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利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

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DOI：

10.3791/64977

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2023年2月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

本文内容

摘要

本方案描述了如何在无PAM限制的情况下进行高效的腺嘌呤碱基编辑，以利用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。

摘要

CRISPR/Cas9 技术提高了斑马鱼在模拟人类遗传疾病、研究疾病发病机制以及药物筛选中的价值。然而，原间隔序列邻近基序（PAM）的限制仍是构建由单核苷酸变异（SNVs）引起的人类遗传病精准动物模型的主要障碍。迄今为止，一些具有广泛PAM兼容性的SpCas9变体已在斑马鱼中显示出编辑效率。优化后的SpRY介导的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、zSpRY-ABE8e以及合成修饰的gRNA在斑马鱼中的应用，实现了不受PAM限制的高效腺嘌呤-鸟嘌呤碱基转换。本文描述了一种利用zSpRY-ABE8e在斑马鱼中实现高效腺嘌呤碱基编辑且不受PAM限制的实验方案。通过将zSpRY-ABE8e mRNA与合成修饰的gRNA混合物注射到斑马鱼胚胎中，成功构建了一个携带精确突变的斑马鱼疾病模型，该突变模拟了核糖体成熟因子TSR2（tsr2）的一个致病位点。该方法为建立精准疾病模型以研究疾病机制和治疗方法提供了有价值的工具。

引言

导致错义或无义突变的单核苷酸变异（SNVs）是人类基因组中最常见的突变来源1。为了确定特定SNV是否具有致病性，并阐明其致病机制，需要建立精确的动物模型2。斑马鱼是良好的人类疾病模型，其与人类在生理和遗传上具有高度同源性，且发育周期短、繁殖能力强，有利于致病特征与机制的研究以及药物筛选3。

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统已广泛应用于包括斑马鱼在内的多种物种的基因组编辑4。在gRNA的引导下，CRISPR/Cas9系统可在靶位点产生DNA双链断裂（DSBs），随后通过同源定向修复（HDR）途径将靶位点与供体DNA模板重组，实现单碱基替换。via然而，由于细胞DNA修复过程主要通过非同源末端连接（NHEJ）途径进行，该方法的碱基替换效率较低，且通常伴随插入和缺失（indel）突变5。幸运的是，基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑技术通过使用碱基编辑器（base editors），在不诱导DSBs的情况下实现了更高效的单碱基编辑，显著缓解了这一问题。目前已开发出两类主要的碱基编辑器：腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs），分别用于实现A·T到G·C和C·G到T·A的碱基替换6,7,8,9,10,11。这四种碱基替换类型涵盖了30%的人类致病性变异12。已有报道表明，包括PmCDA1、BE系统、CBE4max、ABE7.10和ABE8e在内的这两类碱基编辑器均能在斑马鱼中发挥作用，其中BE4max和ABE8e尤其被报道具有较高的编辑活性13,14,15,16,17,18,19。

来自不同物种的Cas9蛋白，包括Staphylococcus aureus、Streptococcus pyogenes和S. canis，已被应用于斑马鱼基因编辑，其中Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）的应用最为广泛20,21,22,23。然而，SpCas9只能识别具有NGG原间隔序列邻近基序（PAM）的靶位点，这限制了其可编辑范围，可能导致在感兴趣的致病位点附近无法找到合适的序列24。为了扩展靶向范围，已通过定向进化和结构导向设计构建了多种SpCas9变体，以识别不同的PAM序列。然而，这些变体中仅有少数在动物体内有效，尤其是在斑马鱼中，这限制了斑马鱼在单核苷酸变异（SNV）相关疾病研究中的应用25,26,27,28。最近，报道了两种PAM限制更宽松的SpCas9变体SpG和SpRY（SpG识别NGN，SpRY识别NNN，且对NRN的偏好高于NYN），在人类细胞和植物中表现出高效的编辑活性29,30,31,32。随后，SpG和SpRY以及多种由其介导的碱基编辑器，如SpRY介导的CBEs和SpRY介导的ABEs，也被证实可在斑马鱼中发挥作用，这将增强斑马鱼模型在SNV相关疾病机制研究和药物筛选中的应用18,33,34,35。此外，i-Silence被提出作为一种高效且精确的基因敲除策略，通过ABE介导将起始密码子从ATG转换为GTG或ACG36。i-Silence策略与SpRY介导的碱基编辑器zSpRY-ABE8e的结合，为疾病建模提供了新方法18。本实验方案展示了如何在斑马鱼中利用zSpRY-ABE8e结合i-Silence策略构建tsr2（M1V）模型，并对斑马鱼模型中的编辑效率和表型进行了评估与分析。

