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方法文章

以下丘脑Kisspeptin神经元为靶点的全细胞膜片钳记录

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DOI：

10.3791/64989

⸱

2023年3月17日

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

本文内容

摘要

本文介绍了一种在含有促性腺激素释放激素（GnRH）细胞主要调节因子——kisspeptin神经元的脑切片上进行全细胞膜片钳记录的实验方案。过去20年来，该电生理技术通过提供关于kisspeptin神经元活动的新知识，为神经内分泌学领域的重大进展奠定了基础。

摘要

吻肽对下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的成熟和生育能力至关重要。位于下丘脑前腹侧室周核和嘴侧室周核以及下丘脑弓状核的吻肽神经元，投射至促性腺激素释放激素（GnRH）神经元及其他细胞。先前的研究表明，吻肽通过Kiss1受体（Kiss1r）介导信号传导，最终激活GnRH神经元的活动。在人类和实验动物模型中，吻肽足以诱导GnRH的分泌，从而引发黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的释放。由于吻肽在生殖功能中发挥关键作用，研究人员正致力于评估下丘脑吻肽神经元的内在活动如何参与生殖相关行为，并鉴定能够改变这些特性的主要神经递质/神经调质。全细胞膜片钳技术已成为研究啮齿类动物吻肽神经元活动的重要工具。该实验技术使研究人员能够记录和测量细胞膜的自发性兴奋性和抑制性离子电流、静息膜电位、动作电位发放以及其他电生理特性。本研究综述了全细胞膜片钳技术的关键方面，即定义下丘脑吻肽神经元的电生理学测量方法，并讨论了与该技术相关的若干重要问题。

引言

霍奇金（Hodgkin）和赫胥黎（Huxley）首次在多个科学研究中记录到了动作电位的细胞内电活动。该记录是在枪乌贼的轴突上进行的，其轴突直径较大（约500 µm），便于将微电极插入轴突内部。这项工作为科学研究开辟了广阔前景，并最终促成了电压钳技术的诞生，该技术被用于研究动作电位产生的离子基础1,2,3,4,5,6,7,8。多年来，该技术不断改进，现已广泛应用于科学研究6,9。膜片钳技术于20世纪70年代末由厄温·内尔（Erwin Neher）和贝尔特·萨克曼（Bert Sakmann）率先研究并发明，使研究人员仅用一根电极即可几乎在所有类型的细胞中记录单个离子通道以及细胞内膜电位或电流9,10,11,12。膜片钳记录可在多种组织样本上进行，例如培养细胞或组织切片，既可在电压钳模式下（将细胞膜电位固定在设定值，从而记录如电压依赖性电流和突触电流等），也可在电流钳模式下（用于记录如离子电流引起的静息膜电位变化、动作电位以及突触后电位频率等）。

膜片钳技术的应用使得多项重要发现成为可能。事实上，关于位于前腹侧室周核和吻侧室周核（AVPV/PeNKisspeptin）的下丘脑吻肽神经元的电生理特性研究具有特别重要的意义，该区域也被称为第三脑室吻侧室周区（RP3V），以及下丘脑弓状核（ARHkisspeptin）13,14,15。2010年，Ducret 等人利用另一种电生理工具——松散式细胞膜片钳技术，首次在小鼠中记录了AVPV/PeNKisspeptin神经元的电活动。这些研究提供了对AVPV/PeNKisspeptin神经元的电学特征描述，并证明其放电模式依赖于动情周期16。2011年，Qiu 等人采用全细胞膜片钳技术，证明ARHkisspeptin神经元表达内源性起搏电流17。随后，Gottsch 等人发现吻肽神经元具有自发性电活动，并同时表达h型（起搏器）电流和T型钙电流，提示ARHkisspeptin神经元在电生理特性上与其他中枢神经系统起搏神经元具有相似性18。此外，已有研究表明ARHkisspeptin神经元的放电频率具有性二态性，而AVPV/PeNKisspeptin神经元则表现出受ATP敏感性钾通道（KATP）调控的双峰型静息膜电位（RMP）19,20。进一步研究证实，性腺类固醇激素可正向调节小鼠吻肽神经元的自发性电活动19,20,21。早期研究已提及对吻肽神经元电生理特性的初步探索16,17,18,19,20。此后，大量研究采用全细胞膜片钳技术，揭示了哪些因子或神经调质足以调节吻肽神经元的电活动（图1）17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。

