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中性粒细胞线粒体生物能量谱的实时测量

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DOI：

10.3791/64971

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2023年6月2日

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

本文内容

摘要

我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。

摘要

中性粒细胞是人体的第一道防线，也是最丰富的白细胞类型。这些效应细胞具有吞噬作用、呼吸爆发等功能，并可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以清除微生物。近年来对中性粒细胞代谢活性的新认识挑战了早期认为其主要依赖糖酵解的观点。精确测定中性粒细胞的代谢活性，有助于揭示其在生理条件和疾病状态下不同的代谢需求，包括三羧酸循环（TCA循环，又称Krebs循环）、氧化磷酸化（OXPHOS）、磷酸戊糖途径（PPP）以及脂肪酸氧化（FAO）。本文介绍了一种逐步操作方案及前期准备要求，利用代谢外流分析仪通过代谢通量分析技术，测定小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血液来源中性粒细胞以及类中性粒细胞的HL60细胞系的氧消耗率（OCR），作为线粒体呼吸的指标。该方法可用于定量分析中性粒细胞在正常和疾病状态下的线粒体功能。

引言

线粒体在细胞生物能量学中起着重要作用，通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。此外，线粒体的功能还涉及活性氧的生成与解毒、胞质和线粒体基质钙离子的调控、细胞合成、分解代谢以及细胞内代谢物的转运1。线粒体呼吸对所有细胞都至关重要，其功能障碍可能导致代谢异常2，包括心血管疾病3以及多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性4、帕金森病和阿尔茨海默病5，以及腓骨肌萎缩症2A型（CMT2A）6。

对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，其线粒体数量相对较少7，且主要依赖糖酵解产生能量，因为线粒体呼吸速率极低8。然而，线粒体对中性粒细胞的功能至关重要，例如趋化性9和凋亡10,11,12。先前一项研究揭示，人中性粒细胞中存在复杂的线粒体网络，并具有较高的膜电位。线粒体膜电位的丧失是中性粒细胞凋亡的早期指标10。使用线粒体解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）处理后，趋化性受到显著抑制，同时线粒体形态也发生改变9,10。

尽管中性粒细胞的主要能量来源是糖酵解，但线粒体通过为嘌呤能信号传导的第一阶段提供能量，启动了中性粒细胞的活化，从而促进Ca2+信号传导，放大线粒体ATP的生成，并启动中性粒细胞的功能反应13。线粒体呼吸链功能障碍会导致毒性活性氧（ROS）的过度产生，进而引发致病性损伤14,15,16。NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成过程）是中性粒细胞的一项关键特性，有助于其抵抗病原体17，同时也参与多种病理状态，包括癌症、血栓形成和自身免疫性疾病18。线粒体来源的ROS参与NETosis过程19，线粒体DNA可成为NETs的组成部分18，而线粒体稳态的改变会损害NETosis20,21,22,23,24。此外，在正常的分化或成熟过程中，中性粒细胞的代谢重编程会因糖酵解活性受限而发生逆转，转而依赖线粒体呼吸并动员细胞内脂质25,26。

代谢细胞外通量分析仪可连续监测并定量活细胞的线粒体呼吸和糖酵解。该分析仪采用96孔板格式的传感器微孔板和两种荧光探针，用于定量氧气（O2）浓度和pH值的变化。在检测过程中，传感器微孔板位于细胞单层上方，形成约200 nm高的微腔室。分析仪中的光纤束用于激发荧光探针并检测荧光强度的变化。O2浓度和pH值的实时变化会自动计算并显示为氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）。传感器微孔板上有四个加样孔，可在检测过程中向每个孔加入最多四种化合物。本实验方案重点介绍利用代谢细胞外通量分析仪定量小鼠和人中性粒细胞以及类中性粒细胞HL60细胞的线粒体呼吸。

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方案

在获得知情同意后，根据康涅狄格大学健康中心机构审查委员会（IRB）批准的程序采集健康人类供者的肝素抗凝全血样本，该程序符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有动物实验均遵循康涅狄格大学健康中心动物护理与使用委员会（IACUC）的指导原则，并根据美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理与使用指南》中规定的要求，获得康涅狄格大学健康中心IACUC对啮齿类动物使用的批准。本研究使用6周龄的雄性C57BL/6小鼠。

