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基于质谱分析蛋白质高级结构的方法

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DOI：

10.3791/64979

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2023年3月3日

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

本文内容

摘要

文章讨论：

埃斯皮诺， J. A.， 琼斯， LM体内羟基自由基蛋白足迹，用于研究秀丽隐杆线虫中的蛋白质相互作用。可视化实验杂志。（158），e60910 （2020）。

Chea， E. E.， Rinas， A.， Espino， JA， Jones， LM 用蛋白质的细胞内快速光化学氧化表征细胞蛋白质。可视化实验杂志。（157），e60911 （2020）。

Moorthy， BS， Iyer， LK， Topp， EM 研究冻干粉中蛋白质结构和相互作用的质谱方法。可视化实验杂志。（98），e52503 （2015）。

Habibi， Y.， Thibodeaux， CJ用于研究肽生物合成酶的氢-氘交换质谱 （HDX-MS） 平台。可视化实验杂志。（159），e61053 （2020）。

Kirsch， Z. J.， Arden， BG， Vachet， RW， Limpikirati， P. 用焦碳酸二乙酯共价标记通过质谱法研究蛋白质高级结构。可视化实验杂志。（172），e61983 （2021）。

Johnson， D.， Punshon-Smith， B.， Espino， J. A.， Gershenson， A.， Jones， LM 带可移动 XY 载物台的平台培养箱：一种实现蛋白质细胞内快速光化学氧化的新平台。可视化实验杂志。（171），e62153 （2021）。

Haupt， C. et al. 结合完整蛋白质复合物的化学交联和质谱法来研究多亚基蛋白质组装体的结构。可视化实验杂志。（129），e56747 （2017）。

Lento， C. et al. 用于研究蛋白质结构和动力学的时间分辨电喷雾电离氢-氘交换质谱法。可视化实验杂志。（122），e55464 （2017）。

Weinberger， S. R.， Chea， E. E.， Sharp， J. S.， Misra， S. K. 无激光羟基自由基蛋白足迹，用于对蛋白质进行高阶结构分析。可视化实验杂志。（172），e61861 （2021）。

Misra， S. K.， Sharp， J. S. 在蛋白质的快速光化学氧化中实现实时补偿，以测定蛋白质地形变化。可视化实验杂志。（163），e61580 （2020）。

Chaihu， L. et al. 基于毛细管电泳的氢/氘交换，用于使用自上而下的质谱法对蛋白质进行构象表征。可视化实验杂志。（172），e62672 （2021）。

社论

高阶结构 （HOS） 是蛋白质表征的一个重要方面，因为它与蛋白质功能密切相关。质谱（MS）是评估蛋白质HOS1的关键方法之一。虽然基于质谱的方法无法以原子分辨率解析蛋白质结构，但具有中高空间分辨率、高特异性、低样品量要求、高通量和蛋白质组学能力等优点。

基于质谱的蛋白质足迹方法通过分析蛋白质的溶剂可及表面来评估蛋白质 HOS，它们通常与不同的化学标记方法相结合。可逆标记，例如通过氢氘交换 （HDX），靶向蛋白质 1,2 中的主链酰胺氢。不可逆标记利用靶向特定氨基酸残基的化学物质3 或以更高的反应速度标记各种不同残基的自由基1。化学交联也是不可逆标记类别的一部分，但其二价特征允许确定两个交联位点之间的空间约束，这提供了独特的拓扑见解4,5。所有这些方法都可以组合成一个“工具箱”，使MS成为阐明蛋白质HOS的宝贵工具。

我们组织了这个方法集合，以展示基于MS的蛋白质HOS分析领域的最新进展。第一组文章介绍了基于 HDX 的方法。Habibi和Thibodeaux6 描述了一种相对经典的连续、自下而上的HDX-MS方法。通过多次交换时间进行溶液中氢-氘 （H/D） 交换，然后进行柱上胃蛋白酶酶解，可以在肽水平上测定氘摄取水平。在进行差异实验（即结合状态与未结合状态）时，显示氘摄取水平增加或减少的肽代表 HOS 发生变化的区域。作者使用兰硫肽合成酶很好地演示了 HDX-MS 工作流程。

