小鼠中枢与周围神经系统整体解剖

摘要

本文介绍了一种完整分离小鼠中枢和外周神经系统组织的实验方案。分离得到的组织可用于后续实验，如大体成像或组织学分析。

摘要

动物模型是神经科学领域的核心研究工具。然而，迄今为止，仍缺乏可免费获取的、用于完整分离啮齿类动物神经系统的分步操作方案，也缺少系统展示其结构的完整示意图。目前仅存在分别获取脑、脊髓、特定背根神经节或坐骨神经的方法。本文中，我们提供了小鼠中枢和外周神经系统详细的图片及示意图，并更重要的是，阐述了一种可靠的神经系统解剖操作流程。解剖前30分钟的预处理步骤可使神经系统在椎骨内保持完整，同时去除肌肉附着的内脏和皮肤。随后在显微解剖镜下进行2至4小时的精细解剖，暴露脊髓和胸神经，最终将完整的中枢与外周神经系统从尸体上完整剥离。该方案为全面研究神经系统的解剖结构与病理生理机制提供了重要进展。例如，从小鼠神经纤维瘤病1型模型中分离的背根神经节可进一步用于组织学分析，以揭示肿瘤进展过程中的变化。

引言

本方法的总体目标是完整分离小鼠的中枢和周围神经系统。目前尚无用于解剖啮齿类动物整个神经系统以进行全局研究的实验方案。神经科学家通常采用坐骨神经作为所有周围神经的替代模型¹，并以L3至L5节段的神经节作为所有神经节的替代模型²。使用这些方法时，无法判断研究结果是否特异性地反映特定神经或神经节的特征。已知至少某些神经病变对不同神经和神经节的影响并不均一^3,4,5，因此必须建立一种能够完整分离啮齿类动物整个神经系统的技术，以实现对其全局性的研究。

多年来，我们开发并优化了一种用于分离小鼠完整中枢和周围神经系统的方法。第一步主要是对小鼠进行大体解剖，为后续在解剖显微镜下进行的精细解剖步骤做准备。在第2至第4步中，暴露脊髓和胸神经，解剖出脑组织，并将整个脊髓及周围神经从尸体上剥离下来。

当与成像或组织学技术联用以记录任何宏观或微观变化时，该方法具有强大优势^6,7,8,9。神经科学家若希望系统性地评估全局性变化或开展非假设驱动的实验，应采用该方法对整个神经系统进行全面筛查。

方案

本研究中使用的实验方案已获得加拿大动物护理委员会认证机构——舍布鲁克大学机构动物委员会的批准。

1. 显微解剖前准备（术前准备）

1. 使用5%异氟烷进行麻醉，随后使用2%异氟烷和10 psi CO₂实施安乐死，直至无任何生命体征。
   注意：不要进行颈椎脱位，因为这会损伤脊髓和颈交感神经节。
2. 将已安乐死的小鼠仰卧（前视图）放置于解剖垫上，并用70%乙醇喷洒毛发。
3. 然后用四根细针固定四肢，以在解剖过程中保持小鼠位置稳定。
4. 使用手术剪从下腹部向喉部剪开皮肤。
5. 剥离皮肤以暴露内脏器官，并使用额外的针将皮肤固定在两侧，以充分暴露腹腔。
6. 剪开胸腔以暴露心脏和肺脏。
7. 使用一对标准解剖镊夹住食管和气管，并在镊子上方剪断。
8. 随后，从头侧向尾侧方向开始剥离所有内脏器官。为此，沿脊柱剪开膈肌，以整体取出全部内脏器官。
9. 取下固定针，将小鼠尸体置于水槽中冲洗腹腔内多余的血液。
10. 将小鼠翻转为俯卧位（后视图），使用四根 细针固定四肢，以在解剖过程中保持小鼠位置稳定。
11. 使用手术剪从头部向后肢方向剥离皮肤。
12. 暴露左侧坐骨神经（下肢）。
    1. 切开左侧下肢远端的肌肉。
    2. 通过去除周围肌肉组织，定位并暴露坐骨神经。
    3. 小心地在腓肠神经、胫神经和腓神经分叉处切断坐骨神经，避免损伤血管。
    4. 继续使用标准解剖镊和超细Bonn手术剪分离坐骨神经，直至其与脊柱平行，保留约2 cm的游离神经段。
    5. 将手术剪平行于脊髓插入，剪开髋关节。
    6. 用手拉开骶骨与股骨，使髋关节脱位。
       注意：在此过程中，需频繁暂停，用镊子轻轻牵拉坐骨神经，以防神经断裂。
    7. 最后，轻柔地将后肢从尸体上撕下，保留约4 cm长的坐骨神经。
       注意：在此过程中，需定位L2神经，并将其小心分离出后肢，避免损伤L2神经。右侧重复步骤1.12。
13. 暴露臂丛神经（上肢）。
    1. 用手操作小鼠尸体，而非在平面（解剖垫）上进行。
    2. 通过分离左侧腋窝的脂肪和肌肉组织，定位左侧臂丛神经。
    3. 定位后，使用超细Bonn手术剪切断主臂丛神经分支（桡神经、腋神经、肩胛上神经）及其在尺骨周围的次级分支，保留约1.5 cm的游离神经段。轻柔地将神经丛从左上肢剥离。
    4. 脱位左上肢，确保神经已完全分离。右侧重复步骤1.13。
14. 暴露脑组织。
    1. 将小鼠重新置于仰卧位（前视图）。
    2. 将超细Bonn手术剪的一侧刀片插入小鼠口腔，从喉部剪断下颌骨。
    3. 进一步从面颊向喉部剪切，移除下颌骨。
    4. 然后，从一侧耳部向另一侧耳部剪开颅骨。
       注意：注意避免剪得过深而损伤脑组织。
    5. 剪开并移除腭骨和鼻骨，以打开颅腔。
    6. 在颅底处剪断第一颈椎（C1），释放小脑和脊髓起始段。
    7. 最后，横向剪开颅骨至眼部，移除颅骨碎片以暴露脑组织。
       注意：在神经剥离完成前，应保持脑组织留在颅腔内。
15. 清除尸体上多余的脂肪和肌肉组织。将尸体置于10%福尔马林中，在室温（RT）固定15分钟，随后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）短暂清洗数次，直至无固定液气味，然后进行下一步。
    ​注意：若神经系统将在两周内进行解剖，可将其保存于4 °C的PBS中；否则可长期保存于10%福尔马林中。操作福尔马林时务必使用化学通风橱。

