
      警告：为确保激光器安全操作，操作人员必须了解激光辐射的潜在危险以及事故预防规定。
   8. 为了观察单个离子通道，调整全内反射荧光（TIRF）角度和EMCCD相机增益（例如，EM增益倍增设置：285），使DIB膜中的开放离子通道在暗背景下呈现为高对比度的荧光斑点图 4D- G），在目视检查时，信噪比达到最大值。确保对应于Ca的斑点²⁺单离子通道的荧光信号保持在焦平面内，呈圆形，中心强度高，向边缘逐渐减弱。不含通道的膜仅显示背景荧光图4C).
   9. 在记录单个通道随时间的运动及开闭活性之前，应检查荧光斑点是否处于焦平面，以确保离子通道已成功重组至DIB膜中，并能在膜平面内进行侧向移动。若未观察到此现象，则可能表明荧光分子正在进出激光在膜附近产生的衰逝场。
   10. 记录一系列膜图像，以准确定位单个离子通道的位置并监测其开闭状态。为确定侧向运动类型（例如自由运动与瞬时锚定[参考文献见¹⁶]) 和通道活性状态（例如，开放或关闭），需获取足够长（例如，30 秒至 1 分钟）且采样充分的轨迹数据（例如，帧率为 48 s^-1).
       注意：对成束、受限或跳跃扩散现象的观察¹⁶ 要求采样速率足够快，以测量在限制边界内的自由扩散。此外，需确保数据采样时间足够长，以测量从无限制扩散到受限扩散的转变过程（详见 Jacobson 等人）。¹⁶).
6. 图像与数据处理
   注意：开源图像处理软件包³³ 或自编程序¹⁷ 基于商业软件包可用来分析DIBs中单个离子通道的时空动态。为了能够将膜侧向流动性与单个通道的离子流相关联，不应应用滤波算法。
   1. 通过应用标准流程校正图像时间序列的漂白效应³⁴ 使用自编程序，通过拟合平均帧强度 完整图像的 ，其中 t 是帧索引（时间） a_k 是拟合参数。然后，根据对时间序列进行校正 ，其中 我(t）为强度。或者，在初步数据分析中，可使用带有已实现的滚动球算法的开源软件进行背景校正³³ 以及一个滚动球半径，具体取决于相机的光斑和像素大小（例如，50像素）。
   2. 通过拟合确定荧光斑点在定义的兴趣区域（ROI）（例如，30 × 30 像素）内的空间位置和强度 我(t在特定时间点 t 二维高斯函数结合平面倾斜，以校正可能存在的局部光照梯度 。在这里， x = (x, y) 是包含荧光强度信息的感兴趣区域， A 和 σ 是高斯函数的幅值和宽度， p_k 是用于表征感兴趣区域（ROI）背景强度的参数，以及 μ = (x₀, y₀) 定义了高斯函数的位置。单个通道中的离子流由参数给出 A通道的轨迹由以下给出 x，并可用于测定通道的侧向移动性。或者，可以使用开源平台来确定单个斑点的位置和强度³³ 以及如所述的插件^35,36. 估算位置精度³⁷ 在将EMCCD相机读出数据转换为光子数之后³⁸.
   3. 绘制荧光强度幅值 A 与时间的关系及相应的轨迹 x 确定通道扩散性与通道内离子流之间可能存在的相关性。使用任意图形软件进行此分析。若通道存在自由的侧向移动，则确定其侧向扩散系数。 D 通过时间延迟的线性回归 τ，并计算斑点的均方位移 x 根据 .
      注意：典型的扩散系数¹⁷ 在DIB膜中自由移动的TOM-CC和OmpF的范围介于0.5至1.5 µm之间² s^-1扩散常数小于0.01 mm的分子²·s^-1 被定义为固定的¹⁷.

