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中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

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DOI：

10.3791/64971

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2023年6月2日

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

本文内容

摘要

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。

摘要

中性粒细胞是人体的第一道防线，也是最丰富的白细胞类型。这些效应细胞具有吞噬作用、呼吸爆发等功能，并可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以清除微生物。近年来对中性粒细胞代谢活性的新认识挑战了早期认为其主要依赖糖酵解的观点。精确测定中性粒细胞的代谢活性，有助于揭示其在生理条件和疾病状态下不同的代谢需求，包括三羧酸循环（TCA循环，又称Krebs循环）、氧化磷酸化（OXPHOS）、磷酸戊糖途径（PPP）以及脂肪酸氧化（FAO）。本文介绍了一种逐步操作方案及前期准备要求，利用代谢外流分析仪通过代谢通量分析技术，测定小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血液来源中性粒细胞以及类中性粒细胞的HL60细胞系的氧消耗率（OCR），作为线粒体呼吸的指标。该方法可用于定量分析中性粒细胞在正常和疾病状态下的线粒体功能。

引言

线粒体在细胞生物能量学中起着重要作用，通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。此外，线粒体的功能还涉及活性氧的生成与解毒、胞质和线粒体基质钙离子的调控、细胞合成、分解代谢以及细胞内代谢物的转运1。线粒体呼吸对所有细胞都至关重要，其功能障碍可能导致代谢异常2，包括心血管疾病3以及多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性4、帕金森病和阿尔茨海默病5，以及腓骨肌萎缩症2A型（CMT2A）6。

对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，其线粒体数量相对较少7，且主要依赖糖酵解产生能量，因为线粒体呼吸速率极低8。然而，线粒体对中性粒细胞的功能至关重要，例如趋化性9和凋亡10,11,12。先前一项研究揭示，人中性粒细胞中存在复杂的线粒体网络，并具有较高的膜电位。线粒体膜电位的丧失是中性粒细胞凋亡的早期指标10。使用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理后，趋化性受到显著抑制，同时线粒体形态也发生改变9,10。

尽管中性粒细胞的主要能量来源是糖酵解，但线粒体通过为嘌呤能信号传导的第一阶段提供能量，启动了中性粒细胞的活化，从而促进Ca2+信号传导，放大线粒体ATP的生成，并启动中性粒细胞的功能反应13。线粒体呼吸链功能障碍会导致毒性活性氧（ROS）的过度产生，进而引发致病性损伤14,15,16。NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成过程）是中性粒细胞的一项关键特性，有助于其抵抗病原体17，同时也参与多种病理状态，包括癌症、血栓形成和自身免疫性疾病18。线粒体来源的ROS参与NETosis过程19，线粒体DNA可成为NETs的组成部分18，而线粒体稳态的改变会损害NETosis20,21,22,23,24。此外，在正常的分化或成熟过程中，中性粒细胞的代谢重编程会因糖酵解活性受限而发生逆转，转而依赖线粒体呼吸并动员细胞内脂质25,26。

代谢细胞外通量分析仪可连续监测并定量活细胞的线粒体呼吸和糖酵解。该分析仪采用96孔板格式的传感器微孔板和两种荧光探针，用于定量氧气（O2）浓度和pH值的变化。在检测过程中，传感器微孔板位于细胞单层上方，形成约200 nm高的微腔室。分析仪中的光纤束用于激发荧光探针并检测荧光强度的变化。O2浓度和pH值的实时变化会自动计算并显示为氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。传感器微孔板上有四个加样孔，可在检测过程中向每个孔加入最多四种化合物。本实验方案重点介绍利用代谢细胞外通量分析仪定量小鼠和人中性粒细胞以及类中性粒细胞HL60细胞的线粒体呼吸。

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方案

在获得知情同意后，根据康涅狄格大学健康中心机构审查委员会（IRB）批准，从健康人类供体采集肝素抗凝全血样本，该研究符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有动物实验均遵循康涅狄格大学健康中心动物护理与使用委员会（IACUC）的指南，并根据美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中规定的要求，获得康涅狄格大学健康中心IACUC对啮齿类动物使用的批准。本研究使用6周龄雄性C57BL/6小鼠。