1. 代谢胞外通量检测用96孔板的制备

  1. 将专为代谢细胞外通量测定设计的96孔板上的传感器微孔板小心抬起进行水合处理，并向底层板的每个孔中加入200 µL校准缓冲液。将微孔板盖在含有校准液的板上，置于无CO2、湿润、37 °C的培养箱中过夜，以完成水合。
  2. 根据细胞类型，使用特定的包被方法处理培养板，以确保细胞贴壁。对于人中性粒细胞——未分化和已分化的HL60细胞——在4 °C条件下，用含有50 µL浓度为5 µg/mL的纯化小鼠抗人CD18抗体（克隆号TS1/18）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）包被96孔板，过夜孵育。对于小鼠中性粒细胞，在室温下用25 µL浓度为22.4 µg/mL、pH 8.0的Cell Tak溶液（溶于0.1 M NaHCO3）包被96孔板，孵育20分钟。
  3. 用200 µL无菌PBS洗涤板两次。
  4. 在细胞接种过程中，向细胞培养板的角落孔（A1、A12、H1和H12）加入完全培养基（不加细胞），用于培养板中的背景校正。
    ​注意：包被和校准过程中的蒸发可能影响校准液的体积及归一化结果。建议使用盛有经无菌水润湿的纸巾的托盘或密闭腔室，并将含校准液的板置于其上方，以防止蒸发。