结果

实时无电极光学单通道记录揭示了DIB膜中侧向蛋白质运动与单个离子通道功能之间的相互作用。将线粒体TOM核心复合物（图1A）重构到DIB膜中（图4D），显示出侧向移动性与离子通透性之间存在显著的时间相关性（图5A）。TOM-CC的门控行为似乎对侧向运动模式敏感¹⁷。移动中的通道表现出通过其孔道的Ca²⁺流以及较高的荧光点强度；而被捕获、不移动的分子则表现出低至中等的荧光强度。对于线粒体通用蛋白质导入孔TOM-CC，该单分子方法揭示了其侧向移动性与离子通透性之间存在强烈的时间关联，提示TOM-CC通道具有机械敏感特性¹⁷。自由移动的TOM-CC分子发生侧向停止时，伴随着TOM-CC通道的部分或完全关闭。对含有几乎完全嵌入膜内的OmpF的DIB膜进行成像（图1E 和 图4F），未观察到“走-停”效应（图5B）。OmpF的随机停止与其荧光强度变化无关，因此也不涉及其孔道的关闭。根据荧光信号³⁸，可估计单个通道的位置精度在5至10 nm范围内。然而需要注意的是，若通道因与琼脂糖水凝胶的可动锚定而产生轻微摆动，则无法达到此精度，例如处于中间状态的TOM-CC分子其均方位移可达120 nm（图5A）。

图 1：TOM-CC 的分离。（A）N. crassa TOM-CC 的冷冻电镜结构^30,39。从含有带 6xHis 标签 Tom22 的 N. crassa 菌株中提取线粒体，用 DDM 溶解后进行 Ni-NTA 亲和层析（B）和阴离子交换层析（C）。（D）分离得到的 TOM-CC 的 SDS-PAGE 分析。（E）纯化的 E. coli OmpF 的晶体结构（PDB，1OPF）以及（F）其 SDS-PAGE 结果。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：PMMA 腔室组装的流程图。 步骤 1：将玻璃盖玻片进行琼脂糖水凝胶旋涂。步骤 2：将旋涂后的盖玻片安装至定制的 PMMA 显微镜腔室中。步骤 3：在 35 °C 加热板上，向 PMMA 腔室的进样口加入额外的低熔点琼脂糖。步骤 4：在缓冲液/油相界面（左）和琼脂糖水凝胶/油相界面（右）处，于水相液滴周围形成脂单层。步骤 5：将单个水相液滴用移液器加入 PMMA 腔室的孔中，当两个脂单层接触时形成脂双层。步骤 6：通过霍夫曼调制对比显微镜验证 DIB 膜的形成。步骤 7：利用全内反射荧光（TIRF）显微镜获取插入离子通道的 DIB 膜选定区域的图像。绿色：0.75% 琼脂糖；黄色：含 Ca²⁺ 离子的 2.5% 琼脂糖；品红色：脂质/油相；深蓝色：含有 Ca²⁺ 敏感染料和蛋白的水相液滴缓冲液。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：实验装置示意图。（A）DIB膜在PMMA微井中的示意图。双层膜置于超薄0.75%琼脂糖膜上，以便利用TIRF显微技术对反式侧中Ca²⁺敏感荧光染料（Fluo-8）随时间变化的Ca²⁺跨离子通道流动进行成像。（B）Ca²⁺流动完全由顺式到反式的渗透压控制。这使得可以同时确定通道在膜中的位置及其开闭状态。此处所示通道为N. crassa线粒体的蛋白质传导通道TOM-CC³⁰。（C）单个TOM-CC通道的运动轨迹。绿色：移动中的通道；黄色：静止的通道。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：在 DIB 膜中成像 TOM-CC 和 OmpF。 （A）通过霍夫曼调制对比显微镜成像的 DIB 膜，显示水凝胶与液滴之间的双层接触区域。（B）如（A）中所示方法成像的破损 DIB 膜。箭头：PMMA 腔室边缘。（C）无蛋白质通道的 DIB 膜，通过 TIRF 显微镜成像。（D）重建了 TOM-CC 的 DIB 膜，通过 TIRF 显微镜成像。白色方框标记了高（S_H）、中等（S_I）和低（S_L）强度区域。（E）将（A）中标记的三个区域的荧光强度分布拟合为二维高斯函数，可揭示单个 TOM-CC 的位置及其通道中的 Ca²⁺ 流。（F）重建了 OmpF 的 DIB 膜。（G）对（F）中标记的荧光斑点进行高斯拟合。与具有两个孔道的 β-桶状蛋白质复合物 TOM-CC 不同，具有三个孔道的 β-桶状蛋白 OmpF 仅表现出一种通透状态。像素尺寸：0.16 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：通道活性与 TOM-CC 的侧向迁移性相关。（A）TOM-CC 的荧光振幅轨迹（上图）及其对应的轨迹图（下图）表明，TOM-CC 的开-闭通道活性与其复合物在膜中的侧向迁移性相关。轨迹显示了三种通透性状态：绿色表示完全开放状态；黄色表示中间通透状态；红色表示通道关闭状态；红色星号表示处于中间状态的 TOM-CC 在其平均位置附近约 ±60 nm 范围内摆动。基于完全开放状态和中间状态荧光信号的位置精度³⁷ 在 5 nm 至 10 nm 之间。（B）OmpF 的荧光振幅轨迹（上图）及其对应的轨迹图（下图）。无论 OmpF 处于运动状态还是被捕获状态，均仅显示一个强度水平。对应于分子被捕获时间段的轨迹片段以灰色标出。请点击此处查看此图的放大版本。