1. 代谢胞外通量检测用96孔板的制备

  1. 将用于代谢细胞外通量测定的传感器微孔板置于特制的96孔板上方。轻轻抬起传感器微孔板进行水合处理，并向下方96孔板的每个孔中加入200 µL校准缓冲液。将加有校准缓冲液的传感器微孔板置于无CO2、湿润、37 °C的培养箱中孵育过夜，以完成水合。
  2. 根据细胞类型，使用特定的包被方法处理培养板，以确保细胞贴壁。对于人中性粒细胞、未分化及分化后的HL60细胞，使用含有50 µL浓度为5 µg/mL的纯化小鼠抗人CD18抗体（克隆号TS1/18）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS），在4 °C条件下对96孔板包被过夜。对于小鼠中性粒细胞，使用pH 8.0条件下含25 µL浓度为22.4 µg/mL Cell Tak的0.1 M NaHCO3溶液，在室温（RT）下包被20分钟。
  3. 用200 µL无菌PBS洗涤培养板两次。
  4. 在细胞接种过程中，向细胞培养板的角落孔（A1、A12、H1和H12）加入完全培养基（不接种细胞），用于培养板中的背景信号校正。
    ​注意：包被和校准过程中的蒸发可能影响校准缓冲液体积及归一化结果。建议使用盛有经无菌水润湿的纸巾的托盘或密闭腔室，并将含校准缓冲液的培养板置于其上方，以防止蒸发。

