硬膜下软皮质电图 （ECoG） 阵列植入和小型猪的长期皮质记录

摘要

在这里，我们提出了一种在小型猪模型中软硬膜下电极阵列的长期性能和安全性评估方法，描述了手术方法和工具、术后磁共振成像、听觉皮层的电生理学、植入物的电化学特性和死后免疫化学。

摘要

神经损伤和疾病可以使用皮质电图 （ECoG） 阵列进行诊断或治疗。在耐药性癫痫中，这些有助于划定要切除的癫痫区域。在脑机接口等长期应用中，这些皮质外层电极用于记录大脑的运动意图，以控制瘫痪患者的机器人肢体。然而，目前僵硬的电极网格并不能满足高分辨率大脑记录和长期生物整合的需求。最近，人们提出了适形电极阵列，以实现长期的植入物稳定性和高性能。然而，需要对这些新的植入技术进行临床前研究，以验证其转化为人类患者的长期功能和安全性。在这种情况下，猪模型因其器官尺寸大且易于动物处理而经常被用于开发医疗设备。然而，文献中只描述了少数大脑应用，主要是由于手术限制和植入系统在活体动物上的集成。

在这里，我们报告了长期植入（6个月）的方法和在minipig模型中评估软ECoG阵列的方法。该研究首先介绍了植入系统，该系统由一个软微加工电极阵列组成，该电极阵列集成了与磁共振成像 （MRI） 兼容的聚合物透皮端口，该端口包含用于电生理记录的仪器连接器。然后，该研究描述了从硬膜下植入到动物恢复的外科手术。我们以听觉皮层为例，通过声刺激诱导诱发电位。我们最后描述了一个数据采集序列，包括整个大脑的 MRI、植入物电化学表征、术中和自由移动的电生理学以及提取的大脑的免疫组织化学染色。

该模型可用于研究皮质假体新设计的安全性和功能;强制性临床前研究，以设想转化为人类患者。

引言

神经损伤和疾病可以使用皮质电图 （ECoG） 阵列进行诊断或治疗。这些电极网格被植入大脑表面，并允许记录或刺激人类皮层¹。例如，在耐药性癫痫的情况下，它们有助于描绘癫痫区域以切除²。在脑机接口等长期应用中，这些皮质外层电极用于记录大脑的运动意图，以控制瘫痪患者的机器人肢体³。然而，目前的电极网格由嵌入刚性聚合物基材中的刚性金属块制成，不能满足高分辨率大脑记录和长期硬膜下生物整合（>30 天）的需求。相反，它们会产生局部组织反应，导致植入装置的纤维化封装，导致性能随着时间的推移而变差。最近，使用通过微纳加工技术制造的薄聚合物基板的柔性或可拉伸电极阵列已被提出，通过限制组织反应在长期植入中实现高性能^4,5。然而，需要对这些新的植入技术进行临床前研究，以验证其长期功能和安全性，以便可以设想转化为人类患者。在这种情况下，小型猪和猪模型通常用于其他医疗环境（例如，心血管、骨骼或胃系统）的设备开发，因为它们的器官尺寸大且易于动物处理^6,7,8。然而，文献中只描述了少数针对大脑的神经生理学应用，主要是由于手术方法的局限性和植入系统在活体动物上的集成9,10,11,12。这些通常与活体动物的慢性植入不相容，因为它们需要开发复杂的硬件，例如可植入的嵌入式电子设备。此外，他们没有研究植入系统对目标组织的影响，这对于转化研究中的生物安全方面至关重要。猪模型在皮质结构、颅骨和皮肤厚度方面接近人体解剖结构¹³。此外，他们学习行为任务的能力使他们成为研究功能康复策略或感觉知觉的有力模型¹⁴.

将新技术和疗法转化为人类需要按照主管医疗当局的要求对安全性和有效性进行评估。这些通常在技术文件和规范¹⁵ 中描述，但它们只需要通过这些测试，而不调查设备植入的实际效果或在安全研究的同时收集其他有用数据。为了对大脑进行完整的生物安全性和性能研究，我们在这里展示了脑成像数据、电生理测量、植入电极电化学特性评估以及猪模型中死后组织学的纵向和系统收集。为了实现这一点，需要考虑几个方面，以便创建一个完整的实验模型:（i）用于设备植入的微创手术通路以及用于连接到电极的机械稳定的透皮端口，（ii）强大的电生理记录范式，在麻醉和自由移动条件下作为植入电极的性能输出， （iii） 不同时间点的 活体 成像（计算机断层扫描 [CT] 和/或磁共振成像 [MRI]），以跟踪大脑和植入物的演变，以及植入系统与成像设备的兼容性，以及 （iv） 提取大脑进行组织学分析的组织制备管道。