鉴于该技术对于研究生殖相关神经元以及其他未在本文中涵盖的细胞类型具有重要意义，本文介绍了全细胞膜片钳技术开发的基本步骤，例如溶液的配制、脑组织的分离与切片，以及形成细胞膜封接以进行记录。此外，还讨论了该技术的相关问题，包括其优势、技术局限性以及为获得最佳实验效果必须控制的重要变量。

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方案

所有动物实验程序均经圣保罗大学生物医学科学研究所动物伦理委员会批准，并按照巴西动物实验协会采用的伦理准则进行。

1. 溶液的配制

  1. 内液的配制
    注意：内液用于填充膜片钳微电极，将与细胞内部接触（参见图2中的示例）。内液的成分可能根据所测量的活动类型而有所不同33。
    1. 根据实验目的和所需的记录模式选择合适的内液。若需在电流钳模式下记录膜电位，应使用以下成分的内液：120 mM K-葡萄糖酸盐、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、3 mM KOH、10 mM KCl 和 4 mM (Mg)-ATP。按照表1中所示的目标终体积称取所有盐类。
    2. 加入足够量的去离子水，使溶液体积达到终体积的90%，以预留空间用于调节pH值和渗透压。
    3. 在充分混合所有组分后，使用pH计并以5 M KOH将pH值调节至7.2–7.3。使用渗透压计检测渗透压，应约为275–280 mOsm（如有必要，仅可向下调节）。
    4. 可提前配制内液，并在8 °C下保存。ATP需在实验当天加入。含ATP的内液分装为1 mL等份后，于-20 °C保存，可使用3–4个月。
  2. 切片液的配制
    1. 配制切片液，其成分为238 mM蔗糖、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.0 mM NaH2PO4、10 mM葡萄糖、1.0 mM CaCl2和5.0 mM MgCl2。根据表2中所示的目标终体积称取所有盐类。所需配制的该溶液具体体积取决于切片室的大小。
    2. 在去离子水中混合所有盐类时，持续通入碳合气（95% O2 和 5% CO2）。将聚乙烯管（外径1.57 mm，内径1.14 mm）连接至碳合气钢瓶，将气体导入切片液中。将管子的开口端置于盛有切片液的烧杯内。
    3. 在充分混合所有组分后，使用pH计并以10%硝酸将pH值调节至7.3。使用渗透压计检测渗透压，应为290–295 mOsm（如有必要，仅可向下调节）。随后将溶液冷却至0–2 °C。
  3. 配制用于记录的aCSF溶液
    1. 配制用于记录的人工脑脊液（aCSF）溶液，其成分为124 mM NaCl、2.8 mM KCl、26 mM NaHCO3、1.25 mM NaH2PO4、1.2 mM MgSO4、5 mM葡萄糖和2.5 mM CaCl2。根据表3中所示的目标终体积称取 所有盐类。
    2. 在去离子水中混合所有盐类时，持续通入碳合气（95% O2 和 5% CO2），操作同步骤1.2.2所述。
    3. 在加入并充分混合所有组分后，使用pH计将pH值调节至7.3（可使用10%硝酸）。使用渗透压计检测渗透压，应为290–300 mOsm。随后将aCSF倒入烧杯中，并置于30 °C水浴中维持温度。

2. 脑组织解剖与切片

注意：由于不同的脑结构可能需要以不同切面（冠状面、矢状面或水平面切片）进行切割，因此获取切片的具体方法取决于目标脑区。通常，为了研究位于视前区腹内侧部/前连合周围核（AVPV/PeN）和下丘脑弓状核（ARH）中表达Kiss1的细胞（本文中称为 AVPV/PeNKisspeptin 神经元和 ARHkisspeptin 神经元；图 2A、B），通常制备冠状面脑切片（200–300 µm）17,19,20,21,34。AVPV/PeNKisspeptin 神经元位于前囟（bregma）后约 0.5 至 -0.22 mm 处，而 ARHkisspeptin 神经元则位于 -1.22 至 -2.70 mm 处。核团位置可通过立体定位小鼠脑图谱35 或艾伦小鼠脑参考图谱（http://mouse.brain-map.org/）确定。本研究使用成年雌性（动情周期静止期）和雄性 Kiss1-Cre/GFP 小鼠36。

