以下丘脑Kisspeptin神经元为靶点的全细胞膜片钳记录

摘要

本文介绍了一种在含有促性腺激素释放激素（GnRH）细胞主要调节因子——kisspeptin神经元的脑切片上进行全细胞膜片钳记录的实验方案。过去20年来，该电生理技术通过提供关于kisspeptin神经元活动的新知识，为神经内分泌学领域的重大进展奠定了基础。

摘要

吻肽对下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴的成熟和生育能力至关重要。位于下丘脑前腹侧室周核和嘴侧室周核以及下丘脑弓状核的吻肽神经元，投射至促性腺激素释放激素（GnRH）神经元及其他细胞。先前的研究表明，吻肽通过Kiss1受体（Kiss1r）介导信号传导，最终激活GnRH神经元的活动。在人类和实验动物模型中，吻肽足以诱导GnRH的分泌，从而引发黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的释放。由于吻肽在生殖功能中发挥关键作用，研究人员正致力于评估下丘脑吻肽神经元的内在活动如何参与生殖相关行为，并鉴定能够改变这些特性的主要神经递质/神经调质。全细胞膜片钳技术已成为研究啮齿类动物吻肽神经元活动的重要工具。该实验技术使研究人员能够记录和测量细胞膜的自发性兴奋性和抑制性离子电流、静息膜电位、动作电位发放以及其他电生理特性。本研究综述了全细胞膜片钳技术的关键方面，即定义下丘脑吻肽神经元的电生理学测量方法，并讨论了与该技术相关的若干重要问题。

引言

霍奇金（Hodgkin）和赫胥黎（Huxley）首次在多个科学研究中记录到了动作电位的细胞内电活动。该记录是在枪乌贼的轴突上进行的，其轴突直径较大（约500 µm），便于将微电极插入轴突内部。这项工作为科学研究开辟了广阔前景，并最终促成了电压钳技术的诞生，该技术被用于研究动作电位产生的离子基础^{1,2,3,4,5,6,7,8}。多年来，该技术不断改进，现已广泛应用于科学研究^6,9。膜片钳技术于20世纪70年代末由厄温·内尔（Erwin Neher）和贝尔特·萨克曼（Bert Sakmann）率先研究并发明，使研究人员仅用一根电极即可几乎在所有类型的细胞中记录单个离子通道以及细胞内膜电位或电流^9,

方案

所有动物实验程序均经圣保罗大学生物医学科学研究所动物伦理委员会批准，并按照巴西动物实验协会采用的伦理准则进行。

1. 溶液的配制

1. 内液的配制
   注意：内液用于填充膜片钳微电极，将与细胞内部接触（参见图2中的示例）。内液的成分可能根据所测量的活动类型而有所不同³³。
   1. 根据实验目的和所需的记录模式选择合适的内液。若需在电流钳模式下记录膜电位，应使用以下成分的内液：120 mM K-葡萄糖酸盐、1 mM NaCl、5 mM EGTA、10 mM HEPES、1 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、3 mM KOH、10 mM KCl 和 4 mM (Mg)-ATP。按照表1中所示的目标终体积称取所有盐类。
   2. 加入足够量的去离子水，使溶液体积达到终体积的90%，以预留空间用于调节pH值和渗透压。
   3. 在充分混合所有组分后，使用pH计并以5 M KOH将pH值调节至7.2–7.3。使用渗透压计检测渗透压，应约为275–280 mOsm（如有必要，仅可向下调节）。
   4. 可提前配制内液，并在8 °C下保存。ATP需在实验当天加入。含ATP的内液分装为1 m....

结果

为了研究人重组生长激素（hGH）对下丘脑kisspeptin神经元活动的可能影响，我们在脑切片中进行了全细胞膜片钳记录，并评估该激素是否会引起AVPV/PeN^Kisspeptin和ARH^kisspeptin神经元活动的急性变化。本研究使用成年Kiss1-Cre/GFP雌性（动情间期）和雄性小鼠³⁶。实验选用性腺完整的动物，因为其下丘脑kisspeptin神经元的特性可能随性类固醇激素水平的变化而有所不同^19,20。尽管评估性别间差异超出了本研究的范围，但读者可参考Croft等和Frazão等的研究以获取更多信息^19,20。转基因动物（如小鼠和大鼠）是此类实验的重要工具，因为表达特定基因或经选择性诱导敲除的细胞可通过GFP等荧光蛋白进行识别^23,<.......