在这里，我们报告了长期植入（6个月）的方法和在minipig模型中评估软ECoG阵列的方法（如图1所示）。软电极阵列在我们之前的报告中介绍过，由嵌入弹性金薄膜的薄硅胶膜制成，用作电轨道^16,17。与组织的接触是通过嵌入有机硅基质中的铂纳米颗粒的混合物来实现的，以获得与脑组织¹⁸的柔软而有效的电化学界面。植入物通过一根柔性电缆通过硬膜下穿过颅骨和皮肤连接到动物头部的透皮端口，该端口将连接器装在动物头部。植入物的大小和形状可以根据目标和研究的需要进行定制。本研究中的电流电极条反映了临床条的实际尺寸。使用相同的方法使用临床可用的硬膜下条带和网格作为对照。聚合物 MRI 兼容透皮端口使用脚踏板系统放置在颅骨上，该系统将其牢固地固定在颅骨上。在这里，我们详细描述了从双半球硬膜下植入到动物恢复的外科手术。我们以听觉皮层为例，在麻醉和自由移动的条件下，通过声刺激诱导诱发电位。在不同的时间点，在麻醉下通过MRI（或临床电极的CT）对动物的大脑进行成像，并测量电极的电化学性质。电极表征方法用于跟踪植入物和电极-组织界面的演变（详见Schiavone等人¹⁹）。其中包括用于探测电极接触刺激能力的计时电流法、可以指示电极电阻和电容成分演变的电化学阻抗谱 （EIS） 以及用于探测密封封装故障的通道间电阻测量。最后，我们开发了一种组织提取管道，用于在安乐死后灌注大脑，在电极就位的情况下将其取出，对其进行切片，并使用不同的炎症标志物进行组织学分析。总体而言，这种方法将允许临床前研究通过强大的多模态数据收集，用于未来在大脑上对新技术和疗法的临床转化。

方案

外科和行为程序由当地伦理委员会根据《实验动物护理和使用指南》批准，并由当地（日内瓦州）和联邦（瑞士）兽医当局批准，授权号为 GE11120A。本研究使用2-6个月大（5-8公斤）的雌性哥廷根小型猪（n = 7）。

1. 术前规划

1. 软植入物系统的体外表征
   1. 计时电流法:使用并联到脉冲发生器的示波器记录注入双相电流脉冲演化（即电压瞬变 [VT]）时的压降。将脉冲发生器依次连接到每个电极和盐水溶液（磷酸盐缓冲盐水[PBS] 1x）中的铂计数器。有关设置，请参阅步骤 3.1。
   2. 电化学阻抗谱图:使用电位计测量不同频率下的电化学阻抗。使用铂计数器和盐水溶液 （PBS 1x） 中的 Ag/AgCl 参比电极依次连接到每个电极。有关设置，请参阅步骤 3.2。
   3. 通道间电阻:在干态下，使用手持式万用表测量相邻通道之间的直流 （DC） 电阻。
   4. 植入物选择:在上述三次测量后，选择植入物以及以下标准:1 kHz 时的阻抗低于 100 kΩ，并且没有低于 1 MΩ 的通道间电阻。
2. 灭菌
   1. 植入物灭菌:将选定的植入物与灭菌标记一起单独放入灭菌袋中并密封。采用双层包装，确保手术过程中的无菌性。
      注:在这种情况下，由于时间周期短，温度低（55°C），使用过氧化氢（H 2 O₂）气体灭菌。替代方案是环氧乙烷 （ETO） 气体或高压灭菌器灭菌，但应确保与植入系统的兼容性。
   2. 器械灭菌:将清洗后的器械连同灭菌标记一起放入双层灭菌袋或无菌器械盒中。高压灭菌最常见于器械，但 H 2 O₂或 ETO 是可能的替代方案。