  1. 取出大脑
    1. 准备解剖场地及提取大脑所需的工具：断头剪、虹膜剪、Castroviejo弯剪、骨凿、镊子、刮匙、滤纸、培养皿、剃刀刀片和氰基丙烯酸酯胶水。
    2. 在切片前准备好进行解剖的操作台，因为所有后续操作都必须迅速完成。确保可使用切片装置，例如振动切片机（vibratome）。
    3. 在组织切片前准备一个记录用孵育槽，用于维持脑片。可从商业品牌获取一个规格为24 mm × 15 mm × 2 mm（长×宽×高）的孵育槽（材料表），或自行制作。
      注：自制恢复孵育槽的制作方法如下：将一个24孔板裁剪，保留九个孔。将尼龙网固定在九个孔的底部。利用剩余的孔板材料制作一个底座，使尼龙网的下部悬空。此改装底座可置于盛有aCSF的500 mL烧杯中（补充图1）。
    4. 完成所有准备工作后，使用4%–5%异氟烷吸入麻醉剂对动物实施麻醉。麻醉操作必须符合伦理委员会批准的实验方案。动物失去活动能力后，立即进行尾部和足部夹捏测试，确认动物已处于深度麻醉状态。
    5. 在心脏仍处于活动状态时迅速断头，以提高细胞存活率。断头后立即取出大脑。
    6. 使用手术剪从尾侧向头侧方向在动物颅骨顶部皮肤做切口，剥离头皮。接着用虹膜剪沿矢状缝剪开顶骨间骨板，并移除枕骨。将骨凿插入顶骨下方，轻轻撬起直至暴露大脑。
    7. 暴露大脑后，将头部倒置，轻柔下压大脑以观察两侧三叉神经，随后使用Castroviejo弯剪切断三叉神经。观察到下丘脑后，辨认视神经并轻柔切断。
      注：切断视神经时需格外小心，牵拉视神经可能导致邻近含有AVPV/PeN核团的下丘脑区域撕裂。
    8. 切断额叶最前部，完全取出大脑。立即将大脑浸入切片液中，直至完成切片制备。
  2. 脑组织切片
    1. 将大脑置于滤纸上（放置于培养皿内）以吸除多余液体。随后使用锋利的剃刀刀片进行冠状面切割，分离脑干与小脑部分与其他脑组织。
    2. 接着将脑组织尾侧部分粘附至振动切片机底座上，并向切片装置的腔室中加入冷却至0–2 °C的切片液/aCSF。操作过程中，在振动切片机腔室周围放置干冰以维持切片液低温。
    3. 将剃刀刀片装入振动切片机，并设定合适的切片参数：速度 = 3，频率 = 9，进给 = 250 μm。使用丙烯酸转移移液管（连接硅胶乳头的倒置巴斯德玻璃移液管）在切片过程中将脑片转移至恢复孵育槽（见步骤2.1.3所述）。脑片获取后，等待60分钟以完成组织恢复。

