我们描述了使用代谢细胞外通量分析仪逐步测定小鼠和人类中性粒细胞以及HL60细胞线粒体呼吸的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
中性粒细胞是人体的第一道防线，也是最丰富的白细胞类型。这些效应细胞具有吞噬作用、呼吸爆发等功能，并可形成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）以清除微生物。近年来对中性粒细胞代谢活性的新认识挑战了早期认为其主要依赖糖酵解的观点。精确测定中性粒细胞的代谢活性，有助于揭示其在生理条件和疾病状态下不同的代谢需求，包括三羧酸循环（TCA循环，又称Krebs循环）、氧化磷酸化（OXPHOS）、磷酸戊糖途径（PPP）以及脂肪酸氧化（FAO）。本文介绍了一种逐步操作方案及前期准备要求，利用代谢外流分析仪通过代谢通量分析技术，测定小鼠骨髓来源中性粒细胞、人血液来源中性粒细胞以及类中性粒细胞的HL60细胞系的氧消耗率（OCR），作为线粒体呼吸的指标。该方法可用于定量分析中性粒细胞在正常和疾病状态下的线粒体功能。
引言
线粒体在细胞生物能量学中起着重要作用，通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）。此外，线粒体的功能还涉及活性氧的生成与解毒、胞质和线粒体基质钙离子的调控、细胞合成、分解代谢以及细胞内代谢物的转运1。线粒体呼吸对所有细胞都至关重要，其功能障碍可能导致代谢异常2，包括心血管疾病3以及多种神经退行性疾病，如年龄相关性黄斑变性4、帕金森病和阿尔茨海默病5，以及腓骨肌萎缩症2A型（CMT2A）6。
对中性粒细胞的电子显微镜研究表明，其线粒体数量相对较少7，且主要依赖糖酵解产生能量，因为线粒体呼吸速率极低8。然而，线粒体对中性粒细胞的功能至关重要，例如趋化性9和凋亡10,11,12。先前一项研究揭示，人中性粒细胞中存在复杂的线粒体网络，并具有较高的膜电位。线粒体膜电....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
在获得知情同意后，根据康涅狄格大学健康中心机构审查委员会（IRB）批准，从健康人类供体采集肝素抗凝全血样本，该研究符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有动物实验均遵循康涅狄格大学健康中心动物护理与使用委员会（IACUC）的指南，并根据美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中规定的要求，获得康涅狄格大学健康中心IACUC对啮齿类动物使用的批准。本研究使用6周龄雄性C57BL/6小鼠。
1. 代谢胞外通量检测用96孔板的制备
- 将用于代谢细胞外通量测定的传感器微孔板置于特制的96孔板上方。轻轻抬起传感器微孔板进行水合处理，并向下方96孔板的每个孔中加入200 µL校准缓冲液。将加有校准缓冲液的传感器微孔板置于无CO2、湿润、37 °C的培养箱中孵育过夜，以完成水合。
- 根据细胞类型，使用特定的包被方法处理培养板，以确保细胞贴壁。对于人中性粒细胞、未分化及分化后的HL60细胞，使用含有50 µL浓度为5 µg/mL的纯化小鼠抗人CD18抗体（克隆号TS1/18）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS），在4 °C条件下对96孔板包被过夜。对于小鼠中性粒细胞，使用pH 8.0条件下含25 µL浓度为22.4 µg/mL Cell Tak的0.1 M NaHCO3溶液，在室温（RT）下包被20分钟。
- 用200 µL无菌PBS洗涤培养板两次。
- ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
代表性氧消耗率（OCR）动态变化显示了小鼠中性粒细胞（图3A）、人中性粒细胞（图3B）以及未分化和分化HL60细胞（图3C）在线粒体呼吸过程中对寡霉素、FCCP以及鱼藤酮/抗霉素A混合物的响应。在所有细胞中，寡霉素通过抑制ATP合酶的质子通道而降低OCR值；FCCP通过增加电子流和氧气消耗以维持膜电位，从而恢复OCR值并实现最大呼吸速率；而鱼藤酮/抗霉素A混合物则通过阻断电子传递链中的复合物I和III，完全消除线粒体呼吸。
我们观察到，在中性粒细胞定向分化后，HL60 细胞的线粒体呼吸作用降低（图 3C）。在定量分析上述不同的呼吸参数后发现，分化后的 HL60 细胞其基础线粒体呼吸（图 4B）、质子泄漏相关呼吸（图 4C）、AT.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