2. 软ECoG阵列的手术植入

1. 麻醉
   1. 术前用药:隔离动物并禁食过夜。皮内注射0.75mg / kg的咪达唑仑，0.25μg/ kg的阿托品和0.1mg / kg的haldol的混合物，并等待动物镇静。在继续之前称量动物的重量。
   2. 静脉注射 （IV） 导线的安装:
      1. 将动物放在手术台上的加热垫上。通过在动物身上放置面罩来诱导麻醉，使用3%-3.5%的七氟醚。
      2. 将心电图导线放在腹部，将血液饱和度传感器放在尾巴上，将温度传感器放在鼻孔中。
      3. 将静脉导线放在耳静脉上，并使用装满生理盐水的注射器确认血液通路。使用软膏确保眼睛保持水分。
   3. 插管:推注 0.5 mg/kg 的阿曲库铵、1 mg/kg 的氯胺酮和 1-2 μg/kg 的芬太尼。将动物仰卧插管。插入 4.5 毫米管。
   4. 药物:插管后，停止七氟醚麻醉，以 10 mg/kg/h 的速度输注丙泊酚，以 2 μg/kg/h 的速度输注芬太尼，以 0.2-0.5 mg/kg/h 的速度滴注阿曲库铵，以 4-7 mg/kg/h 的速度输注生理盐水。开始以 1 g/kg/h 的速度输注甘露醇，以减少手术期间的脑肿胀。
      注意:如果当地动物伦理委员会推荐，可以使用多模式镇痛方案。
2. 术前X光检查
   1. 将动物放在腹部，呈狮身人面像位置。暂时清除动物大脑和头骨附近的任何金属物体（例如，鼻孔中的温度铅）。
   2. 获取具有骨对比的轴向和矢状面 X 线检查。将已知尺寸的金属物体放在矢状面采集场中，作为测量大脑前后颅骨厚度的刻度。
   3. 确定额窦的位置（通过颅骨下方的空隙可见），并使用永久性标记标记动物头部的最后部位置。这将指示在下面描述的手术方法中可以进行任何开颅手术或螺钉放置的最远点。
3. 无菌野和皮肤准备:剃除手术野以外的整个头部表面。使用无菌垫，用betadine彻底擦洗头部。接下来，将无菌窗帘放在器械台和动物身上，仅露出手术窗口。最后，使用betadine用无菌垫再次擦洗头部。
4. 开颅手术和硬脑膜切开术
   1. 皮肤切口:用手术刀沿中线切开皮肤。使用镰刀将肌肉和骨膜（两侧前囟外侧 25 毫米，前后前后 40 毫米）与骨骼分开，并放置扩张器以获得最佳通道，以便以后钻孔。
   2. 测量和标记:识别囟和λ，并用无菌手术笔标记它们（图2A，B）。使用无菌尺子，在两个半球上以植入目标为中心，定义骨瓣轮廓。在这种特定情况下，选择了听觉皮层，从前囟到-5 mm至-15 mm，横向坐标为-4 mm至-20 mm。然后，根据植入物和解剖标志的大小调整开颅手术，限制开口尺寸。
   3. 颅骨切开术:
      1. 使用带有圆形切割钻头的骨钻，钻开颅手术的轮廓，同时考虑到步骤2.2中测量的颅骨厚度。用生理盐水冲洗钻孔位置，以避免骨头过热。
      2. 小心地均匀地钻出轮廓，直到到达硬脑膜。在第一次突破时，完成轮廓的钻孔，直到它变薄到几乎可以突破为止。然后，使用扁平刮刀（在中线侧或外侧）将骨瓣一块掰开，使用开颅边缘作为杠杆。如果遇到太大的阻力，请继续使骨头变薄。
      3. 将骨片放入无菌生理盐水中。
      4. 切除骨瓣后，小心地切开开颅手术的边缘，使用Kerison避免锋利的骨边缘切入硬脑膜。
      5. 如果硬脑膜或骨骼出血过多，请分别使用 Gelfoam 或骨蜡。在开颅手术中放置湿敷（无菌盐水溶液中的标准垫），并在另一个半球重复此步骤（图2B）。
   4. 硬切开术:
      1. 使用 6-0 缝合套件中的针头，小心地刺穿并提起开颅手术前端或后端的硬脑膜，位于内侧和外侧之间，并用刺刀切开切口。
      2. 然后，使用插入硬膜下腔的小扁平刮刀作为切割基座来保护皮质，通过同时推进两个工具在硬脑膜中形成前后狭缝。确保狭缝略大于植入物的宽度（图2C）。如果在此步骤中发生任何出血或损坏，请用凝胶泡沫覆盖并等待它停止。
         注意:如果硬脑膜中存在大血管，则应调整狭缝轨迹以避免出血。
5. 着床
   1. 设备插入:
      1. 在两侧用生理盐水冲洗植入物（补充图1A），使其更容易滑入硬膜下腔。将植入物放在硬脑膜狭缝上方，并用小镊子在每个边缘上依次滑动装置，硬膜下插入装置。
      2. 小心地握住设备的基座端并随着植入物前进，以免产生阻碍插入的张力。当连接器边缘位于狭缝顶部时，停止插入。
   2. 固定植入物:要将植入物固定到位，请在开颅手术边缘后或锚固翼中的电缆上放置一个钛桥，并使用适当的螺丝刀用一个或两个钛螺钉固定（图 2D）。
   3. 接地放置:小心地去除接地线的 1 厘米绝缘层，并将其硬膜外插入开颅手术的后端（或远离感兴趣皮质或大血管的任何硬膜外位置）（ 图 2E 中的电线）
   4. 重复步骤 2.4.4。2.5.1.-2.5.3在对侧半球。
   5. 术中 X 线检查以确认放置位置:
      1. 在手术部位放置湿垫（无菌盐水溶液中的标准垫）以保持组织水分。接下来，放置无菌手术布以覆盖动物的头部。
      2. 使用 X 射线标记作为指示剂，拍摄平面 X 射线图像（轴向和矢状面），以确保植入物位置正确且未折叠。如果没有，请取下窗帘并取出设备以再次插入（再次按照步骤 2.4.4 和 2.5.1.-2.5.3 操作）。
   6. 硬脑膜闭合:使用 3-0 可吸收缝合线和小针架小心地将硬脑膜缝合在植入物电缆周围。尽可能将两个硬脑膜边缘放在一起，不要用缝合线撕裂薄膜（图2D，E）。
   7. 骨瓣放置:使用钛螺钉在每个骨瓣的前部和后部固定一个钛桥。在接下来的步骤中，要小心地根据脚踏板腿的位置来规划 Ti 桥的位置。将钛桥的末端拧到头骨上（图2F，G）。
6. 底座和踏板放置
   1. 定位:在这种配置中，踏板有六个支腿，每个支腿有两个螺丝孔（补充图 1B）。计划脚踏板在颅骨上的位置，以优化螺钉的位置（避免将它们放置在开颅手术的边缘或颞肌中）。如果无法拧入腿上的孔，请跳过它们。
   2. 脚踏板固定:拧入脚踏板的钛螺钉，直至其牢固就位（见 图 2H）。
   3. 底座放置:拆下连接电缆上方的钛桥，然后翻转底座以落在踏板上。将底座拧到脚踏板上。检查底座是否牢固就位（图 2I）。
7. 缝合和闭合
   1. 清洁伤口:用生理盐水冲洗皮下空间的任何骨头或其他碎屑。切掉基座边缘周围的一些皮肤，在圆柱体后面形成一个圆形边缘。
   2. 皮下缝合:取下扩张器并将皮瓣折叠在一起。使用简单的间断缝合线或简单的连续缝合线，用 4-0 不可吸收缝合线创建皮下缝合线，相距 3 毫米。从基座开始，在切口的两侧向基座移动。
   3. 真皮缝合线:使用 6-0 不可吸收缝合线缝合皮肤，缝合线相距 5 毫米。从基座开始，在切口的两侧向基座移动。注意在两个皮瓣之间和基座边缘附近实现良好的组织附着，以避免空隙（图2J）。
   4. 伤口敷料:用无菌垫和甜菜碱再次清洁伤口区域。在伤口上贴上自粘性无菌绷带。
8. 体内 测量:对于 体内 测量，请遵循第 3、4 和 5 节。
9. 觉醒:完成所有测量后，将动物从所有麻醉剂中取出，但保持通风。对于镇痛，应用丁丙诺啡贴剂（25mg / h）24小时。将动物放在覆盖有窗帘的加热垫上，以加快唤醒时间。当自主呼吸恢复时，拔管动物并戴上氧气面罩，直到意识恢复（可能需要1至4小时）。
10. 术后动物护理:5 天，密切监视动物。给予75mg的头孢氨苄剂量，每日两次，与其他动物分开，与其他动物分开。每天用浸泡过的无菌垫涂抹大量倍他汀对伤口进行消毒（最好在喂食期间进行）。
    注意:长期护理和住房:手术动物隔离 24 小时。如果动物足够健康，可以与同龄人进行社交互动，它就会被放回原来的社会群体中。需要对基座和皮肤开口进行日常观察，以跟踪设备在头部的集成。在适当的时候，用大量的甜菜碱清洁基座周围的位置。