2. 细胞的准备与接种

  1. 测定培养基的制备
    1. 通过向 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 1 mM 丙酮酸、10 mM 葡萄糖和 2 mM 谷氨酰胺，制备测定培养基。
  2. 从小鼠骨髓中分离中性粒细胞
    1. 根据制造商说明书，使用小鼠中性粒细胞富集试剂盒从小鼠骨髓中分离中性粒细胞。
    2. 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（12.5 mg/kg）对小鼠进行麻醉，随后通过颈椎脱位法处死小鼠。
    3. 收获股骨和胫骨，方法如前所述27。简而言之，切开皮肤以暴露腿部肌肉组织，切断髋关节将腿部从身体上取下，然后去除肌肉以收集股骨和胫骨。
    4. 剪去股骨和胫骨的较小末端。将剪断的一端朝下放入底部带有两个经 25 G 注射器针头穿孔的 0.5 mL 离心管中，并将该 0.5 mL 管置于一个 1.5 mL 离心管内（图 1A）。向 0.5 mL 管中加入 50 µL PBS，以防止骨髓细胞干燥。
    5. 在室温下以 5,900 × g 离心 15 秒，使骨髓沉降至 1.5 mL 管底部。用 1 mL DMEM 重悬骨髓细胞，加入试剂盒提供的 50 µL 大鼠血清，通过移液轻轻混匀，然后将细胞悬液转移至 5 mL 聚苯乙烯培养试管中。
    6. 加入试剂盒提供的 50 µL 富集混合液，在室温下孵育 15 分钟。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 用 1 mL DMEM 重悬细胞，加入试剂盒提供的 50 µL 生物素选择混合液，通过移液轻轻混匀，并在室温下孵育 15 分钟。
    8. 加入试剂盒提供的 150 µL 涡旋处理后的磁性颗粒，通过移液轻轻混匀，并在室温下孵育 10 分钟。
    9. 加入约 1.3 mL DMEM，通过移液轻轻混匀，将试管置于磁架上 3 分钟，然后连同磁铁一起倒置原试管，将含有纯化小鼠中性粒细胞的上清液转移至新的 5 mL 聚苯乙烯培养试管中。
    10. 在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。通过真空抽吸去除上清液后，用 1 mL 测定培养基重悬细胞。
    11. 使用血细胞计数板手动计数细胞。
    12. 通过添加测定培养基将细胞密度调整至 1.1 × 106 个细胞/mL，每孔接种 180 µL 小鼠中性粒细胞悬液（2 × 105 个细胞）至预先准备好的 96 孔板中（步骤 1.2–1.4），并在室温下以 300 × g 离心 3 分钟（无刹车），以确保细胞充分贴附于孔板底部。
    13. 将板置于无 CO2、加湿、37 °C 的培养箱中孵育 1 小时，使细胞与测定培养基预平衡。
      注：中性粒细胞的纯度对该测定至关重要，因其可能引入偏差。采用本方案进行的小鼠中性粒细胞分离纯度为 69.9%–88.7%。其他从小鼠骨髓中分离中性粒细胞的方法包括密度梯度离心法28。此外，市场上也有其他厂商提供的基于单克隆抗体负向磁选法的中性粒细胞分离试剂盒，这些抗体针对的是中性粒细胞不表达的抗原。
  3. 从外周血中分离人中性粒细胞
    1. 向 15 mL 离心管中加入 8 mL 多糖溶液，然后将 4 mL 外周血小心地铺加在多糖溶液上方，避免混合。
    2. 在 20 °C 下以 550 × g 离心 30 分钟，设置转子减速等级为 1。
      注：不同供体之间的中性粒细胞分离时间可能有所不同，最短为 30 分钟；若分离不成功，可能需要额外延长 10–20 分钟。
    3. 离心后观察血浆/血小板层与单个核细胞层的分离情况，如 图 1B 所示。使用 1 mL 移液器小心移除上层黄色液体（血浆和血小板）以及上层浑浊带（单个核细胞），注意不要扰动下层浑浊带（中性粒细胞）。
    4. 收集下层浑浊带及下方约 3–4 mL 清亮液体，转移至另一含有 10 mL PBS 的 15 mL 离心管中。
    5. 在 20 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟，并通过真空抽吸去除上清液。
    6. 用 5 mL PBS 重悬细胞，在 20 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 去除上清液后，用 1 mL 测定培养基重悬细胞。
    8. 使用血细胞计数板手动计数细胞。
      注：由于血液中的红细胞不含线粒体，因此红细胞污染不会影响线粒体应激测试，并且可防止中性粒细胞活化/启动29,30。但在细胞计数时需裂解红细胞以获得准确的中性粒细胞浓度。将 10 µL 细胞悬液加入 891 µL 去离子水中 10–30 秒以裂解红细胞，随后加入 99 µL 10× PBS 以平衡渗透压，避免中性粒细胞发生裂解。
    9. 通过添加测定培养基将细胞密度调整至 2.2 × 106 个细胞/mL，每孔接种 180 µL 人中性粒细胞（约 4 × 105 个）至预先准备好的 96 孔板中，并在室温下以 300 × g 离心 3 分钟（无刹车），以确保细胞充分贴附于孔板底部。
    10. 将板置于无 CO2、加湿、37 °C 的培养箱中孵育 1 小时，使细胞与测定培养基预平衡。
      注：中性粒细胞的纯度对该测定至关重要，因其可能引入偏差。人中性粒细胞分离的纯度为 86.6%–96.8%。其他从人血液中分离中性粒细胞的密度梯度离心方法包括 Percoll 分离法，以及 Ficoll 分离联合右旋糖酐沉降法31。
  4. HL60 细胞培养及向中性粒细胞方向的分化
    1. 将 HL60 细胞维持在含 10% 胎牛血清（FBS）、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素和 250 ng/mL 两性霉素 B 的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）-1640 培养基中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
    2. 为诱导向中性粒细胞方向分化，将 HL60 细胞（悬浮细胞）以 1 × 105 个细胞/mL 的密度接种于 T25 培养瓶中，使用含 10% FBS、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、250 ng/mL 两性霉素 B 和 1.3% 二甲基亚砜（DMSO）的 RPMI-1640 培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 6 天。
    3. 在测定当天，使用血细胞计数板手动计数细胞，将已分化或未分化的 HL60 细胞在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，用 DMEM 洗涤一次，然后用测定培养基重悬，使细胞密度达到 1.39 × 106 个细胞/mL。
    4. 每孔接种 180 µL 已分化或未分化的 HL60 细胞（约 2.5 × 105 个）至预先准备好的 96 孔板中，并在室温下以 300 × g 离心 3 分钟（无刹车），以确保细胞充分贴附于孔板底部。
    5. 将板置于无 CO2、加湿、37 °C 的培养箱中孵育 1 小时，使细胞与测定培养基预平衡。
      ​注：在进行下一步操作前，需使用显微镜确认细胞已完全贴壁。

小鼠骨髓和人血中性粒细胞分离的离心步骤示意图。
图1：骨髓细胞和中性粒细胞分离的示意图。（A）从小鼠中收获骨髓细胞，以及（B）从人血液中分离中性粒细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞类型每孔细胞数化合物/试剂工作液浓度注入各端口的体积孔内终浓度
小鼠中性粒细胞2 × 105Oligomycin25 µM20 µL2.5 µM
FCCP7.5 µM17.6 µL0.61 µM
Rotenone Antimycin A 混合物10 µM24 µL1 µM
人中性粒细胞4 × 105Oligomycin10 µM20 µL1 µM
FCCP12.5 µM22 µL1.25 µM
Rotenone Antimycin A 混合物10 µM24 µL1 µM
未分化或已分化的 HL60 细胞2.5 × 105Oligomycin25 µM20 µL2.5 µM
FCCP15 µM22 µL1.5 µM
Rotenone Antimycin A 混合物10 µM24 µL1 µM