缓冲液	试剂浓度			体积
A1*	20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 % (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 10% (v/v) 甘油, 300 mM NaCl, 和 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF)			100 mL
A2*	20 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1% (w/v) DDM, 10% (v/v) 甘油, 1 M 咪唑, 和 1 mM PMSF			100 mL
B1*	20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 2% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)			100 mL
B2*	20 mM HEPES pH 7.2, 0.1% (w/v) DDM, 1 M KCl, 2% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO)			100 mL
* 使用前需脱气并经 0.22 μm 滤膜过滤。

表1：TOM-CC 分离用缓冲溶液。

缓冲液	试剂浓度			体积
LB*	1% (w/v) 胰蛋白胨、1% (w/v) NaCl 和 0.5% (w/v) 酵母提取物			1100 mL
C1	2 mM MgCl2、约 750 单位 DNase 以及 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）			20 mL
C2	50 mM Tris-HCl，pH 7.5			50 mL
C3	4% (w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS）、2 mM β-巯基乙醇和 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）			50 mL
C4	2% (w/v) SDS、500 mM NaCl 和 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）			50 mL
C5	0.5% (w/v) 辛基聚氧乙烯醚（octyl POE）、1 mM EDTA 和 20 mM Tris（pH 8.5）			1000 mL
* 使用前灭菌。

表2：OmpF 分离用缓冲溶液。

讨论

本文介绍的实验方案旨在利用单分子全内反射荧光显微镜，通过DIB膜研究侧向离子通道运动与通道功能之间的相互作用。为了获得最佳数据，制备稳定且含有尽可能多分离良好的通道的DIB膜至关重要，这是获取可被充分分析的单个粒子时间序列的前提。

需要优化的关键参数包括脂质的选择、油相中的脂质浓度，以及水相液滴中蛋白质和去垢剂的浓度。所使用的脂质具有特殊性，因其在低温下无明显的相变。DPhPC 是一种常用于构建稳定膜系统的脂质⁴⁰。原则上，任何在低温下仍能维持其流动性环境的脂质均可能适用于此用途。此外，该脂质应不易被氧化。液滴中的去垢剂浓度应尽可能低，以避免膜破裂。通常在去垢剂浓度低于临界胶束浓度（cmc）时，可实现稳定的膜结构和良好的蛋白质整合效率，前提是膜蛋白不会发生沉淀。