2. 细胞的准备与接种

  1. 测定培养基的制备
    1. 通过向杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 1 mM 丙酮酸、10 mM 葡萄糖和 2 mM 谷氨酰胺，制备测定培养基。
  2. 从小鼠骨髓中分离中性粒细胞
    1. 根据试剂盒说明书，使用小鼠中性粒细胞富集试剂盒从小鼠骨髓中分离中性粒细胞。
    2. 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（12.5 mg/kg）麻醉小鼠，随后通过颈椎脱位处死小鼠。
    3. 采集股骨和胫骨，方法如前所述27。简言之，切开皮肤暴露腿部肌肉组织，切断髋关节以取下整条腿，随后去除肌肉组织以收集股骨和胫骨。
    4. 切除股骨和胫骨较小的一端。将切口端朝下放入底部有两个25 G针头穿孔的0.5 mL离心管中，并将该管置于1.5 mL离心管内（图1A）。向0.5 mL管中加入50 µL PBS，防止骨髓细胞干燥。
    5. 在室温下以5,900 × g 离心15秒，使骨髓沉降至1.5 mL管底部。用1 mL DMEM重悬骨髓细胞，加入试剂盒中的50 µL大鼠血清，轻轻吹打混匀，然后将细胞悬液转移至5 mL聚苯乙烯培养管中。
    6. 加入试剂盒提供的50 µL富集混合液，在室温下孵育15分钟。在室温下以300 × g 离心5分钟。
    7. 用1 mL DMEM重悬细胞，加入试剂盒提供的50 µL生物素筛选混合液，轻轻吹打混匀，并在室温下孵育15分钟。
    8. 加入试剂盒中充分涡旋的磁性颗粒150 µL，轻轻吹打混匀，并在室温下孵育10分钟。
    9. 加入约1.3 mL DMEM，轻轻吹打混匀，将管置于磁架上3分钟，通过倒置原管连同磁架一起操作，将含有纯化小鼠中性粒细胞的上清液转移至新的5 mL聚苯乙烯培养管中。
    10. 在室温下以300 × g 离心5分钟。真空抽吸去除上清液后，用1 mL测定培养基重悬细胞。
    11. 使用血细胞计数板手动计数细胞。
    12. 加入测定培养基将细胞密度调整至1.1 × 106 个细胞/mL，每孔接种180 µL小鼠中性粒细胞悬液（2 × 105 个细胞） 至已准备好的96孔板中（步骤1.2–1.4），并在室温下以300 × g 离心3分钟（无刹车），确保细胞充分贴附于孔底。
    13. 将96孔板置于无CO2、加湿、37 °C的培养箱中孵育1小时，使细胞与测定培养基预平衡。
      注：中性粒细胞的纯度对该测定至关重要，因其可能引入偏差。本方案所得小鼠中性粒细胞分离纯度为69.9%–88.7%。其他从小鼠骨髓中分离中性粒细胞的方法包括密度梯度离心法28。此外，市场上也有其他厂商提供的基于单克隆抗体负向磁选法的中性粒细胞分离试剂盒，这些抗体靶向不表达于中性粒细胞表面的抗原。
  3. 从外周血中分离人中性粒细胞
    1. 将8 mL多糖溶液加入15 mL离心管中，然后将4 mL外周血小心叠加于多糖溶液上方，避免混合。
    2. 在20 °C下以550 × g 离心30分钟，设置离心机减速等级为1。
      注：不同供体间中性粒细胞分离所需时间可能存在差异。最短时间为30分钟，若分离不完全，可能需要额外延长10–20分钟。
    3. 离心后观察血浆/血小板层与单个核细胞层的分离情况，如 图1B 所示。使用1 mL移液器小心吸除上层黄色液体（血浆和血小板）以及上层云雾状带（单个核细胞），注意勿扰动下层云雾状带（中性粒细胞）。
    4. 收集下层云雾状带及下方约3–4 mL澄清液体，转移至含有10 mL PBS的新的15 mL离心管中。
    5. 在20 °C下以400 × g 离心10分钟，通过真空抽吸去除上清液。
    6. 用5 mL PBS重悬细胞，在20 °C下以300 × g 离心5分钟。
    7. 去除上清液后，用1 mL测定培养基重悬细胞。
    8. 使用血细胞计数板手动计数细胞。
      注：由于血液中的红细胞不含线粒体，因此红细胞污染不会影响线粒体应激测试结果，反而有助于防止中性粒细胞活化/启动29,30。但在细胞计数时需裂解红细胞以获得准确的中性粒细胞浓度。取10 µL细胞悬液加入891 µL去离子水中10–30秒以裂解红细胞，随后加入99 µL 10× PBS以平衡渗透压，避免中性粒细胞破裂。
    9. 加入测定培养基将细胞密度调整至2.2 × 106 个细胞/mL，每孔接种180 µL人中性粒细胞（约4 × 105 个） 至已准备好的96孔板中，并在室温下以300 × g 离心3分钟（无刹车），确保细胞充分贴附于孔底。
    10. 将96孔板置于无CO2、加湿、37 °C的培养箱中孵育1小时，使细胞与测定培养基预平衡。
      注：中性粒细胞的纯度对该测定至关重要，因其可能引入偏差。人中性粒细胞分离纯度为86.6%–96.8%。其他从人外周血中分离中性粒细胞的密度梯度离心方法包括Percoll分离法，以及Ficoll分离联合右旋糖酐沉降法31。
  4. HL60细胞培养及向中性粒细胞定向分化
    1. 将HL60细胞维持在含10%胎牛血清（FBS）、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL链霉素和250 ng/mL两性霉素B的罗斯威尔帕克纪念研究所（RPMI）-1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养。
    2. 为诱导向中性粒细胞分化，将HL60细胞（悬浮细胞）以1 × 105 个细胞/mL的密度接种于T25培养瓶中，使用含10% FBS、100 µg/mL 青霉素、100 µg/mL链霉素、250 ng/mL两性霉素B和1.3%二甲基亚砜（DMSO）的RPMI-1640培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养6天。
    3. 测定当天，使用血细胞计数板手动计数细胞，将已分化或未分化的HL60细胞在室温下以300 × g 离心5分钟，用DMEM洗涤一次，再用测定培养基重悬，使细胞密度达到1.39 × 106 个细胞/mL。
    4. 每孔接种180 µL已分化或未分化的HL60细胞（约2.5 × 105 个） 至已准备好的96孔板中，并在室温下以300 × g 离心3分钟（无刹车），确保细胞充分贴附于孔底。
    5. 将96孔板置于无CO2、加湿、37 °C的培养箱中孵育1小时，使细胞与测定培养基预平衡。
      ​注：下一步操作前需使用显微镜确认细胞已完全贴壁。

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图1：骨髓细胞与中性粒细胞分离示意图。（A）从小鼠中获取骨髓细胞，以及（B）从人血液中分离中性粒细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞类型每孔细胞数化合物/试剂工作液浓度注入各端口的体积孔内终浓度
小鼠中性粒细胞2 × 105Oligomycin25 µM20 µL2.5 µM
FCCP7.5 µM17.6 µL0.61 µM
Rotenone Antimycin A 混合物10 µM24 µL1 µM
人中性粒细胞4 × 105Oligomycin10 µM20 µL1 µM
FCCP12.5 µM22 µL1.25 µM
Rotenone Antimycin A 混合物10 µM24 µL1 µM
未分化或已分化的 HL60 细胞2.5 × 105Oligomycin25 µM20 µL2.5 µM
FCCP15 µM22 µL1.5 µM
Rotenone Antimycin A 混合物10 µM24 µL1 µM

