方法文章

使用 zSpRY-ABE8e 对斑马鱼进行人类遗传病建模的高效无 PAM 碱基编辑

DOI：

10.3791/64977

⸱

2023年2月17日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Brain, Cognition and Education Science, Ministry of Education, 2Institute for Brain Research and Rehabilitation, Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University, 3Institute of Modern Aquaculture Science and Engineering, Guangdong Provincial Engineering Technology Research Center for Environmentally Friendly Aquaculture, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, School of Life Sciences, South China Normal University, 4Department of Pathology, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了如何在没有PAM限制的情况下进行有效的腺嘌呤碱基编辑，以使用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR/Cas9技术增加了斑马鱼在模拟人类遗传疾病、研究疾病发病机制和药物筛选方面的价值，但原间隔邻基序（PAM）的限制是创建由单核苷酸变异（SNV）引起的人类遗传疾病的准确动物模型的主要障碍。到目前为止，一些具有广泛PAM兼容性的SpCas9变体已经在斑马鱼中显示出效率。优化的SpRY介导的腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、zSpRY-ABE8e和合成修饰的gRNA在斑马鱼中的应用实现了高效的腺嘌呤-鸟嘌呤碱基转化，不受PAM限制。这里描述的是一种使用zSpRY-ABE8e在斑马鱼中进行高效腺嘌呤碱基编辑的协议，而没有PAM限制。通过将zSpRY-ABE8e mRNA和合成修饰的gRNA的混合物注入斑马鱼胚胎中，构建了具有精确突变的斑马鱼疾病模型，该模型模拟了TSR2核糖体成熟因子（tsr2）的致病位点。该方法为建立准确的疾病模型以研究疾病机制和治疗方法提供了有价值的工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

引起错义或无义突变的单核苷酸变异（SNV）是人类基因组中最常见的突变来源1。为了确定特定的SNV是否具有致病性，并阐明其发病机制，需要精确的动物模型2。斑马鱼是良好的人类疾病模型，表现出与人类生理和遗传同源性高、发育周期短、繁殖能力强等特点和机制研究，有利于研究致病特征和机制，以及药物筛选3。

成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9系统已广泛应用于包括斑马鱼4在内的各种物种的基因组编辑。在gRNA的指导下，CRISPR/Cas9系统可以在靶位点产生DNA双链断裂（DSB），然后通过同源定向修复（HDR）途径将靶位点与供体DNA模板重组，从而实现单碱基替换。然而，这种碱基置换方法的效率相当低，因为细胞DNA修复过程主要由非同源末端连接（NHEJ）途径进行，该途径通常伴随着插入和缺失（indel）突变5。幸运的是，基于CRISPR/Cas9的单碱基编辑技术通过使用碱基编辑器显着缓解了这个问题，可以在不诱导DSB的情况下实现更高效的单碱基编辑。已经开发了两大类碱基编辑器，腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE），以实现A·T到G·C和C·G到T·A，分别为6

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究严格按照华南师范大学护理与使用委员会的指导方针进行。

1. 制备合成修饰的gRNA和zSpRY-ABE8e mRNA

  1. 根据先前的出版物37，38设计gRNA。
    1. 优先选择 NRN 作为 PAM 序列，因为 zSpRY-ABE8e 显示 NRN PAM 的偏好高于 NYN PAM（其中 R 为 A 或 G，Y 为 C 或 T）18。确保目标腺嘌呤核苷酸处于高度活跃的编辑窗口（沿原间隔体的第三至第九个核苷酸）。
  2. 订购两端用2′-O-甲基-3′-硫代磷酸酯（MS）修饰的EasyEdit sgRNA （EE gRNA）（图1）。
    注意:EE gRNA应溶解在无RNase的水中并储存在-80°C。
  3. 线性化zSpRY-ABE8e质粒18。
    1. 用 XbaI 酶（材料表）在37°C的金属浴中线性化6μg质粒3小时。
    2. 根据制造商的说明，使用DNA纯化试剂盒（参见 材料表

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

据报道， TSR2 的突变会导致钻石黑扇贫血（DBA）42。在这里，使用i-Silence策略构建了 具有tsr2 （M1V）突变的DBA斑马鱼模型。使用zSpRY-ABE8e将斑马鱼 tsr2 起始密码子的腺嘌呤成功转化为鸟嘌呤（图3）。