3. 记录用细胞封接

  1. 确保在开始记录之前，所有设备（显微镜、放大器、数模转换器、显微操作器及其他设备）均已开启。
  2. 填充记录室，来自商业品牌（材料表），用 aCSF 溶液进行记录，并将其固定在显微镜上。使用灌流泵以 2 mL/min 的速度持续灌流 aCSF。
  3. 将感兴趣的脑切片（一次一片）转移至记录室。使用丙烯酸转移移液管（连接硅胶吸头的倒置巴斯德玻璃移液管）将下丘脑切片转移至记录室。使用切片固定器（材料表) 以固定脑片，防止其在人工脑脊液（aCSF）灌注过程中移动。
  4. 将脑片置于显微镜下记录室中央。脑片的位置至关重要，需确保在显微镜下能够清晰观察目标区域，同时便于记录微电极准确到达该区域。
  5. 使用浸入式显微镜的低倍物镜（10x 或 20x）辅助定位脑片并找到目标区域。
  6. 找到目标区域后，切换物镜至高倍镜（63x），聚焦于组织层面，观察目标区域内细胞的内源性荧光蛋白及其形态，以定位脑切片表面的kisspeptin细胞20.
  7. 当定位到可能的目标细胞时，使用鼠标光标在计算机屏幕上标记该细胞，或在目标区域绘制某种图形（如方形）进行标记。屏幕上的标记有助于引导记录用微电极移至该细胞位置。
  8. 确定目标细胞的精确位置后，抬起物镜，引入装有内液的记录微电极。将微电极置于电极夹持器中时，应确保内液与银电极接触。
    注意：有关微量移液管的制备、放置及其在电极架上的定位，请参见33.
  9. 在将微移液管浸入aCSF溶液之前，通过连接至微移液管持夹的聚乙烯管路，使用一个充满1–3 mL空气的注射器施加正压，以防止碎屑进入微移液管≈130 厘米更长）；施加近 100–200 μ升空气
  10. 使用显微操作器将微移液管引导至物镜中心下方。调节显微操作器上的按钮，沿X-Y-Z轴方向移动微移液管，使其对准目标细胞。
  11. 调整焦距以观察微移液管尖端，并将焦平面逐渐移近脑片，但不可过于接近。降低显微操作器的速度，缓慢将微移液管下降至焦平面上。确保微移液管尖端不会突然刺入脑片，而是缓慢下降直至接触细胞/目标区域表面。
  12. 施加轻微正压（≈100 μ用装有1-3 mL空气的注射器连接至微电极 holder，以清除进路中的任何碎片。
  13. 将目标细胞置于视野中央，缓慢调节显微操作仪的 X-Y-Z 轴，使微电极逐渐接近目标细胞。当微电极接触细胞时，可观察到由微电极尖端施加压力所致的细胞膜凹陷现象（图 2C).
  14. 形成凹陷后，由于微移液管靠近细胞，通过连接微移液管夹持器的管子用嘴施加短暂而轻微的负压（1–2 秒），以在微移液管与细胞之间形成密封（吉欧姆密封或吉格密封） >1 GΩ; 图2D）。为形成封接，请在软件中使用电压钳模式。有关封接形成的详细信息，请参见33.
  15. 如果密封保持稳定（吉欧密封应机械稳定且无噪声干扰，通过约1分钟的观察确定），将钳制电压设定为所研究细胞最接近的生理静息电位。对于下丘脑的kisspeptin神经元，建议设定为-50 mV。
  16. 用微吸管封接细胞后，通过口腔施加短暂吸力（负压）以破裂细胞膜图2E). 当施加足够力度进行抽吸，使破裂的膜不会堵塞微电极，也不会吸引大量膜成分甚至整个细胞时，即可获得良好的全细胞记录构型。
  17. 检查所使用的系统设置手册。使用软件（参见 材料表) 以数字方式检测并计算串联电阻（SR）和全细胞电容（wcc）。
  18. 在电压钳模式下，破膜后启用全细胞选项，并点击与全细胞标签相关的自动命令。细胞的串联电阻（SR）和全细胞电容（wcc）将由软件自动计算并实时显示。这些参数也可通过前述放大器执行膜测试来验证。 材料表33.
  19. 务必检查细胞活力参数。对于kisspeptin神经元，需确认电生理学测量指标为：SR < 25 mΩ输入电阻 > 0.3 GΩ，以及保持电流的绝对值 < 30 pA（个人观察及参考文献）21）。AVPV/PeN 的 wcc 平均值Kisspeptin 或弓状核（ARH）吻支素 神经元是 ≈ 10–12 pF，在性腺完整的 小鼠 中20.
  20. 实验过程中监测串联电阻（SR）和细胞稳态电容。确保记录期间串联电阻变化不超过20%，且膜电容保持稳定。
  21. 检查软件设置。根据实验类型创建特定的记录方案。使用前述设备，在电流钳模式下记录膜电位时， 材料表，将电生理信号在2-4 kHz进行低通滤波，并在软件中离线分析结果（参见 材料表 有关软件信息）。
  22. 全细胞构型建立成功后，在电压钳模式下测量突触电流（图 2G）。在电流钳模式下记录静息膜电位（RMP）的变化以及诱导的RMP波动。图2H）。通过向浴液中添加已知药物/神经递质（如步骤3.2所述），可诱导静息膜电位（RMP）的变化，例如细胞膜去极化，如图所示 图1.
    注意：在电流钳模式下，可注入正电流或负电流以将膜电位钳制在所需的电压水平。对于kisspeptin神经元，我们通常设置零电流注入（I = 0）以记录膜电位的自发性波动。

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结果

为了研究人重组生长激素（hGH）对下丘脑kisspeptin神经元活动的可能影响，我们在脑切片中进行了全细胞膜片钳记录，并评估该激素是否会引起AVPV/PeNKisspeptin和ARHkisspeptin神经元活动的急性变化。本研究使用成年Kiss1-Cre/GFP雌性（动情间期）和雄性小鼠36。实验选用性腺完整的动物，因为其下丘脑kisspeptin神经元的特性可能随性类固醇激素水平的变化而有所不同19,20。尽管评估性别间差异超出了本研究的范围，但读者可参考Croft等和Frazão等的研究以获取更多信息19,20。转基因动物（如小鼠和大鼠）是此类实验的重要工具，因为表达特定基因或经选择性诱导敲除的细胞可通过GFP等荧光蛋白进行识别23,<...