3. 软植入物的 体内 表征

1. 计时电流法:使用并联到脉冲发生器的示波器记录注入双相电流脉冲演化（即 VT）时的压降。将脉冲发生器依次连接到每个电极和地线。在100 Hz下以100 μA的脉冲宽度进行300 μs的刺激脉冲。
2. 电化学阻抗谱:使用电位计测量不同频率下的电化学阻抗。将脉冲发生器依次连接到每个电极，使用地线作为对电极和接地。将激励电压设置为 200 mV，频率范围为 1 Hz 至 1 MHz，每十倍频程 3 个点。
3. 通道间短路测量:使用手持式万用表测量相邻通道之间的直流电阻。 在体内，仅测量沟道间直流电阻以验证没有出现低于 1 kΩ 的短路，表明完全封装失败。

4.电生理记录

1. 自发活动:将无线记录系统插入底座，记录基线活动2-3分钟。这些录音将作为分析听觉诱发电位的对照。
2. 听觉诱发电位:除了无线系统外，还将扬声器插入动物耳朵的封闭区域中。在120次重复中，以约70 dB的声压级（SPL）在不同频率（200-20,000 Hz）下播放音色爆发声刺激。然后，对记录进行平均，并在刺激期间对齐它们以进行分析。
3. 感觉诱发电位:将针头放在鼻子的三个不同位置。通过用不同振幅的脉冲发生器刺激鼻子 ~30 秒来唤起感觉电位，以获得募集曲线。

5. 活体 成像

1. 动物运输:如步骤2.1所述，将动物置于丙泊酚麻醉下。使用装有呼吸机、注射泵和生命体征监护仪的运输车将动物从手术室运送到成像设施并返回。
2. 计算机断层扫描 X 射线扫描:将动物放在扫描仪台上，并移除头部周围的任何金属物体（例如温度传感器）。使用等距采集以最小分辨率（0.4 毫米切片厚度）采集 CT 扫描，并自动选择电流和电压以进行骨对比。
3. 磁共振成像:从动物身上取出所有含有金属的设备（使用兼容 MRI 的静脉导线和插管）。使用位于MRI室外并通过长管连接到动物的呼吸机，在3%-3.5%的七氟醚下保持动物通风和麻醉。在第一个序列之前，以 1-2 μg/kg 的剂量注射芬太尼推注。以最小分辨率使用三个等轴测序列:T1、T2 和涡轮自旋回波 （TSE） 加权序列（参数显示在 补充文件 1 中）。

6.自由移动录音

1. 按照第 4 节中描述的相同程序记录来自大脑的清醒信号。通过将动物抱在实验者的怀里或用零食喂动物以分散其注意力来插入无线头台。使用靠近动物的外部扬声器提供声学刺激。