使用代谢外流分析仪检测中性粒细胞线粒体呼吸的标准方法受到多种因素的限制，包括细胞数量、细胞生长状态和活力。在此检测中，不同种类和来源的细胞对每种化合物的浓度需求各不相同。 寡霉素以及鱼藤酮/抗霉素A在大多数细胞类型中通常使用相似的浓度。然而，由于不同细胞的FCCP诱导最大呼吸速率存在差异，因此需要对FCCP进行仔细的滴定以优化其浓度42。在优化过程中，建议采用逐步添加FCCP的方式。尽管代谢外流分析仪可在气压作用下将药物注入检测板43，但由于某些线粒体复合物抑制剂难以穿透细胞膜，因此与分离的线粒体相比，其在完整细胞中的应用受到限制44。向加样孔中加载试剂时必须谨慎操作，以避免交叉污染。培养基中的底物浓度（如葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺）也可能影响线粒体活性，需进行优化。
除了药物浓度外，细胞接种密度也是获得良好OCR值的关键参数。最佳细胞接种密度因细胞类型而异，建议在预实验中使用不同的接种密度来测试测量效果。准确的细胞计数对于降低组间.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Anthony T. Vella 博士和 Federica Aglianoin 博士在使用代谢细胞外通量分析仪方面的培训，以及康涅狄格大学健康中心免疫学系的 Lynn Puddington 博士对仪器使用的支持。我们感谢康涅狄格大学医学院的 Geneva Hargis 博士在本论文的科学写作与编辑方面提供的帮助。本研究获得了美国国立卫生研究院下属国家心脏、肺和血液研究所（R01HL145454）、国家普通医学科学研究所（R35GM147713 和 P20GM139763）、康涅狄格大学健康中心启动资金以及美国免疫学家协会职业重返研究员奖学金的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 37 °C 非 CO2 培养箱 | Precision | Economy Model 2EG | 仪器 |
| Biorender | 软件应用 | ||
| 离心机 | Eppendorf | Model 5810R | 仪器 |
| Corning Cell-Tak 细胞和组织粘附剂 | Corning | 102416-100 | 试剂 |
| EasySep 磁力架 | STEMCELL | 18000 | 磁铁 |
| EasySep 小鼠中性粒细胞富集试剂盒 | STEMCELL | 19762A | 试剂 |
| Graphpad Prism 9 | 软件应用 | ||
| 人血清白蛋白溶液 (25%) | GeminiBio | 800-120 | 试剂 |
| 氯胺酮 (VetaKet) | DAILYMED | NDC 59399-114-10 | 麻醉剂 |
| PBS | Cytiva | SH30256.01 | 试剂 |
| 板式转子桶 | Eppendorf | UL155 | 配件 |
| PolymorphPrep | PROGEN | 1895 (之前为 1114683) | 多糖溶液 |
| 纯化小鼠抗人 CD18 抗体 | Biolegend | 302102 | 克隆 TS1/18 |
| RPMI 1640 培养基 | Gibco | 11-875-093 | 试剂 |
| Seahorse 代谢细胞外通量分析仪 | Agilent | XFe96 | 仪器 |
| Seahorse XF 细胞线粒体应激检测试剂盒 | Agilent | 103015-100 | 线粒体应激检测试剂盒 |
| 摆动式转子 | Eppendorf | A-4-62 | 转子 |
| Vactrap 2 真空捕集器 | Fox Lifesciences | 3052101-FLS | 仪器 |
| Wave | 软件应用 | ||
| XF 1.0 M 葡萄糖溶液 | Agilent | 103577-100 | 试剂 |
| XF 100 mM 丙酮酸溶液 | Agilent | 103578-100 | 试剂 |
| XF 200 mM 谷氨酰胺溶液 | Agilent | 103579-100 | 试剂 |
| XF DMEM 培养基 | Agilent | 103575-100 | 试剂 |
| XFe96 FluxPak | Agilent | 102601-100 | 材料 |
| 赛拉嗪 (AnaSed 注射液) | DAILYMED | NDC 59399-110-20 | 麻醉剂 |
参考文献
- Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
- Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