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讨论

全细胞膜片钳技术的发展对科学界产生了重大影响，该技术被认为对推动科学研究和实现多项发现具有至关重要的意义。其在科学领域的影响之大，最终促成了1991年诺贝尔生理学或医学奖的颁发，因为这一发现为深入理解离子通道在生理和病理条件下的功能机制打开了大门，同时也为识别潜在的药物治疗靶点提供了可能11,39,40,41。在医学领域，利用该技术取得的一项突出成果是发现多种临床使用的物质可直接与离子通道相互作用（例如局部麻醉药、抗心律失常药、降糖药和肌肉松弛剂）42。因此，该技术在临床机构和基础研究部门均具有显著的应用价值。本文描述了在包含下丘脑kisspeptin神经元的脑切片上进行全细胞膜片钳实验所需的基本制备流程。我们概述了基本操作步骤，并强调了在组织获取及溶液配制过程中必须严格控制的关键参数。然而，本文无法全面涵盖该技术的全部复杂性以及各类记...

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披露

无任何利益冲突需要声明。

致谢

本研究由圣保罗研究基金会资助［FAPESP 资助编号：2021/11551-4（JNS）、2015/20198-5（TTZ）、2019/21707/1（RF）］；以及由高等级人员进修协调办公室（CAPES）—资助代码 001"（HRV）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人工脑脊液、细胞内液及切片溶液所用化合物
ATPSigma Aldrich/多种来源A9187
CaCl2Sigma Aldrich/多种来源C7902
D-(+)-葡萄糖Sigma Aldrich/多种来源G7021
EGTASigma Aldrich/多种来源O3777
HEPESSigma Aldrich/多种来源H3375
KClSigma Aldrich/多种来源P5405
K-葡萄糖酸盐Sigma Aldrich/多种来源G4500
KOHSigma Aldrich/多种来源P5958
MgCl2Sigma Aldrich/多种来源M9272
MgSO4Sigma Aldrich/多种来源230391
NaClSigma Aldrich/多种来源S5886
NaH2PO4 Sigma Aldrich/多种来源S5011
NaHCO3Sigma Aldrich/多种来源S5761
硝酸Sigma Aldrich/多种来源225711注意
蔗糖Sigma Aldrich/多种来源S1888
设备
气浮台TMC63-534
放大器分子设备公司（Molecular Devices）Multiclamp 700B
计算机多种来源-
DIGIDATA 1440 低噪声数据采集系统分子设备公司（Molecular Devices）DD1440
数字蠕动泵IsmatecISM833C 
法拉第笼TMC81-333-03
成像相机徕卡（Leica）DFC 365 FX
显微操作器Sutter InstrumentsRoe-200
微电极拉制仪成机（Narishige）PC-10
显微镜徕卡（Leica）DM6000 FS
骨凿Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源128
恢复室华纳仪器公司（Warner Instruments）/哈佛仪器公司（Harvard apparatus）-可自行制作
记录室华纳仪器公司（Warner Instruments）640277
刮勺费舍尔科学公司（Fisher Scientific）/多种来源FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
振动切片机 徕卡（Leica）VT1000 S
水浴锅 费舍尔科学公司（Fisher Scientific）/多种来源Isotemp
软件与系统
AxoScope 10 软件分子设备公司（Molecular Devices）-控制软件
LAS X 宽场成像系统徕卡（Leica）-图像采集与分析
MultiClamp 700B分子设备公司（Molecular Devices）MULTICLAMP 700B控制软件
PCLAMP 10 WINDOWS 版软件分子设备公司（Molecular Devices）Pclamp 10 Standard
工具
银/氯化银电极（颗粒型，1.0 mm）华纳仪器公司（Warner Instruments）64-1309
弯止血钳多种来源-
氰基丙烯酸酯胶乐泰（LOCTITE）/多种来源-
断头剪多种来源-
滤纸多种来源-
玻璃毛细管（微电极）世界精密仪器公司（World Precision Instruments, Inc）TW150F-4
虹膜剪Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源65-66
巴斯德玻璃移液管 Sigma Aldrich/多种来源CLS7095B9-1000EA
培养皿多种来源-
聚乙烯管 华纳仪器公司（Warner Instruments）64-0756
脑组织解剖用刀片TED PELLATEDP-121-1
振动切片机用刀片TED PELLATEDP-121-9
剪刀Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源71-72, 48,49; 
硅胶奶嘴多种来源-
切片固定锚 华纳仪器公司（Warner Instruments）64-0246
注射器滤器默克密理博有限公司（Merck Millipore Ltda）SLGVR13SLMillex-GV 0.22 μm
镊子Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源131, 1518

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