表1：线粒体应激测试的细胞数量和试剂浓度。

3. 线粒体应激测试试剂盒中化合物的制备

  1. 打开线粒体应激检测试剂盒并配制试剂。
    注意：寡霉素、羰基氰化物-p-三氟甲氧基苯腙（FCCP）以及鱼藤酮/抗霉素A混合物在小鼠中性粒细胞、人中性粒细胞和HL60细胞实验中所用的工作溶液浓度、加入孔中的注射体积及孔内终浓度详见表1。
    1. 通过将寡霉素用630 µL检测培养基重悬，配制100 µM的寡霉素储备液。
      注意：建议当天使用该储备液。
      1. 通过将630 µL储备液与1,890 µL检测培养基混合，配制用于小鼠中性粒细胞和HL60细胞检测的寡霉素工作液，获得25 µM的工作溶液。
      2. 通过将300 µL储备液与2,700 µL检测培养基混合，配制用于人中性粒细胞检测的寡霉素工作液，获得10 µM的工作溶液。
        注意：寡霉素结合Fo/F1 ATP酶（ATP合酶）的Fo基底亚基，阻止质子重新进入线粒体，从而抑制ATP合成32。这显著减少电子传递链中的电子流及耗氧率（OCR）。然而，由于质子可通过线粒体内膜发生泄漏，电子流不会完全停止33。
    2. 通过将FCCP用720 µL检测培养基重悬，配制100 µM的FCCP储备液。
      1. 通过将300 µL储备液与3,700 µL检测培养基混合，配制用于小鼠中性粒细胞检测的FCCP工作液，获得7.5 µM的工作溶液。
      2. 通过将375 µL储备液与2,625 µL检测培养基混合，配制用于人中性粒细胞检测的FCCP工作液，获得12.5 µM的工作溶液。
      3. 通过将720 µL储备液与4,080 µL检测培养基混合，配制用于HL60细胞检测的FCCP工作液，获得15 µM的工作溶液。
        注意：加入FCCP可揭示线粒体利用氧化磷酸化（OXPHOS）的最大能力。FCCP是一种脂溶性弱酸，可穿透线粒体膜，导致跨膜电位消散。它使线粒体内膜上的质子梯度放电，并将质子流从Fo/F1 ATP合酶上分流，从而引起线粒体解偶联。这种解偶联效应会急剧增加线粒体的氧气消耗，以维持质子梯度34。
    3. 通过将鱼藤酮/抗霉素A混合物用540 µL检测培养基重悬，配制50 µM的鱼藤酮/抗霉素A储备液。
      1. 通过将540 µL储备液与2,160 µL检测培养基混合，为所有检测配制10 µM的鱼藤酮/抗霉素A工作液。
        注意：鱼藤酮通过抑制复合物I中铁硫中心向泛醌的电子传递来阻断复合物I，而抗霉素A则阻断电子传递链中的复合物III，导致OXPHOS受阻且ATP合成有限35。因此，该处理可揭示非线粒体呼吸36,37。
  2. 向检测卡中加入试剂；将已配制的寡霉素、FCCP和鱼藤酮/抗霉素A混合物分别加入卡盒的A、B和C加样孔中（用于后续注射）（图2）。使用随卡盒提供的模板插件以辅助试剂加入各孔。未使用的孔中加入20 µL检测培养基。
    1. 对于小鼠中性粒细胞检测，向A孔中加入20 µL寡霉素（25 µM；每孔96孔板初始含有180 µL检测培养基，因此终浓度为2.5 µM）。向B孔中加入17.6 µL FCCP（7.5 µM；终浓度：约0.61 µM）。向C孔中加入24 µL鱼藤酮/抗霉素A混合物（10 µM；终浓度：约1 µM）。
    2. 对于人中性粒细胞检测，向A孔中加入20 µL寡霉素（10 µM；每孔96孔板初始含有180 µL检测培养基，因此终浓度为1 µM）。向B孔中加入22 µL FCCP（12.5 µM；终浓度：约1.25 µM）。向C孔中加入24 µL鱼藤酮/抗霉素A混合物（10 µM；终浓度：约1 µM）。
    3. 对于HL60和dHL60细胞检测，向A孔中加入20 µL寡霉素（25 µM；每孔96孔板初始含有180 µL检测培养基，因此终浓度为2.5 µM）。向B孔中加入22 µL FCCP（15 µM；终浓度：约1.5 µM）。向C孔中加入24 µL鱼藤酮/抗霉素A混合物（10 µM；终浓度：约1 µM）。
      注意：使用移液器加样时，避免触碰加样孔底部。加样后切勿敲击检测板，以防液体泄漏，因为液体依靠毛细作用力保留在孔中。培养板的背景孔以及传感器卡盒上的对应加样孔应加入检测培养基或与样本孔相同的试剂，以校正试剂对背景值的影响。必须在不将卡盒从含有校准液的工具板上抬起的情况下，将试剂加入相应加样孔，以避免引入气泡。 如图2所示，将最后一个孔用培养基填满。