对 Sanger 测序结果的 EditR 分析表明， tsr2 起始密码子的腺嘌呤碱基存在 A/G 重叠（图 4）。

在F0创始人与先前生成的 tsr2 杂合突变成虫交配后，在显微镜下观察受精后2天（dpf）的胚胎表型。与对照组相比，几个胚胎表现出较小的眼睛和肿胀的心包的表型（图5）。胚胎用0.03%三卡因麻醉，固定在4%甲基纤维素上，并拍照。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了使用碱基编辑器zSpRY-ABE8e构建斑马鱼疾病模型。与传统的HDR碱基替代途径相比，该方案可以实现更高效的碱基编辑并减少插入缺失的发生。同时，该协议涉及在斑马鱼中实施最近提出的i-Silence基因敲除策略。总之，zSpRY-ABE8e将加强斑马鱼模型在疾病研究中的应用。

脱靶效应是CRISPR/Cas9系统中的常见问题。考虑到无PAM的限制，zSpRY-ABE8e的脱靶效应可能更高，即使在先前的研究中没有发现显着的脱靶效应，包括 tsr2 靶向18。幸运的是，这个问题可以通过严格的gRNA设计标准来避免，该标准确保只有一个基因组序列与gRNA与PAM完全匹配，并将预测的脱靶位点总数保持在最低限度。此外，一项研究表明，与注射 mRNA 和 gRNA43 相比，注射核糖核蛋白 （RNP） 和 gRNA 可降低脱靶概率。此外，gRNA和Cas9的修饰也可以减少脱靶效应44，

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢来自Liwen Bianji（Edanz）的Barbara Garbers博士编辑了这份手稿草稿的英文文本。这项工作得到了广东省重点领域研究与发展计划（2019B030335001）、国家重点研发计划（2019YFE0106700）、国家自然科学基金（32070819，31970782）和广东省水产经济动物病原生物学与流行病学重点实验室研究基金计划（PBEA2020YB05）的支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Sigma-AldrichA95391.5% 琼脂糖用于制造注射板
硼硅酸盐玻璃毛细管 Harvard ApparatusBS4 30-0016
细胞培养皿 Falcon351029
ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒VazymeC115试剂盒用于输液克隆 
密码子优化服务Sangon Biotech
Drummond MicrocapsDrummond MicrocapsP1299-1PAK长度：32 mm，容量：0.5 μL
EasyEdit gRNA 服务金斯瑞
精细镊子精细科学仪器11254-20用于打破 meedle
火焰/棕色微量移液器拉拔器 口吃仪器P-97用于拉动玻璃毛细管热
启动Taq PCR StarMixGenstarA033-101PCR反应
人工气候盒TENLINPRX-1000A用于培养斑马鱼胚胎
甲基纤维素Sigma-AldrichM0512在拍摄时固定斑马鱼Microloader
移液器尖端 Eppendorf5242956003
mMACHINE 套装 
Mut Express II 快速诱变试剂盒 V2VazymeC214-01定点诱变试剂盒
气动显微注射器ZGene BiotechZGPCP-1500 PLUS
pT3TS-zSpCas9Addgene46757
RNeasy FFPE 试剂盒 RNA 纯化Qiagen73504
Sanger 测序服务Sangon Biotech
氢氧化钠，颗粒SangonA100173-0500NaOH 用于基因组提取
立体显微镜奥林巴斯 SZX10用于表型照片
SZ 系列变焦体视显微镜CNOPTECSZ650
T3 mMESSAGEAmbionAM1348用于体外转录的试剂盒 
TIANprep 小型质粒试剂盒TIANGENDP103-03质粒提取试剂盒
TIANquick 小型纯化试剂盒TIANgenDP203-02化质粒纯化试剂盒
卡因Sigma-AldrichE10521用于麻醉斑马鱼
Tris（羟甲基）氨基甲烷SangonA600194-0500Tris· 的组分;用于基因组提取的 HCl
XbaINew England BiolabsR0145S用于质粒线性化的限制性核酸内切酶
用于智能用于用于 的 试剂盒状 线性三

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eichler, E. E., et al. Completing the map of human genetic variation. Nature. 447 (7141), 161-165 (2007).
  2. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23 (3), 347-354 (2017....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

PAM CRISPR Cas9 gRNA

相关文章