如果DIB膜不能耐受特定去垢剂^21,41，或者当蛋白质无法从低去污剂溶液中直接整合到DIB膜时，可先将蛋白通道重构至小型单层脂质体（SUVs）中，再从液滴侧使SUVs与DIB膜融合，该方法已成功应用于 E. coli MscL⁴²有时，由于油相中的脂质浓度过低，无法形成DIB膜。为防止DIB膜破裂，还应注意水凝胶与液滴之间的渗透压必须精确平衡，且不能影响Ca²⁺-flux 来自 顺式 到 转 过度。优化琼脂糖的厚度和孔径大小对于观察膜蛋白的扩散似乎至关重要。应避免琼脂糖层的任何干燥。厚度可使用原子力显微镜测定。¹⁷通过调整琼脂糖浓度、体积以及旋涂过程中的旋转速度，可优化水凝胶的孔径大小和厚度。但需注意，水凝胶层的厚度会影响成像对比度。为在DIBs中捕获膜蛋白，可将普通琼脂糖水凝胶替换为定制合成的非交联、镍-NTA修饰的低熔点琼脂糖，以实现对目标蛋白的捕获。 通过 一个His标签¹⁷过高的荧光背景通常由DIB膜破裂引起。对于多孔培养板而言，这一问题尤为突出，因为Ca²⁺-敏感染料扩散进入水凝胶。此时应避免使用相邻的孔。Ca的荧光漂白²⁺- 敏感性染料在膜上方不应成为显著的限制因素，因为它会被液滴主体中未激发的染料所置换（图3A）位于TIRF隐逝场之外。该蛋白质的定位精度由斑点拟合的准确度和像素大小决定。

微弱的荧光信号可能是由于通过通道的 Ca²⁺ 流量较低所致。可能的原因包括：(i) TIRF 设置不准确（例如激光强度），(ii) 跨膜的渗透性 Ca²⁺ 压力，或 (iii) 通道本身的 Ca²⁺ 通透性过低。针对第一个问题，需要优化激光强度、TIRF 角度和相机增益。后两个问题可通过在膜两侧施加电势来克服^2,43。然而，施加外部电压可能扭曲实验结果，因为电学效应可能影响那些实际上不受电压调控的配体门控或机械敏感性离子通道的开放状态。此类通道的例子包括线粒体蛋白转运酶 TOM-CC²⁷ 及其形成通道的亚基 Tom40^26,44,45,46。最后需要指出的是，将膜蛋白以特定方向插入 DIB 膜以实现预期功能具有较大挑战性，相关定量研究极为罕见^47,48。在某些情况下，整合蛋白的方向是随机的。这对于膜蛋白研究而言是一个严重问题，因为某些膜蛋白仅在膜的一侧被激活。