7. 灌注和组织制备

1. 可选:如果动物尚未处于麻醉状态，请按照步骤 2.1 进行麻醉方案。
2. 在颈动脉中插入导管进行灌注（补充图2）
   1. 颈动脉和颈静脉清扫术:使用烧灼器/切割器切开中线处的喉咙。首先切开皮肤，然后沿着中间白线（下面没有血管）切开肌肉（补充图2A）。
   2. 进一步张开，用手指在气管周围和肌肉下方留出空间。寻找颈动脉（跳动和粉红色）;迷走神经有时也在周围（白色），颈静脉可以在下方或侧面（红色）。放置吊具（参见 补充图 2B）。
   3. 使用细镊子和圆剪刀开始颈动脉的夹层。用剪刀打开结膜组织。如果没有血管，就切开;如果有血管，烧灼并向前移动（补充图2C，D）。当解剖足够时，使用夹子进入颈动脉下方，使其完全隔离（补充图2E）。
   4. 对颈静脉重复相同的操作（补充图2F）。
   5. 当两根血管完全解剖和隔离后，在它们周围放置缝合线。暂时不要关闭它们。颈动脉周围的两条缝合线，一条在最底部（缝合线 1 心脏侧用于脑灌注），另一条在另一侧（缝合线 2），显示在 补充图 2G 中。
   6. 在颈静脉周围放置一根缝合线（缝合线 3），不要闭合;用胶带标记电线，以便稍后切开静脉。
   7. 非常牢固地缝合1，否则会流血（补充图2H）。打三个结。将夹子放在电线上以施加重量并在颈动脉中产生张力。
   8. 使用颈动脉夹层另一侧的血管钳夹钳颈动脉（脑侧用于脑灌注; 补充图2I）。缝合线 2 在中间，尚未闭合。
   9. 使用黑色镊子夹住并拉动颈动脉。使用细剪刀，切开靠近夹层底部的颈动脉的一半（靠近缝合线 1，心脏侧;见 补充图 2J）。确保截面尽可能整洁并到达容器本身，而不仅仅是"护套";否则，导管将无法通过。插入导管，如 补充图2K所示。
   10. 冲洗并填充导管，首先用PBS，这样导管中就不会留下空气（补充图2K 插图）。
   11. 将缝合线 2 足够牢固，使其不会消失，但不要过多，以便导管仍然可以移动一点（补充图 2L）。然后，取下血管夹，尽可能完成导管的插入，并完成缝合线 2 的闭合（牢固关闭）。
   12. 如果需要，在缝合线 1 处使用缝合线将导管底部连接到伤口出口处的皮肤上，作为额外的安全步骤。然后，将动物转移到灌注区并将其插入PBS /肝素。灌注开始时，拉动缝合线 3 并切断颈静脉
3. 安乐死:静脉注射戊巴比妥（90 mg/kg），并用生理盐水冲洗管路，以确保成功给予全剂量。
4. 灌注:使用灌注泵（200 mL / min）将颈动脉导管插入PBS /肝素（15 kg 猪为 1 L），然后插入含有 4% 多聚甲醛 （PFA） 的 PBS（15 kg 猪为 5 L）。灌注开始时，拉动缝合线 3 并切断颈静脉。
5. 组织采集
   1. 斩首:灌注结束后，用手术刀切开皮肤和肌肉，将刀片插入第一和第二椎骨之间，将动物的头部从身体上分离出来。
   2. 固定后:在4°C下将头部浸入PBS中的4%PFA中再浸泡48小时，然后在脑提取前转移到PBS中。
   3. 脑和植入物提取:
      1. 使用手术刀去除皮肤，然后从第一椎骨开始，沿着脊髓到小脑，使用rongeur小心地切割骨头。一旦小脑暴露，小心地去除颞骨，露出顶叶和额叶。
      2. 此时，将底座从脚踏板上拧下来，并用钳子剪断脚踏板的脚。移除进入颅骨的电缆入口附近的骨头，将植入物系统从骨骼中释放出来，而无需将植入物从硬脑膜出口中拉出。
      3. 如果植入物电缆嵌入骨骼中，请尽可能靠近出口剪断电缆。一旦暴露了足够的脑表面，用小剪刀小心地沿着中线剪断硬脑膜。
      4. 从硬脑膜出口处释放植入物电缆。从植入大脑的植入物位置拍摄照片。然后，用小勺子将大脑从下面的颅神经中分离出来。小心地提取大脑。从大脑中取出植入物。
   4. 脑后固定:根据灌注质量，在4°C的PBS中，在4%PFA中再次将提取的脑后固定24小时。 在4°C下保持在0.1M PBS中，直到大脑被切断。
   5. 脑切:用剃须刀片将两个半球分开。然后，将大脑正交切成四个不同的部分。将植入区切成两半，以获得包含植入区和控制区的两个块。如果需要更多控制载玻片，请存储其他两个块。
   6. 脑冷冻保护和冷冻:先将脑块转移到15%蔗糖的溶液中，然后在4°C下转移到30%的蔗糖溶液中，直到大脑下降并达到平衡。然后，在组织冷冻系统中将组织冷冻在-55°C的异戊烷中。

8. 组织学

1. 组织切片
   1. 低温恒温器:将冷冻的大脑放入低温恒温器中并修剪直至达到完整的切片。然后，将大脑切成40μm切片，并在孔板中的0.1M PBS中以三组浸入其中。仔细注意盘子的顺序。
   2. 截面选择:根据要分析的区域（植入区域或控制区域）选择截面。依次从孔板中取出切片，用细刷检查它们是否损坏。将它们放入装有0.1M PBS的新孔板中进行进一步染色。
2. 免疫组化
   1. 制备:将切片在0.3%Triton X / PBS中孵育15分钟，然后在室温（RT）下用3%牛血清白蛋白（BSA）/ PBS孵育1小时。
   2. 一抗:在室温下用一抗孵育组织48小时（抗GFAP，大鼠，以1/300稀释;抗Iba1，兔，以1/400稀释;抗NeuN，豚鼠，以1/1,000稀释;全部以1%BSA / PBS稀释）。用铝箔盖住孔板。
   3. 洗涤:用0.1M PBS洗涤孔3次，每次5分钟。
   4. 二抗:在室温下用二抗孵育组织2小时（Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 647，Alexa Fluor 555;均在1%BSA / PBS中以1/400稀释）。
   5. DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）:将组织与DAPI孵育15分钟（1%BSA / PBS中的1/1,000）。
   6. 洗涤:用0.1M PBS洗涤孔5次，每次15分钟。
   7. 安装:使用安装介质和盖玻片安装载玻片。将载玻片放在4°C的冰箱中避光。
3. 成像
   1. 全玻片成像:使用玻片扫描仪显微镜在三种不同波长（640 nm、560 nm、485 nm）下以 10 倍放大倍率（物镜工作距离值 = 3,100 μm）对载玻片进行成像。所有功率和增益信息都可以在 补充文件2中找到。
   2. 显微成像:使用共聚焦显微镜在四种波长（Alexa Fluor 647、DAPI、Cy3、EGFP）下以 20 倍放大倍率（复消色差 20x/0.8 M27）对感兴趣区域进行成像。所有功率和增益信息均可在 补充文件 3 中找到。