表1：线粒体应激测试的细胞数量和试剂浓度。

3. 线粒体应激测试试剂盒中化合物的配制

  1. 打开线粒体应激检测试剂盒并配制试剂。
    注意：用于小鼠中性粒细胞、人中性粒细胞和HL60细胞的寡霉素、羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙（FCCP）以及鱼藤酮/抗霉素A混合物的工作溶液浓度、向孔中注射的体积及孔内终浓度详见表1。
    1. 通过将寡霉素用630 µL检测培养基重悬，配制100 µM的寡霉素储备液。
      注意：建议当天使用储备液。
      1. 通过将630 µL储备液与1,890 µL检测培养基混合，配制用于小鼠中性粒细胞和HL60细胞检测的25 µM寡霉素工作液。
      2. 通过将300 µL储备液与2,700 µL检测培养基混合，配制用于人中性粒细胞检测的10 µM寡霉素工作液。
        注意：寡霉素与Fo/F1 ATP酶（ATP合酶）的Fo基底亚基结合，阻止质子重新进入线粒体，从而抑制ATP合成32。这显著减少了电子传递链中的电子流和耗氧率（OCR）。然而，由于质子通过线粒体内膜发生泄漏，电子流不会完全停止33。
    2. 通过将FCCP用720 µL检测培养基重悬，配制100 µM的FCCP储备液。
      1. 通过将300 µL储备液与3,700 µL检测培养基混合，配制用于小鼠中性粒细胞检测的7.5 µM工作液。
      2. 通过将375 µL储备液与2,625 µL检测培养基混合，配制用于人中性粒细胞检测的12.5 µM工作液。
      3. 通过将720 µL储备液与4,080 µL检测培养基混合，配制用于HL60细胞检测的15 µM工作液。
        注意：加入FCCP可揭示线粒体利用氧化磷酸化（OXPHOS）的最大能力。FCCP是一种脂溶性弱酸，可穿透线粒体膜，导致跨膜电位消散。它使线粒体内膜上的质子梯度放电，并将质子流从Fo/F1 ATP合酶上转移，从而引起线粒体解偶联。这种解偶联效应会急剧增加线粒体的氧气消耗，以维持质子梯度34。
    3. 通过将鱼藤酮/抗霉素A混合物用540 µL检测培养基重悬，配制50 µM的鱼藤酮/抗霉素A储备液。
      1. 通过将540 µL储备液与2,160 µL检测培养基混合，为所有检测配制10 µM的鱼藤酮/抗霉素A工作液。
        注意：鱼藤酮通过抑制复合物I中铁硫中心向泛醌的电子传递来阻断复合物I，而抗霉素A则阻断电子传递链中的复合物III，导致OXPHOS受阻并显著减少ATP合成35。因此，该处理可揭示非线粒体呼吸36,37。
  2. 将试剂加入检测板的加样孔中；将配制好的寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A混合物分别加入板上的A、B和C孔，用于后续注射（图2）。使用随检测板提供的模板插件，以辅助将试剂准确加入各孔。未使用的孔中加入20 µL检测培养基。
    1. 对于小鼠中性粒细胞检测，向A孔加入20 µL寡霉素（25 µM；每孔96孔板初始含有180 µL检测培养基，因此终浓度为2.5 µM）；向B孔加入17.6 µL FCCP（7.5 µM；终浓度约为0.61 µM）；向C孔加入24 µL鱼藤酮/抗霉素A混合物（10 µM；终浓度约为1 µM）。
    2. 对于人中性粒细胞检测，向A孔加入20 µL寡霉素（10 µM；每孔96孔板初始含有180 µL检测培养基，因此终浓度为1 µM）；向B孔加入22 µL FCCP（12.5 µM；终浓度约为1.25 µM）；向C孔加入24 µL鱼藤酮/抗霉素A混合物（10 µM；终浓度约为1 µM）。
    3. 对于HL60和dHL60细胞检测，向A孔加入20 µL寡霉素（25 µM；每孔96孔板初始含有180 µL检测培养基，因此终浓度为2.5 µM）；向B孔加入22 µL FCCP（15 µM；终浓度约为1.5 µM）；向C孔加入24 µL鱼藤酮/抗霉素A混合物（10 µM；终浓度约为1 µM）。
      注意：使用移液器将药物溶液加入孔中时，避免触碰孔底。加样后切勿敲击检测板，以防液体泄漏，因为液体依靠毛细作用力保持在孔内。培养板的背景孔以及传感器检测板上的对应加样孔应加入检测培养基或与样本孔相同的试剂，以校正试剂对背景值的影响。必须在不将检测板从含有校准液的工具板上抬起的情况下，将试剂加入相应孔中，以避免引入气泡。如图2所示，将最后一个孔用培养基填满。