讨论

全细胞膜片钳技术的发展对科学界产生了重大影响，该技术被认为对推动科学研究和实现多项发现具有至关重要的意义。其在科学领域的影响之大，最终促成了1991年诺贝尔生理学或医学奖的颁发，因为这一发现为深入理解离子通道在生理和病理条件下的功能机制打开了大门，同时也为识别潜在的药物治疗靶点提供了可能^11,39,40,41。在医学领域，利用该技术取得的一项突出成果是发现多种临床使用的物质可直接与离子通道相互作用（例如局部麻醉药、抗心律失常药、降糖药和肌肉松弛剂）⁴²。因此，该技术在临床机构和基础研究部门均具有显著的应用价值。本文描述了在包含下丘脑kisspeptin神经元的脑切片上进行全细胞膜片钳实验所需的基本制备流程。我们概述了基本操作步骤，并强调了在组织获取及溶液配制过程中必须严格控制的关键参数。然而，本文无法全面涵盖该技术的全部复杂性以及各类记.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液、细胞内液及切片溶液所用化合物
ATP	Sigma Aldrich/多种来源	A9187
CaCl2	Sigma Aldrich/多种来源	C7902
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich/多种来源	G7021
EGTA	Sigma Aldrich/多种来源	O3777
HEPES	Sigma Aldrich/多种来源	H3375
KCl	Sigma Aldrich/多种来源	P5405
K-葡萄糖酸盐	Sigma Aldrich/多种来源	G4500
KOH	Sigma Aldrich/多种来源	P5958
MgCl2	Sigma Aldrich/多种来源	M9272
MgSO4	Sigma Aldrich/多种来源	230391
NaCl	Sigma Aldrich/多种来源	S5886
NaH2PO4	Sigma Aldrich/多种来源	S5011
NaHCO3	Sigma Aldrich/多种来源	S5761
硝酸	Sigma Aldrich/多种来源	225711	注意
蔗糖	Sigma Aldrich/多种来源	S1888
设备
气浮台	TMC	63-534
放大器	分子设备公司（Molecular Devices）	Multiclamp 700B
计算机	多种来源	-
DIGIDATA 1440 低噪声数据采集系统	分子设备公司（Molecular Devices）	DD1440
数字蠕动泵	Ismatec	ISM833C
法拉第笼	TMC	81-333-03
成像相机	徕卡（Leica）	DFC 365 FX
显微操作器	Sutter Instruments	Roe-200
微电极拉制仪	成机（Narishige）	PC-10
显微镜	徕卡（Leica）	DM6000 FS
骨凿	Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源	128
恢复室	华纳仪器公司（Warner Instruments）/哈佛仪器公司（Harvard apparatus）	-	可自行制作
记录室	华纳仪器公司（Warner Instruments）	640277
刮勺	费舍尔科学公司（Fisher Scientific）/多种来源	FISH-14-375-10; FISH-21-401-20
振动切片机	徕卡（Leica）	VT1000 S
水浴锅	费舍尔科学公司（Fisher Scientific）/多种来源	Isotemp
软件与系统
AxoScope 10 软件	分子设备公司（Molecular Devices）	-	控制软件
LAS X 宽场成像系统	徕卡（Leica）	-	图像采集与分析
MultiClamp 700B	分子设备公司（Molecular Devices）	MULTICLAMP 700B	控制软件
PCLAMP 10 WINDOWS 版软件	分子设备公司（Molecular Devices）	Pclamp 10 Standard
工具
银/氯化银电极（颗粒型，1.0 mm）	华纳仪器公司（Warner Instruments）	64-1309
弯止血钳	多种来源	-
氰基丙烯酸酯胶	乐泰（LOCTITE）/多种来源	-
断头剪	多种来源	-
滤纸	多种来源	-
玻璃毛细管（微电极）	世界精密仪器公司（World Precision Instruments, Inc）	TW150F-4
虹膜剪	Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源	65-66
巴斯德玻璃移液管	Sigma Aldrich/多种来源	CLS7095B9-1000EA
培养皿	多种来源	-
聚乙烯管	华纳仪器公司（Warner Instruments）	64-0756
脑组织解剖用刀片	TED PELLA	TEDP-121-1
振动切片机用刀片	TED PELLA	TEDP-121-9
剪刀	Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源	71-72, 48,49;
硅胶奶嘴	多种来源	-
切片固定锚	华纳仪器公司（Warner Instruments）	64-0246
注射器滤器	默克密理博有限公司（Merck Millipore Ltda）	SLGVR13SL	Millex-GV 0.22 μm
镊子	Bonther equipamentos & Tecnologia/多种来源	131, 1518