结果

为了确认设备的位置（图3A）和功能，在基座放置后在术中进行电生理记录。基线信号首先在2分钟内获得，没有刺激作为基础活动的控制。其次，用不同频率（500-20,000 Hz）的音调对动物进行声学刺激，并在刺激期间对原始数据进行平均，以映射整个阵列的听觉诱发电位（例如，与基线相比，在800 Hz; 图3B）。此处显示的数据未经处理，但如果存在过多的噪声，则可以应用陷波滤波器和带通滤波器。手术室中的典型噪声源包括加热垫、堵塞的钻头以及抽吸或烧灼器（等），这些应在采集前移除。在清醒记录中，应避免头部周围的大肌肉运动，例如咀嚼，以获得更清晰的数据集。

该协议应用于每个记录时间点，并且可以随时间比较单个通道的信号。 图3C中显示了一个示例，显示了响应的鲁棒性和演变。通过计算每个时间点基线信号的标准偏差，可以评估实验过程中每个触点的记录能力（图3D）。在这项研究中，信噪比在第 0 天和第 6 个月之间下降并稳定下来，尽管由于记录周期的持续时间有限（即 2 分钟）存在一些变化。这可以进一步与电极阻抗相关。

术后进行体内成像以评估大脑状态和植入物定位。在协议的第一次迭代中，没有进行术中 X 射线检查，导致设备折叠，如图 4A 中 T1 加权 MRI 序列所示（另见图 4B）。在动物中没有观察到行为变化，但随着时间的推移，由于植入物位置周围的大脑受到宏观压缩，这导致设备周围的纤维化封装（图4C）。在这次经历之后，引入了术中 X 射线，如图 4D 所示，其中不透射线的标记（插图 4D 中植入物上可见的黑条）显示位置良好。然后大脑表面完好无损，如图 4E 中的术后 MRI 所示。总的来说，有了这种植入物和基座系统，全脑成像是可能的。冠状面中的不同序列能够看到解剖结构（图4F，G;T1 和 T2 MRI 序列）或植入物周围存在液体和血液（图 4H;TSE 加权 MRI 序列）。基座系统几乎没有任何伪影，除了钛螺钉周围的一些黑色对比小的空隙（见图4G）。此外，本研究中使用临床电极作为比较器，但由于加热和安全问题，无法在 MRI 中成像。因此，对这些动物进行CT扫描，如图4I所示。电极清晰可见，基座系统不会影响图像质量。

植入期结束后，对动物进行灌注，并提取大脑。在这项研究中，炎症反应的分析在每个半球独立进行。在切片前将大脑切成两半更容易进行组织准备，并且其优点是切片可以安装在标准显微镜载玻片上。大脑样本的一个例子显示在（图5A）和之后（图5B）切成块。植入物的轮廓清晰可见，并在大脑中形成了一个小凹痕。通过平行切割，组织已经与低温恒温器对齐，并且可以很容易地切割切片，而不会损失组织进行修剪（图5C）。染色后，对整个组织切片进行成像（图5D），例如，神经元层的细节清晰可见（参见NeuN标记物）。整个切片都很脆弱，有时会导致一些组织损失（见 图5D的底部），但感兴趣的区域是完整的。在近距离观察下，通过40倍的共聚焦显微镜成像，细胞被清晰地定义，并且可以对炎症标志物进行精细研究（图5E）。可以进行进一步的量化分析，以比较对照半球和植入半球之间的炎症。 图6 显示了植入电极的电化学特性。具有阻抗模量和相位的软电极阵列的 体外 电化学阻抗谱如图 6A 所示，植入6个月后1 kHz处的阻抗模量 如图6B所示。