全内反射荧光显微镜（TIRF）是一种研究平面支撑膜中单分子事件的有力方法⁴⁹。相关实例包括利用该技术阐明通道蛋白（如α-溶血素⁵⁰、产气荚膜梭菌溶素O⁵¹和OmpG⁵²）的组装与折叠途径，这些研究同时结合了FRET作为辅助技术。此外，机械敏感性离子通道MscL的激活此前已通过电流测量方法，在机械刺激支撑的DIB双层膜系统中得到研究⁴²。基于上述工作，未来的研究可将本文所述平台与单分子FRET实验相结合，以光学方式在单分子水平上研究机械敏感性通道¹⁷。通过向液滴中注入缓冲液、拉伸内层DIB单层膜，或靶向结合单个通道至底层水凝胶，可进一步研究不仅响应膜张力和/或曲率的机械激活通道的物理机制——此类通道包括MscL和MscS、双孔域K⁺通道TREK-1、TREK-2和TRAAK，以及PIEZO通道（综述见⁵³）——还可研究通道与细胞骨架的局部结合，正如在触觉敏感离子通道NOMPC中所展示的那样^54,55。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids	850356C
100x 油镜 Apochromat N.A. 1.49	Nikon	MRD01991	TIRF 显微镜
10x 霍夫曼调制反差物镜 NA 0.25	Nikon		用于评估 DIB 膜形成的显微镜
10x 物镜 N.A. 0.25	Nikon	MRL00102	TIRF 显微镜
40x 霍夫曼调制反差物镜 NA 0.55	Nikon		用于评估 DIB 膜形成的显微镜
488 nm 激光器，100 mW	Visitron		TIRF 显微镜
胶带
Äkta pure	Cytiva		蛋白质纯化系统
Bradford 检测试剂盒，Pierce	Thermo Fisher	23236
CaCl2	Roth	5239.2
Chelax 100 树脂	Biorad	143-2832
氯仿	Sigma-Aldrich	MC1024452500
透析盒 Slide-A-Lyzer 20 k MWCO	Thermo Fisher	87735
DIB 腔室	定制		用于 DIB 膜的 PMMA 腔室
数字功率计和能量控制台	Thorlabs	PM100D	激光功率计
二甲基亚砜	Roth	4720.1
双蒸 H2O
Eclipse TS 100 霍夫曼调制反差显微镜	Nikon		用于评估 DIB 膜形成的显微镜
EDTA	Roth	8042.2
EMCCD 相机 iXon Ultra 897	Andor		TIRF 显微镜
乙醇	Sigma-Aldrich	32205-M
固定角转子 Ti70	Beckman Coulter
Fluo-8, CalciFluorTM	Santa Cruz Biotechnology	SC-362561	Ca2+敏感染料
法国压细胞破碎均质器	Igneus	Igneus 40000 psi
GFP 滤光片	AHF		用于白光光源落射荧光激发 DIB 膜的滤光片设置
玻璃毛细管	World Precision Instruments	4878
玻璃盖玻片 40 mm x 24 mm x 0.13 mm	Roth	1870.2
甘油	Roth	3783.2
Hamilton 注射器 10 mL	Roth	X033.1
Hamilton 注射器 100 mL	Roth	X049.1
Hamilton 注射器 500 mL	Roth	EY49.1
加热块	Eppendorf	Thermomixer comfort
加热板	Minitube	HT200
Hepes	Roth	9205.3
十六烷	Sigma-Aldrich	296317
His Trap HP 1 mL	Cytiva	29051021	Ni-NTA 柱
咪唑	Sigma-Aldrich	1.04716.1000
KCl	Honeywell	10314243
KLM 旋涂仪	Schaefer Tec	SCV-10
List medical L/M-3P-A 垂直移液器拉制仪	Artisan Technology Group	57761-1
低熔点琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414
M8 体视显微镜	Wild		体视显微镜
Matlab	MathWorks	R2022a
甲醇	Sigma-Aldrich	34860
MicroFil 移液器吸头	World Precision Instruments	MF34G-5
N2 气体
NaCl	Roth	3957.1
Nanoliter 2010 注射器	World Precision Instruments	Nanoliter 2010
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Glycon Biochemicals	D97002-C
Ni-NTA 琼脂糖，非交联型	Cube Biotech	124115393	定制
NIS-Elements AR 软件	Nikon	MQS31100/MQS42560/MQS42580/MQS42780/MQS41930	成像软件
n-辛基-聚氧乙烯	Sigma-Aldrich	40530
O2 气体
苯甲基磺酰氟	Roth	6367.3
光电二极管传感器  Si，400 - 1100 nm，500 mW	Thorlabs	S130C	激光功率计传感器
等离子清洗机	Diener Electronics	Zepto
制备型超速离心机 Optima	Beckman Coulter
四通道 TIRF 滤光片 446/523/600/677 HC	AHF		用于 488 nm 激光激发 DIB 膜的滤光片设置
Resource Q 1 mL	Cytiva	17117701	阴离子交换柱
硅油 AR 20	Sigma-Aldrich	10836
十二烷基硫酸钠	Roth	2326.2
Super LoLux 相机	JVC		体视显微镜
热振荡器	Gerhardt	THL 500/1
Ti-E 荧光显微镜	Nikon	MEA53100
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	9090.3
胰蛋白胨	Roth	8952.2
超声波清洗仪	Bandelin Sonorex	RK 100
真空泵	Vacuubrand	MD 4C NT
落射荧光照明用白光光源（100 W）	Nikon	MBF72655	TIRF 显微镜
酵母提取物	Roth	2363.2
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148