方法文章

节肢动物媒介的转基因作:研究媒介传播疾病的工具

2023年12月15日

本文内容

社论

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蚊子、蜱虫和白蛉等吸血节肢动物会传播几种医学相关的病原体,其中许多病原体研究不足且缺乏足够的治疗方法。因此,预防疾病传播往往需要针对节肢动物1.例如,综合病媒管理 (IVM) 是一个综合框架,旨在通过使用更具创新性的方法(例如遗传控制2)来增强杀虫剂等传统病媒控制方法的功效。这个特别的集合重点介绍了为研究和控制媒介传播疾病而产生的各种转基因节肢动物,以及开发此类转基因生物所需的技术和创造性技能。

节肢动物-病原体-宿主关系经过多年的进化,塑造了所有受影响物种的遗传学 3,4,5。模型系统通常不足以研究吸血节肢动物,因为它们的生物学和行为是物种特异性的。分子昆虫学家必须重建允许血液喂养和繁殖的复杂环境,以便可以在受控条件下在实验室中常规维护和研究单个物种。饲养食血节肢动物既需要生物学专业知识,也需要“技术人员的细致关注”6。因此,难怪媒介生物学处于基因创新的最前沿。

尽管本期特刊涵盖了跨不同属的转基因节肢动物的生成,但出现了一个中心主题:这个过程需要对细节的敏锐关注、对生物体生物学的敏锐理解以及创造性的思维方式。Louradour 等人 7 强调了将胚胎显微注射技术应用于产下非常小卵的 利什曼原 虫寄生虫(即白蛉)载体的挑战。将新鲜产下的鸡蛋转移到带有盖玻片的显微镜载玻片上的单块黑色滤纸上,并小心地排列以进行显微注射。湿度水平、制备材料的质量以及执行过程的谨慎程度只是决定该技术是否成功的几个变量。硬蜱卵显微注射带来了一系列明显的挑战——胚胎上厚厚的外部蜡层、硬绒毛膜和高椭圆内压8。Sharma 等人描述了肩 胛硬蜱 通过去除蜡层、软化绒毛膜和干燥卵来克服这些障碍的程序8.这些包括从产卵雌性身上消融Gené的器官(蜡腺),在产卵后24小时内收集卵,然后将卵放入1%(w / v)氯化钠溶液中约1小时,然后显微注射8

可以通过向蛹或成虫注射编辑或沉默基因的机制来规避胚胎显微注射。Benetta 等人使用两种卵巢递送方法——受体介导的 Cargo 卵巢转导 (ReMOT Control) 或支链两亲性肽胶囊 (BAPC)——以及寄生宝石黄蜂 Nasonia vitripennis 9 的两种注射策略(Femtojet 或吸气管)来描述这项技术将蛹排成一排,并用胶水附着在显微镜载玻片上,以促进注射过程并降低死亡率9。另一方面,成年人在冰上麻醉,以便用户可以在腹部注射期间用镊子支撑女性。

除了CRISPR/Cas9介导的基因编辑外,本期还涵盖了节肢动物中使用的其他基因工程技术,包括定点φC31重组酶和GAL4-UAS。前者,由Adolfi等人描述,在疟疾载体冈比亚按蚊和斯蒂芬西按蚊10中实现了attB侧翼转基因货物的定点整合,用于单一整合或重组酶介导的盒交换。该技术允许定点插入先前已建立的对接系,从而通过避免稳定遗传系10所需的位置效应和下游交配方案来简化验证。另一种技术,即二分 GAL4-UAS 系统,被 Poulton 等人用来生成转基因冈比亚按蚊,以时空、组织特异性方式表达转基因盒,即使以严重的适应性成本为代价11。由于其灵活性,该系统可以让研究人员筛选表型并推断出其他方式可能不可能的基因功能。

事实上,转基因货物通常会给节肢动物带来健康成本;因此,Williams 等人制定了测量转基因 埃及伊蚊 适应性成本的简单方案12.其中包括繁殖力、翅膀大小和形状、生育力、性别比例、活力、发育时间、雄性贡献和成年寿命12。这种适应度测量可用于比较跨研究产生的转基因蚊子的健康状况,或对数学模型中的转基因固定率进行建模。

这些手稿中的方法论细节进行了直观说明,以方便复制。提出了各种分子和昆虫学技术:对蚊蛹进行性别鉴定和筛选荧光标记物11,12;结合纯化供体和辅助体φC31质粒混合物10;腹腔注射成年宝石黄蜂9;将沙蝇卵排成一排进行显微注射7;和消融蜱蜡腺8.鉴于本期特刊涵盖的技术广度,业余爱好者和专家都被邀请来一睹生成转基因节肢动物的基础。这些技术是研究节肢动物生理学和媒介-病原体相互作用的基础,这对于开发减少媒介传播疾病的新策略至关重要。

披露

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作由 NIH(资助号 R01 AI130085)和 NIH 校内研究计划部资助:AI001246。

参考文献

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luckhart, S., Lindsay, S. W., James, A. A., Scott, T. W. Reframing critical needs in vector biology and management of vector-borne disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (2), e566(2010).
  2. Marcos-Marcos, J., et al. economic evaluation, and sustainability of integrated vector management in urban settings to prevent vector-borne diseases: a scoping review. Infectious Disease of Poverty. 7 (1), 83(2018).
  3. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. The role of vector saliva in transmission of arthropod-borne disease. Parasitology Today. 6 (5), 157-160 (1990).
  4. Ribeiro, J. M. Blood-feeding arthropods: live syringes or invertebrate pharmacologists. Infect Agents and Disease. 4 (3), 143-152 (1995).
  5. McManus, K. F., et al. Population genetic analysis of the DARC locus (Duffy) reveals adaptation from standing variation associated with malaria resistance in humans. PLOS Genetics. 13 (3), 1006560(2017).
  6. Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. The molecular biology of insect disease vectors: a methods manual. 1, Chapman & Hall. 3-20 (1997).
  7. Louradour, I., et al. Sand Fly (Phlebotomus papatasi) embryo microinjection for CRISPR/Cas9 mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (165), e61924(2020).
  8. Sharma, A., Pham, M., Harrell, R. A., Nuss, A. B., Gulia-Nuss, M. Embryo injection technique for gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis. Journal of Visualized Experiments. (187), e64142(2022).
  9. Benetta, E. D., Chaverra-Rodriguez, D., Rasgon, J. L., Akbari, O. S. Pupal and adult injections for RNAi and CRISPR gene editing in Nasonia vitripennis. Journal of Visualized Experiments. (166), e61892(2020).
  10. Adolfi, A., Lynd, A., Lycett, G. J., James, A. A. Site-directed φC31-mediated integration and cassette exchange in Anopheles vectors of malaria. Journal of Visualized Experiments. (168), e62146(2021).
  11. Poulton, B. C., et al. Using the GAL4-UAS system for functional genetics in Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. (170), e62131(2021).
  12. Williams, A., et al. Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (199), e65136(2023).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ResearchGenetic EngineeringDisease TransmissionEpidemiology

相关文章