图1:实验示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 2:将软 ECoG 微创植入大脑 。 （A） 手术进入颅骨，并伴有前囟的迹象。（B） 双侧开颅手术，硬脑膜可见。（C） 第一半球的狭缝硬脑膜切开术。（D） 软 ECoG 硬膜下植入和硬脑膜闭合。（E） 第二半球的硬脑膜切开术。使用钛桥将骨瓣固定在第一半球。（F） 在第二半球和硬脑膜闭合处植入软 ECoG。（G） 骨瓣固定在第二半球。（H） 脚踏板定位在颅骨上。（I） 将基座固定在脚踏板上。（J） 基座基部周围的皮肤闭合。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:听觉诱发电位的记录 。 （A） 电极在颞叶表面的放置示意图。（B） 响应 800 Hz 音调爆发刺激（紫色迹线）的基线活动（灰色迹线）和听觉诱发电位的代表性映射。每个平均值对应于软 ECoG 阵列上的一个通道。平均是在声音刺激的模拟输入信号上触发的。"ON"和"OFF"声刺激周期记录在左下角的一个通道上。（C） 声刺激后单通道响应随时间（第 0 天、第 2 个月和第 5 个月）的演变，与未出现刺激时的基线信号相比（灰色）。平均是在声音刺激的模拟输入信号上触发的。底部标有"ON"和"OFF"刺激期。"ON"刺激的诱发电位用箭头标记。（D） 基线记录每个时间点的每个通道（彩色点）的标准偏差。中值以粗体蓝色表示。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:大脑和植入电极的 活体 成像 。 （A） 冠状面术后 T1 加权 MRI。箭头表示折叠的植入物。（B） A 的放大部分，植入物的折叠在大脑中产生凹痕。（C） 植入 1 个月时的 T1 加权 MRI，显示由于大脑纤维化封装在与 C 相同的位置而导致大脑受压。（D） 术中平面 X 射线验证植入物放置和无折叠，如不透射线标记放置所观察到的那样。插图:植入物的照片，可见不透射线的标记。（E） 冠状面术后 T1 加权 MRI，具有最佳植入物放置。（F） 植入 1 个月时的 T1 加权 MRI。（G） 植入 1 个月时的 T2 加权 MRI。箭头显示了将脚踏板固定在头骨上的钛螺钉的成像伪影。（H） 植入 1 个月时的 TSE 加权 MRI。（I）植入临床电极的动物的CT扫描。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:长期植入后大脑的组织学分析。 （A） 外植和灌注的脑左半球的照片。（B） 灌注脑在冷冻步骤之前切成块。（C） 低温恒温器上整块切片设置的图片;整个"预切块"可以被切片。（D） 整个半球的免疫染色成像（玻片扫描仪，20 倍物镜）和 （E） 皮层第一层的放大（共聚焦成像，40 倍物镜），显示神经胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。请点击这里查看此图的较大版本.

图 6:植入电极的电化学表征 。 （A）具有阻抗模量（顶部）和相位（底部）的软电极阵列（每个通道的小灰线，红色平均值）的 体外 电化学阻抗谱。（B） 植入 6 个月内 1 kHz 阻抗模量的演变（蓝色平均值;灰线是各个通道; 体外 测量值为红色参考）。 请点击这里查看此图的较大版本.

补充图 1:兼容 MRI 的基座。 （A） 慢性 MRI 兼容透皮连接系统（基座）以访问软电极阵列。（B） 脚踏板上安装有电极的基座，用于颅骨固定。插图:踏板的细节。 请点击这里下载此文件。

补充图 2:手术通路以实现最佳脑灌注。（A） 皮肤切开并进入颈动脉和颈静脉的位置。（B） 解剖血管周围的组织。（C，D）颈动脉和颈静脉周围组织的识别和解剖。（E） 颈动脉与下面的组织隔离。（F） 颈静脉与下面的组织隔离。（G） 在颈动脉（缝合线 1 和缝合线 2）和颈静脉（缝合线 3）周围放置缝合线。（H） 闭合颈动脉底部（心脏侧）的缝合线 3，以避免在血管打开时出血。（I） 钳夹 H 对面的颈动脉。（J） 颈动脉切片。（K） 将导管插入 J 的开口中。插图:用生理盐水从注射器冲洗到导管尖端的灌注导管。（L） 缝合线 2 的闭合以将导管保持在适当的位置并沿动脉。请点击这里下载此文件。

补充文件 1:分别为 T1-（第 1-2 页）、T2-（第 3-4 页）和 TSE 加权（第 5-6 页）MRI 序列的参数。 请点击这里下载此文件。

补充文件 2:用于染色脑切片全玻片成像的玻片扫描仪的元数据。请点击这里下载此文件。

补充文件3:染色脑切片放大切片共聚焦成像的元数据。请点击这里下载此文件。

讨论

我们在这里报告了一种软ECoG阵列的长期植入和评估方法。在这项研究中，我们设计了一种一致的微创手术方法，用于在颞叶（此处针对听觉皮层）上双侧植入功能性电极网格。我们首先通过在研究过程中（6个月）成功记录诱发电位并跟踪电极的电化学特性来评估栅极的功能（见 图6）。其次，我们通过使用 MRI 和建立完全兼容 MRI 的系统来评估网格的生物 安全性，并通过 设计组织收集和免疫染色方案来评估死后。

为了尽量减少侵入性，我们优化了开颅手术窗口的大小。为了到达位于颞叶上的听觉皮层并避免切除颞肌，我们开发了一种将植入物滑到硬脑膜下的技术。这种技术可以大大减少暴露的大脑表面，并且仍然可以到达远处的目标。虽然这种类型的植入可能看起来是盲目的，但在术中平面 X 射线中可见的设备上实施不透射线的标记可以验证定位，并确保阵列不会折叠在硬脑膜下。硬膜下滑动已被证明在我们进行的大多数重复中是安全的。此外，狭缝方法中的硬脑膜切开术可最大限度地减少开颅手术期间的脑膨出，并促进植入物周围的闭合，而无需额外的材料，例如人造硬脑膜，这可能会偏向炎症反应。最后，这种手术方法的优势在于它能够转移到不同的皮质区域。使用坐标、开颅手术位置和设备尺寸（都可以调整）使这种方法能够针对大部分皮层区域。