微孔板检测布局；酶分析；移液处理；药物测试设置。
图 2：线粒体应激检测试剂盒及其加样孔。 该图像显示了线粒体应激检测试剂盒的整体结构，以及放大图展示将不同药物/培养基加入各加样孔的操作。缩写：FCCP = 羰基氰化物p-三氟甲氧基苯腙。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 进行线粒体应激检测

  1. 打开代谢分析仪和计算机，启动 Wave 软件，点击 Heater On，提前至少 5 小时将仪器预热至 37 °C。当温度达到设定值后，Wave 软件左下角将显示 ready。
  2. 在软件中打开线粒体应激检测试剂盒的模板。点击顶部菜单栏中的 Group Definition。
  3. 在左侧分别预设每一项定义，例如加样策略、预处理、检测培养基以及（所用生物材料）细胞类型。
  4. 点击左侧的 injection strategies ，然后点击 Add ，将加样条件命名为 Human neutrophils/Mouse neutrophils/HL60。通过依次点击选择 port A-D，点击 Add compound，输入相应浓度的 Oligomycin/FCCP/Rotenone Antimycin A（见表 1）。
  5. 点击左侧的 pretreatment ，然后点击 Add，分别命名为 CD18 和 Cell Tak。点击左侧的 biomaterial ，然后点击 Add ，分别命名为 Human neutrophils、Mouse neutrophils 和 HL60/dHL60，并设置 seeding density（接种密度）。
  6. 通过点击 Add Group （例如用于人中性粒细胞检测）并点击其下方的定义（例如，Injection strategies 按 表 1-人中性粒细胞 设置，Pretreatment 设为 CD18，cell type 设为 Human neutrophils）来定义分组。
  7. 点击顶部菜单中的 Plate Map ，查看所有分组，左侧为定义，右侧为板图。通过拖放方式将每个孔分配至相应分组，同时将四个角孔保留为 Background （默认设置）。
  8. 点击顶部菜单中的 Protocol 设置实验方案，定义三个周期的基线、寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 混合物检测程序，设置 Mix 时间为 3 分钟，Rest 时间为 0 分钟，Measurement 时间为 7 分钟。
  9. 进入 Run Assay 页面，填写项目摘要信息以供参考，然后点击 Start Run。
  10. 指定文件保存位置，以便检测完成后自动保存所有结果。
  11. 在检测自动加载后，等待托盘打开，放入传感器微孔板和含有 200 µL 校准液的微孔板（步骤 1.1）。确保微孔板条形码方向朝右。点击 I'm ready 开始校准，过程约需 20 分钟。
  12. 校准完成后，点击 Open Tray。将微孔板更换为已接种细胞的微孔板，然后点击 Load Cell Plate 继续进行检测。
  13. 检测完成后，数据将自动保存。点击 View results，并将结果导出为电子表格或其他分析软件可读的文件格式。
  14. 对数据进行绘图和分析（图 3 和 图 4）。
  15. 计算呼吸参数，包括基础线粒体呼吸、质子泄漏相关呼吸、ATP 相关呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力以及非线粒体呼吸（图 4A）38,39,40,41。
    1. 通过从加入寡霉素前的氧耗率（OCR）值中减去加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后的 OCR 值，计算基础线粒体呼吸（图 4A, a）。
    2. 通过从加入寡霉素后的 OCR 值中减去加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后的 OCR 值，计算质子泄漏相关呼吸（图 4A, b）。
    3. 通过计算基础线粒体呼吸与质子泄漏相关呼吸之间的差值，估算 ATP 相关呼吸。即用加入寡霉素前的首个 OCR 值减去加入寡霉素后的首个 OCR 值（图 4A, c）。
    4. 最大呼吸是指细胞在加入 FCCP 后所能达到的最大呼吸速率。通过从加入 FCCP 后的 OCR 值中减去加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后的 OCR 值来计算（图 4A, d）。
    5. 备用呼吸能力是指细胞通过氧化磷酸化（OXPHOS）满足更高能量需求的能力。通过计算最大呼吸与基础线粒体呼吸之间的差值得出（图 4A, e）。
    6. 非线粒体呼吸是指由非线粒体来源消耗的氧气量。在加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后进行测量（图 4A, f）。
  16. 使用 Student's t-检验对未分化和分化 HL60 细胞的不同呼吸参数进行统计学分析。以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
    注意：OCR 或 ECAR 值低于零的重复样本被视为样品制备、化合物加样或测量过程中出现误差，应从后续分析中剔除。