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图2：线粒体应激检测试剂盒及其加样孔。 该图显示了线粒体应激检测试剂盒的外观，以及放大图示，展示将各药物/培养基加入相应加样孔的操作。缩写：FCCP = 羰基氰基-p-三氟甲氧基苯腙。 请点击此处查看该图的放大版本。

4. 运行线粒体应激实验

  1. 打开代谢分析仪和计算机，启动 Wave 软件，点击 Heater On，提前至少 5 小时将仪器预热至 37 °C。达到设定温度后，Wave 软件左下角将显示 ready。
  2. 在软件中打开线粒体应激检测试剂盒的模板。点击顶部菜单栏中的 Group Definition。
  3. 在左侧分别预设各项定义，如加样策略、预处理、检测培养基以及（所用生物材料）细胞类型。
  4. 点击左侧的 injection strategies ，然后点击 Add ，将加样条件命名为 Human neutrophils/Mouse neutrophils/HL60。通过点击选择 port A-D，点击 Add compound，输入相应浓度的 Oligomycin/FCCP/Rotenone Antimycin A（见表 1）。
  5. 点击左侧的 pretreatment ，然后点击 Add，分别命名为 CD18 和 Cell Tak。点击左侧的所用 biomaterial ，然后点击 Add ，分别命名为 Human neutrophils、Mouse neutrophils 和 HL60/dHL60，并注明 seeding density（接种密度）。
  6. 通过点击 Add Group （例如，用于人中性粒细胞检测）并选择其下方的定义（例如，Injection strategies 按 表 1-人中性粒细胞 设置，Pretreatment 设为 CD18，cell type 设为 Human neutrophils）来定义分组。
  7. 点击顶部菜单中的 Plate Map ，查看所有分组，左侧为定义，右侧为板图。通过拖放将每个孔分配至相应分组，同时将四个角落的孔保留为 Background （默认）。
  8. 点击顶部菜单中的 Protocol 设置实验程序，定义三个循环的基线、寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 混合物检测阶段，设置 Mix 时间为 3 分钟，Rest 时间为 0 分钟，Measurement 时间为 7 分钟。
  9. 进入 Run Assay 页面，填写项目摘要信息以供参考，然后点击 Start Run。
  10. 指定文件保存位置，以便检测完成后自动保存所有结果。
  11. 检测自动加载后，等待托盘打开，放入传感器 cartridge 和含有 200 µL 校准液的板（见步骤 1.1）。将 cartridge 条形码方向朝右放置。点击 I'm ready 开始校准，过程约需 20 分钟。
  12. 校准完成后，点击 Open Tray。将板更换为已接种细胞的板，然后点击 Load Cell Plate 继续进行检测。
  13. 检测完成后，数据将自动保存。点击 View results，并将结果导出为电子表格或其他分析软件可读的文件格式。
  14. 作图并分析数据（图 3 和 图 4）。
  15. 计算呼吸参数，包括基础线粒体呼吸、质子漏耦联呼吸、ATP 耦联呼吸、最大呼吸、备用呼吸能力以及非线粒体呼吸（图 4A）38,39,40,41。
    1. 通过从加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物前的 OCR 值中减去加入后的 OCR 值，计算基础线粒体呼吸（图 4A, a）。
    2. 通过从加入寡霉素后的 OCR 值中减去加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后的 OCR 值，计算质子漏耦联呼吸（图 4A, b）。
    3. 通过计算基础线粒体呼吸与质子漏耦联呼吸之间的差值，估算 ATP 耦联呼吸。即从加入寡霉素前的首个 OCR 值中减去加入后的首个 OCR 值（图 4A, c）。
    4. 最大呼吸是指细胞在加入 FCCP 后所能达到的最大呼吸速率。通过从加入 FCCP 后的 OCR 值中减去加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后的 OCR 值来计算（图 4A, d）。
    5. 备用呼吸能力是指细胞通过氧化磷酸化（OXPHOS）满足更高能量需求的能力。通过计算最大呼吸与基础线粒体呼吸之间的差值得到（图 4A, e）。
    6. 非线粒体呼吸是指由非线粒体来源消耗的氧气量。在加入鱼藤酮/抗霉素 A 混合物后测量该值（图 4A, f）。
  16. 使用 Student's t-检验对未分化和分化 HL60 细胞的不同呼吸参数进行统计学分析。以 p < 0.05 为差异具有统计学意义。
    注意：OCR 或 ECAR 值低于零的重复样本视为样品制备、化合物加样或测量过程中出现误差，应从后续分析中剔除。