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方案

本研究严格遵守华南师范大学动物护理与使用委员会的指导方针进行。

1. 准备合成修饰的gRNA和zSpRY-ABE8e mRNA

  1. 根据先前发表的文献设计gRNA37,38.
    1. 优先选择NRN作为PAM序列，因为zSpRY-ABE8e对NRN PAM的偏好性高于NYN PAM（其中R代表A或G，Y代表C或T）。18确保目标腺嘌呤核苷酸位于高活性编辑窗口内（原间隔序列中第3至第9个核苷酸）。
  2. 订购在两端经 2′-O-甲基-3′-硫代磷酸酯（MS）修饰的 EasyEdit sgRNA（EE gRNA）图1).
    注意：EE gRNA 应溶解于无 RNase 水中，并于 −80 °C 保存。
  3. 线性化zSpRY-ABE8e质粒18.
    1. 用限制性内切酶将6 µg质粒线性化 XbaI 酶材料表在37 °C金属浴中孵育3小时。
    2. 使用DNA纯化试剂盒纯化线性化质粒（参见 材料表按照制造商的说明进行操作。
  4. 使用以下方法转录 mRNA 体外 转录试剂盒（材料表).
    1. 以线性化质粒为模板，按照制造商说明书转录 zSpRY-ABE8e mRNA。
      注意：所有涉及 mRNA 和 gRNA 的操作均需使用无 RNase 的实验耗材。
  5. 使用RNA纯化试剂盒（材料表）按照制造商说明书纯化 mRNA。
    注意：洗脱前必须干燥乙醇，以避免细胞毒性；若 mRNA 不能立即使用，应保存在 −80 °C。

2. 准备受精显微注射用玻璃毛细管

  1. 设置微电极拉制仪系统，并预热至少 30 分钟。
  2. 运行梯度加热测试，根据制造商说明书确定熔融硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1 mm，内径 0.58 mm）所需的加热值。
  3. 选择一个程序，点击键盘上的数字输入参数值。设置以下参数以拉制玻璃毛细管：加热值 = 梯度测试结果，拉力 = 50，速度 = 100，时间 = 50，气压 = 30。
  4. 安装毛细管，确保其位于凹槽中。按下 PULL START/STOP 以运行程序。
  5. 将拉制好的毛细管插入带有缝隙的泡沫中保存，使针尖保持悬空状态。

3. 将zSpRY-ABE8e mRNA与EE gRNA混合物显微注射入斑马鱼胚胎

  1. 在注射前一晚设置繁殖用鱼缸。插入隔离板，每缸放入两条雌性与一条雄性AB品系斑马鱼（3-18月龄），并盖上盖子。性别区分方法参见以往文献39。
    注意：为获得更多的胚胎，应选择至少一周内未进行过繁殖的斑马鱼。
  2. 注射次日清晨，将zSpRY-ABE8e mRNA和EE gRNA置于冰上解冻。将mRNA与gRNA混合，使其终浓度分别为400 ng/µL和200 ng/µL。
    1. 整个操作过程需在冰上进行，使用无RNase的枪头和离心管，并佩戴手套操作。
  3. 配置气动显微注射仪。先关闭气泵的减压阀并打开主阀，再打开气瓶，调节减压阀压力至0.2 MPa/29 psi。
    1. 开启气动显微注射仪，将模式设为TIMER，初始参数压力值设为20.0 psi，TIMER值设为0.040 s。
  4. 在体视显微镜下使用精细镊子小心折断拉制好的玻璃毛细针尖，确保针尖呈一定角度断裂，以便穿透卵膜和卵细胞。
    注意：针尖断裂位置需恰当，既要足够坚固以刺穿卵细胞，又要足够细以尽量减少对卵的损伤。
  5. 使用微量移液器枪头将zSpRY-ABE8e mRNA与gRNA的混合液加入玻璃毛细针尖，避免毛细管内产生气泡。将针头安装至显微操作仪上，并调节注射器的压力和TIMER值，使用微毛细管校准确保每次注射输出2 nL混合液。
  6. 移除繁殖缸中的隔离板，让斑马鱼交配10-15分钟。用滤网收集卵，并在体视显微镜下检查卵的细胞期和质量。选择处于单细胞期的卵进行注射，以提高编辑效率。
  7. 将卵整齐排列于1.5%琼脂糖注射板上，在显微镜下向胚胎细胞（而非卵黄）注射2 nL混合液，以提高编辑效率。至少保留15枚卵作为对照组。
  8. 用1×E3缓冲液将卵转移至培养皿中，并置于28 °C培养箱内孵育。清除死亡的卵，每隔12小时更换一次培养缓冲液，直至受精后48小时（hpf）。

使用 EditR 进行碱基编辑效率分析

  1. 在48 hpf时，分别将三组随机选取的注射胚胎（每组六只）和六只随机选取的对照胚胎收集到PCR管中。使用移液器吸除残留的E3缓冲液。
  2. 向PCR管中加入40 µL的50 mM NaOH。将PCR管置于95 °C金属浴中孵育20分钟，然后涡旋振荡15秒。
  3. 向每根PCR管中加入4 µL的1 M Tris·HCl（pH 8.0）以中和NaOH。在室温下以2,000 x g短暂离心10秒，以去除管壁上的液滴。将上清液转移至新的PCR管中，并于−20 °C保存。
  4. 在gRNA靶位点的上下游设计合适的引物。使用1 µL上述上清液作为模板进行50 µL体积的PCR反应。本研究中所用PCR引物列于补充表1中。
  5. 进行DNA琼脂糖凝胶电泳，确认获得正确且特异的条带，随后按先前描述的方法进行Sanger测序40。
  6. 使用EditR（1.0.10）程序分析Sanger测序数据41。
    1. 将测序文件（ab1格式）上传至"上传.ab1文件"框中。
    2. 将20 bp的gRNA序列以5′-3′方向输入"输入gRNA序列"框中。
    3. 打开测序文件（ab1格式），确认20 bp gRNA序列起始和终止的碱基位置。将相应的碱基位置分别填入"5′起始"和"3′终止"框中。
    4. 点击预测编辑以获得碱基编辑效率。检查gRNA靶序列附近的测序数据质量，避免出现杂乱峰或插入缺失（indels）。
      注：通常可通过调整PCR退火温度有效去除杂乱峰。