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结果

代表性氧消耗率（OCR）动态变化显示了小鼠中性粒细胞（图3A）、人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化HL60细胞（图3C）在线粒体呼吸过程中对寡霉素、FCCP以及鱼藤酮/抗霉素A混合物的响应。在所有细胞中，寡霉素通过抑制ATP合酶的质子通道而降低OCR值；FCCP通过增加电子流和氧气消耗以维持膜电位，从而恢复OCR值并实现最大呼吸速率；而鱼藤酮/抗霉素A混合物则通过阻断电子传递链中的复合物I和III，完全消除线粒体呼吸。

我们观察到，在中性粒细胞定向分化后，HL60 细胞的线粒体呼吸作用降低（图 3C）。在定量分析上述不同的呼吸参数后发现，分化后的 HL60 细胞其基础线粒体呼吸（图 4B）、质子泄漏相关呼吸（图 4C）、AT...

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讨论

使用代谢外流分析仪检测中性粒细胞线粒体呼吸的标准方法受到多种因素的限制，包括细胞数量、细胞生长状态和活力。在此检测中，不同种类和来源的细胞对每种化合物的浓度需求各不相同。 寡霉素以及鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中通常使用相似的浓度。然而，由于不同细胞的FCCP诱导最大呼吸速率存在差异，因此需要对FCCP进行仔细的滴定以优化其浓度42。在优化过程中，建议采用逐步添加FCCP的方式。尽管代谢外流分析仪可在气压作用下将药物注入检测板43，但由于某些线粒体复合物抑制剂难以穿透细胞膜，因此与分离的线粒体相比，其在完整细胞中的应用受到限制44。向加样孔中加载试剂时必须谨慎操作，以避免交叉污染。培养基中的底物浓度（如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺）也可能影响线粒体活性，需进行优化。

除了药物浓度外，细胞接种密度也是获得良好OCR值的关键参数。最佳细胞接种密度因细胞类型而异，建议在预实验中使用不同的接种密度来测试测量效果。准确的细胞计数对于降低组间...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

我们感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Anthony T. Vella 博士和 Federica Aglianoin 博士在使用代谢细胞外通量分析仪方面的培训，以及康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Lynn Puddington 博士对仪器使用的支持。我们感谢康涅狄格大学医学院的 Geneva Hargis 博士在本论文的科学写作与编辑方面提供的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院下属国家心脏、肺和血液研究所（R01HL145454）、国家普通医学科学研究所（R35GM147713 和 P20GM139763）、康涅狄格大学健康中心启动资金以及美国免疫学家协会职业重返研究员奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
37 °C 非 CO2 培养箱PrecisionEconomy Model 2EG仪器
Biorender软件应用
离心机EppendorfModel 5810R仪器
Corning Cell-Tak 细胞和组织粘附剂Corning102416-100试剂
EasySep 磁力架STEMCELL18000磁铁
EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒STEMCELL19762A试剂
Graphpad Prism 9软件应用
人血清白蛋白溶液 (25%)GeminiBio800-120试剂
氯胺酮 (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10麻醉剂
PBSCytivaSH30256.01试剂
板式转子桶EppendorfUL155配件
PolymorphPrepPROGEN1895 (之前为 1114683)多糖溶液
纯化小鼠抗人 CD18 抗体Biolegend302102克隆 TS1/18
RPMI 1640 培养基Gibco11-875-093试剂
Seahorse 代谢细胞外通量分析仪AgilentXFe96仪器
Seahorse XF 细胞线粒体应激检测试剂盒Agilent103015-100线粒体应激检测试剂盒
摆动式转子EppendorfA-4-62转子
Vactrap 2 真空捕集器Fox Lifesciences3052101-FLS仪器
Wave软件应用
XF 1.0 M 葡萄糖溶液Agilent103577-100试剂
XF 100 mM 丙酮酸溶液Agilent103578-100试剂
XF 200 mM 谷氨酰胺溶液Agilent103579-100试剂
XF DMEM 培养基Agilent103575-100试剂
XFe96 FluxPakAgilent102601-100材料
赛拉嗪 (AnaSed 注射液)DAILYMEDNDC 59399-110-20麻醉剂

参考文献

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