除了自下而上的方法外，HDX-MS还可以以自上而下的方式进行，使分析人员能够在完整蛋白质水平上应用不同的分离策略。Chaihu等人7利用毛细管电泳分离溶液中共存的不同蛋白质状态或蛋白质形式。蛋白质在电泳过程中经历H / D交换，同时在氘代背景电解质溶液的毛细管中迁移，然后进行自上而下的MS分析和气相碎裂，以评估全局和片段水平的氘摄取水平。最后，本系列中还有另外两种方法突出了不同的H / D交换方法，即冻干功率8的交换和电喷雾电离9后的交换。

第二组文章涵盖了不可逆标记方法。其中，蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）利用自由基作为标记物质来标记蛋白质表面10,11。在实践中，过氧化氢通过激光光活化产生羟基自由基，作为活性标记物质。Misra 和 Sharp12 提出了一种自由基剂量测定策略，其中腺嘌呤用作自由基浓度的报告基因，并使用在线自由基剂量测定系统来监测腺嘌呤反应。这允许对羟基自由基浓度进行实时补偿，从而使反应条件归一化，从而提供准确的读数。随后，Weinberger 和 Chea 与夏普小组合作开发了无激光 FPOP 平台13。通过用等离子体光源代替危险激光，并将其与在线自由基剂量测定和自动样本采集系统相结合，他们为需要表征蛋白质 HOS 的研究人员开发并提供了集成解决方案。

琼斯小组14、15、16 的三篇文章探讨了将 FPOP 和蛋白质足迹引入 体内 研究的可能性。这种方法的优势是前所未有的，因为它允许在天然环境中分析蛋白质 HOS。足迹在细胞14 和 秀丽隐杆线虫15 中的成功应用为跟踪整个蛋白质组在其天然状态下的 HOS 开辟了新的可能性，从而可以深入了解蛋白质 HOS，这是其他工具无法实现的。

不可逆标记的另一种重要方法是利用针对特定氨基酸残基的化学试剂3。Kirsch等人17 报告了通过共价标记得到充分利用的蛋白质足迹工作流程。以焦碳酸二乙酯为标记试剂，通过标记蛋白质表面的几种氨基酸残基来探查蛋白质HOS的变化。通过差异实验，然后进行蛋白水解酶解和自下而上的质谱分析，该工作流程共同可以识别溶剂可及性的变化，这与居屋的变化直接相关。

最后，化学交联是另一种利用二价化学试剂标记蛋白质的重要方法 4,5。化学交联剂用于交联两种在空间上彼此靠近并且通常形成结构复合物的蛋白质。Haupt等人18报告了一种协议，其中他们演示了使用化学交联剂来理解蛋白质复合物的结构。交联蛋白复合物可以在两个不同的水平上进行分析。通过蛋白水解消化和质谱鉴定，交联的二肽揭示了蛋白质复合物的相互作用位点。当通过完整质量分析交联样品时，复合物内蛋白质亚基的化学计量信息很容易获得。

总而言之，在过去的三十年中，我们见证了基于质谱的蛋白质 HOS 分析工具的长足发展。不可逆和可逆的足迹与 MS 分析相辅相成，它们共同对蛋白质 HOS 表征做出了重大贡献。该方法集中的作品代表了基于 MS 的蛋白质 HOS 分析领域的前沿方法;对于试图利用基于 MS 的方法来回答关键问题的研究人员来说，这些研究是宝贵的资源。从更广泛的角度来看，将足迹数据纳入结构预测对于打破基于 MS 的方法的空间分辨率极限至关重要。存在证明这种方法的可行性的开创性工作19,20。此外，平台集成也至关重要，因为这些方法是相辅相成的，并从不同的角度提供见解21,22。本集中报告的方法证明了这种整合的力量，并且将朝着这个方向不断发展。随着所有这些进步，基于质谱的方法已经超越了分子量测定，并且在未来几十年内该领域将持续增长。

披露

作者没有什么可透露的。

参考文献

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