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结果

已报道TSR2基因突变可导致戴蒙德-布莱克凡贫血症（DBA）42。本研究利用i-Silence策略构建了携带tsr2（M1V）突变的DBA斑马鱼模型。通过使用zSpRY-ABE8e，成功将斑马鱼tsr2基因起始密码子中的腺嘌呤转换为鸟嘌呤（图3）。

Sanger测序结果的EditR分析显示，在tsr2起始密码子的腺嘌呤碱基位置存在A/G重叠峰（图4）。

将F0代创始个体与先前获得的tsr2杂合突变成鱼进行交配后，在受精后2天（dpf）于显微镜下观察胚胎表型。与对照组相比，部分胚胎表现出眼睛较小及心包肿胀的表型（图5）。随后使用0.03%三卡因麻醉胚胎，固定于4%甲基纤维素中，并进行拍照记录。

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讨论

本方案描述了使用碱基编辑器 zSpRY-ABE8e 构建斑马鱼疾病模型的方法。与传统的通过同源定向修复（HDR）途径实现碱基替换的方法相比，本方案可实现更高效的碱基编辑，并减少插入缺失（indels）的发生。同时，本方案涉及在斑马鱼中实施近期提出的 i-Silence 基因敲除策略。综上所述，zSpRY-ABE8e 将增强斑马鱼模型在疾病研究中的应用。

脱靶效应是CRISPR/Cas9系统中的常见问题。尽管先前一项包含靶向tsr2的研究未发现显著的脱靶效应18，但由于缺乏PAM序列限制，zSpRY-ABE8e的脱靶效应可能更高。幸运的是，通过严格的gRNA设计标准可避免这一问题，这些标准确保仅有一个基因组序列能与gRNA及其PAM序列完全匹配，并将预测的脱靶位点总数降至最低。此外，已有研究表明，与注射mRNA和gRNA相比，注射核糖核蛋白复合物（RNP）和gRNA可降低脱靶概率43。进一步地，对gRNA和Cas9的修饰也可减少脱靶效应...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢来自理文编辑（Edanz）的Barbara Garbers博士对本手稿初稿英文文本的编辑。本工作由广东省重点领域研发计划（2019B030335001）、国家重点领域研发计划&中国国家重点研发计划（2019YFE0106700）、国家自然科学基金（32070819，31970782）以及广东省水产经济动物病原生物学与流行病学重点实验室（PBEA2020YB05）研究基金项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma-AldrichA9539用于制备注射平板的1.5%琼脂糖
硼硅酸盐玻璃毛细管 Harvard ApparatusBS4 30-0016
细胞培养皿 Falcon351029
ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒VazymeC115用于Infusion克隆的试剂盒 
密码子优化服务Sangon Biotech
Drummond微量毛细管Drummond MicrocapsP1299-1PAK长度：32 mm，容量：0.5 μL
EasyEdit gRNA服务GenScript
精细镊子Fine Scientific Instrument11254-20用于折断针头
Flaming/Brown微电极拉制仪 Stutter InstrumentP-97用于拉制玻璃毛细管
HotStart Taq PCR StarMixGenstarA033-101用于PCR反应
智能人工气候箱TENLINPRX-1000A用于培养斑马鱼胚胎
甲基纤维素Sigma-AldrichM0512拍摄时用于固定斑马鱼
Microloader移液器吸头 Eppendorf5242956003
mMACHINE试剂盒 
Mut Express II快速定点突变试剂盒V2VazymeC214-01用于定点突变的试剂盒
气动显微注射仪ZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE试剂盒 Qiagen73504用于RNA纯化的试剂盒
Sanger测序服务Sangon Biotech
氢氧化钠，颗粒状SangonA100173-0500基因组提取中使用的NaOH
体视显微镜Olympus SZX10用于表型拍照
SZ系列变倍体视显微镜CNOPTECSZ650
T3 mMESSAGEAmbionAM1348用于体外转录的试剂盒 
TIANprep迷你质粒提取试剂盒TIANGENDP103-03质粒提取试剂盒
TIANquick迷你纯化试剂盒TIANGENDP203-02用于线性化质粒纯化的试剂盒
三卡因Sigma-AldrichE10521用于麻醉斑马鱼
三（羟甲基）氨基甲烷SangonA600194-0500基因组提取中Tris·HCl的组分
XbaINew England BiolabsR0145S用于质粒线性化的限制性内切酶

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