这里介绍的手术方法，以及功能评估和随时间推移的生物整合研究，不限于本报告中使用的软电极技术。其他正在开发的用于人类翻译的硬膜下电极可以使用相同的协议进行评估。这种方法的优势在于，大多数部件（例如电缆和底座）都是模块化的、可个性化的，并且可以适应被测的特定设备。此外，皮质内或深穿透探针也可以代替硬膜下电极或与硬膜下电极结合使用，因为这只需要调整开颅手术和硬脑膜切开术的几何形状。然后可以将长期结果与临床结果进行比较，就像我们在这里所做的那样。

所提出的方法的主要局限性之一是迷你猪中存在颅骨窦，这些颅窦在第一年的过程中发育¹².在这方面，需要考虑的重要方面包括植入年龄和动物的大小。在成人颅骨中进行开颅手术会破坏鼻窦的完整性，并导致慢性环境中发生严重感染的高风险。这种鼻窦在术前的平面 X 线和 CT 扫描中可见。另一方面，在太小的动物中过早进行慢性植入，在颅骨经历大规模生长和重塑时也不是最佳选择。我们假设手术后的这些"颅骨运动"可能会导致植入物移动和折叠，这最终对实验不利。我们在这里发现，哥廷根迷你猪，在植入时大约 5-6 个月大（和 8 公斤），应该给出最好的结果。

为了评估植入的 ECoG 在电生理记录中的性能，我们建立了一个用于听觉诱发电位 （AEP） 记录的快速方案，可用于自由移动的动物和镇静状态。它包括在几分钟内呈现特定频率的一系列声学音爆。这种协议的优点是，它可以通过减少探测的频率数量来调整到可用的记录长度。在麻醉下记录皮质信号时的一个挑战是，在分析和比较数据时，应考虑动物的意识水平。

灌注方案通过观察提取的大脑的质量随着时间的推移进行调整。事实上，我们发现只对颈动脉进行导管插入术更容易，而不是对颈静脉进行导管插入术。最初，文献提出了将颈静脉导管引流以排出废物的方法²⁰。实际上，这限制了大脑的流动，并导致血液提取和灌注的整体质量较差。通过切割颈静脉并将液体留在动物所在的大容器中逸出，灌注效率提高。

我们开发了一种强大的组织制备方法，可与常规用于炎症追踪的抗体配合使用。出于实际原因，我们将两个半球分开，因为猪的大脑有一半适合标准显微镜载玻片，因此与组织学实验室中的大多数成像设备兼容。通过将大脑切成块，可以直接进入感兴趣的区域，而无需进一步切割整个大脑或修剪组织的广泛部分。40 μm 的脑切片可以汇集在标准孔板中并以自由浮动的方式染色，而不会因其他物种的免疫染色而发生重大方案变化。也可以通过使用例如CLARITY方法²¹来设想全脑免疫染色。

总体而言，该协议涵盖个性化植入物设计到植入、功能随访和生物安全评估，是稳健且一致的。我们在这里证明了它研究听觉系统的可行性，但它可以转位来测试其他生理功能。此外，我们方法的优势在于它不仅限于迷你猪，而是可以完全转座到其他物种，如绵羊、山羊或非人类灵长类动物。在一定程度上，它也可以很容易地适应老鼠。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
骨钻	BBraun	Elan 4 带 GA861 手机
骨钻头	BBraun	神经切割机 GP204R
Bonewax	Ethicon	W31G
导管	Venisystems	Abbocath 14G
共聚焦显微镜	蔡司	LSM 880
低温恒温器	徕卡	CM1950
Gelfoam	辉瑞	Gelfoam
插入式扬声器	词源	ER2 插入式
万用表	Fluke	Fluke 1700
示波器	Tektronix	MDO3014 Mixed Domain Oscilloscope
Perfusion Pump	Shenzen	LabS3/UD15
恒电位仪	Gamry Instruments	Reference 600
Primary Antibody抗 GFAP	Thermofischer	抗 GFAP，大鼠，# 13-0300
一抗 IBA1	富士胶片	抗 IBA1，兔子，019-19741
一抗 抗 NeuN	SigmaAldrich	抗 NeuN，豚鼠，ABN90
脉冲发生器	AM 系统	2100 型孤立脉冲刺激器
记录头台	多通道系统	W2100-HS32
记录系统	多通道系统	W2100
螺丝刀	美敦力	手柄： 001201， 轴： 8001205
二抗 488	Thermofischer	山羊抗大鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗， Alexa Fluor 488， # A-11006
二抗 555	Thermofischer	山羊抗豚鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555，# A-21435
二抗 647	Thermofischer	山羊抗兔 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647，# A-21245
玻片扫描仪	Olympus	VS120
Snapfrost	Excilone	Excilone Snapfrost
Stab knife	Fine科学工具	10316-14
缝合线真皮	Ethicon	Vicryl 2-0
缝合线硬脑膜	Ethicon	Mersilk 5-0
导管缝合线	Ethicon	Vycril 3-0 无针
用于提升硬脑膜的缝合线	Ethicon	Prolene 6-0 带 BV-1 针
缝合线皮下	Ethicon	Vicryl 4-0
钛桥	美敦力	TiMesh 015-2001-4	切出所需尺寸
钛螺钉	美敦力	9001635、9001640
X 射线系统	GE	GE OEC 9800 Plus C 型臂