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结果

代表性OCR动态显示了小鼠中性粒细胞（图3A）、人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化HL60细胞（图3C）在寡霉素、FCCP及鱼藤酮/抗霉素A混合物作用下线粒体呼吸的变化。在所有细胞中，寡霉素通过抑制ATP合酶的质子通道而降低OCR值；FCCP通过增加电子流动和氧气消耗以维持膜电位，从而恢复OCR值，达到最大呼吸速率；而鱼藤酮/抗霉素A混合物则通过阻断电子传递链中的复合物I和III，完全消除线粒体呼吸。

我们观察到，在定向诱导中性粒细胞分化后，HL60 细胞的线粒体呼吸作用降低（图 3C）。在定量分析上述不同呼吸参数后发现，分化后的 HL60 细胞其基础线粒体呼吸（图 4B）、质子泄漏相关呼吸（图 4C）、ATP 相关呼吸（<...

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讨论

使用代谢外流分析仪检测中性粒细胞线粒体呼吸的标准方法受到多种因素的限制，包括细胞数量、细胞生长状态和活力。在此检测中，不同种类和来源的细胞对每种化合物的浓度需求各不相同。 寡霉素以及鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中通常使用相似的浓度。然而，由于不同细胞的FCCP诱导最大呼吸速率存在差异，因此需要对FCCP进行仔细的滴定以优化其浓度42。在优化过程中，建议采用逐步添加FCCP的方式。尽管代谢外流分析仪可在气压作用下将药物注入检测板43，但由于某些线粒体复合物抑制剂难以穿透细胞膜，因此与分离的线粒体相比，其在完整细胞中的应用受到限制44。向加样孔中加载试剂时必须谨慎操作，以避免交叉污染。培养基中的底物浓度（如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺）也可能影响线粒体活性，需进行优化。

除了药物浓度外，细胞接种密度也是获得良好OCR值的关键参数。最佳细胞接种密度因细胞类型而异，建议在预实验中使用不同的接种密度来测试测量效果。准确的细胞计数对于降低组间...

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披露

作者声明无竞争性财务利益。

致谢

我们感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Anthony T. Vella 博士和 Federica Aglianoin 博士在使用代谢细胞外通量分析仪方面的培训，以及康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Lynn Puddington 博士对仪器使用的支持。我们感谢康涅狄格大学医学院的 Geneva Hargis 博士在本论文的科学写作与编辑方面提供的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院下属国家心脏、肺和血液研究所（R01HL145454）、国家普通医学科学研究所（R35GM147713 和 P20GM139763）、康涅狄格大学健康中心启动资金以及美国免疫学家协会职业重返研究员奖学金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
37 °C 非 CO2 培养箱PrecisionEconomy Model 2EG仪器
Biorender软件应用
离心机EppendorfModel 5810R仪器
Corning Cell-Tak 细胞和组织粘附剂Corning102416-100试剂
EasySep 磁力架STEMCELL18000磁铁
EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒STEMCELL19762A试剂
Graphpad Prism 9软件应用
人血清白蛋白溶液 (25%)GeminiBio800-120试剂
氯胺酮 (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10麻醉剂
PBSCytivaSH30256.01试剂
板式转子桶EppendorfUL155配件
PolymorphPrepPROGEN1895 (之前为 1114683)多糖溶液
纯化小鼠抗人 CD18 抗体Biolegend302102克隆 TS1/18
RPMI 1640 培养基Gibco11-875-093试剂
Seahorse 代谢细胞外通量分析仪AgilentXFe96仪器
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