2. 脊髓暴露

1. 暴露脊髓时，采用从头侧到尾侧的方法。使用Vannas弹簧剪在腹侧的十点钟和两点钟位置进行剪切，以去除每节椎骨及其上方的肌肉层。用Dumont微型镊子逐块剔除椎骨。依次操作至颈椎和胸椎区域。
2. 对于腰段，先在每节椎骨两侧剪断横突。然后将Vannas弹簧剪的刀片插入椎管内，在两点钟和十点钟位置进行剪切。去除组织时需注意，有时神经会黏附在骨头上。
3. 尾段部分依同样方法进行操作。

3. 胸神经暴露

1. 将尸体置于解剖显微镜下，以观察其腹侧。
2. 使用Vannas弹簧剪，沿每根肋骨（从胸骨至远端）剪开，以暴露周围神经。
3. 接着，在神经节两侧（外侧）剪开椎骨，以暴露神经节。

4. 周围神经剥离

1. 使用Dumont微型镊子轻轻滚动脊髓并逐根拔出周围神经，从脊髓的尾端开始，以剥离脊髓并进一步分离周围神经。
   注意：剥离前，可在室温下用10%福尔马林固定15分钟，随后用1×PBS短暂清洗数次，直至无固定剂气味，操作同步骤1.15。
2. 对于胸段神经，以90°角（垂直于脊髓）牵拉神经。
3. 对于臂丛神经，需剪断神经旁的椎骨，为神经留出空间。
   注意：臂丛神经无法像胸段神经那样从椎骨下方穿过。
4. 去除多余的肌肉组织，以暴露神经。
5. 可在4 °C的PBS中保存最多2周，或在室温下长期保存于10%福尔马林中。

结果

啮齿类动物在我们理解神经系统生物学及其病理生理学方面发挥了关键作用¹⁰。然而，目前尚无方法能够完整地解剖啮齿类动物的中枢和外周神经系统，以在实时模型中评估其解剖结构和病理变化^1,2,11。图1展示了步骤1至步骤4的总体流程（包括显微解剖前准备、暴露脊髓、暴露胸段神经以及剥离外周神经）。在步骤1中，移除所有内脏器官，剥离皮肤，并从四肢中分离出主要神经丛（臂丛和腰骶丛）。在步骤2和步骤3中，部分去除椎体腹侧结构，以暴露脊髓。在步骤4中，将整个神经系统从鼠体尸骸中完整分离。总体而言，完成该操作过程需要2.5至5小时。

脊神经根据其对应的椎骨进行标注。颈段脊神经根据其发出位置上方的椎骨进行命名。相反，骶段、腰段和胸段脊神经则根据其发出位置下方的椎骨进行命名。如

讨论

为防止肌肉和神经干燥，应每隔10分钟将尸体浸泡在PBS中。在分离下肢（步骤1.12.6）时，必须始终观察坐骨神经丛和L2，以避免损伤或撕裂。在解剖脑组织（步骤1.14.4）时，关键是要避免过深操作，以免损伤脑组织。在解剖背根神经节及周围神经时，必须使用高质量（无损伤）的Dumont微型镊子，以避免损伤神经结构。

除了采用15分钟10%甲醛固定步骤外，还可选择使用4%多聚甲醛灌注固定，如Chen等人⁵所述，这是一种可行的替代方法。如果仅关注小鼠神经系统的特定部分（例如臂丛神经），则可通过省略其他部位（如胸段、腰段和骶段）的解剖步骤来调整本方案。尽管操作更为繁琐，但该解剖方案也可在未固定组织的情况下进行，从而实现原代细胞的分离与培养。类似地，若仅需获取小鼠神经系统特定区域的细胞，也可对本方案进行优化以缩短操作时间。此外，还可从经甲醛缓冲液保存的整只存档小鼠样本中进行回溯性解剖，主要区别在于此时组织需通过切割而非大部分撕裂的方式分离。本方案整体可适用于任何啮齿类动物或其他小型哺乳动物。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜蒙微型镊子	Fine Science Tools	#11200-10
超细邦剪	Fine Science Tools	#14084-08
10% 甲醛	Fischer Scientific	#22-046-361
1× PBS	BioShopCanada	#PBS404.500
标准解剖镊	Fine Science Tools	#91100-12
手术剪	Fine Science Tools	#140001-12
范纳斯弹簧剪	Kent Scientific	#INS600124