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皮层下柔性脑皮层电图（ECoG）阵列植入及小型猪长期皮层记录

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DOI：

10.3791/64997

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2023年3月31日

 ,  , 
1Laboratory for Soft Bioelectronic Interfaces, Neuro-X Institute, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种在小型猪模型中对柔性硬膜下电极阵列进行长期性能与安全性评估的方法，详细描述了手术方法与工具、术后磁共振成像、听觉皮层的电生理学特性、植入物的电化学特性以及死后免疫组织化学分析。

摘要

神经功能障碍和神经系统疾病的诊断与治疗可采用皮层脑电图（ECoG）阵列。在耐药性癫痫中，这些阵列有助于明确需切除的致痫区域。在脑机接口等长期应用中，这些皮层电极用于记录大脑的运动意图，以控制瘫痪患者的机械肢体。然而，目前刚性电极网格尚无法满足高分辨率脑信号记录和长期生物整合的需求。近年来，可延展电极阵列被提出，旨在实现长期植入稳定性与高性能记录。然而，这些新型植入技术仍需开展临床前研究，以验证其长期功能性和安全性，从而推动其向临床患者的转化应用。在此背景下，由于猪模型器官尺寸较大且动物操作方便，常被用于医疗器械的开发。然而，文献中报道的猪脑相关应用仍较少，主要原因在于手术操作的限制以及植入系统在活体动物上的整合困难。

本文报道了在小型猪模型中对柔性ECoG阵列进行长期植入（6个月）及评估的方法。研究首先介绍了植入系统，该系统由一种柔软的微加工电极阵列组成，该阵列与一个磁共振成像（MRI）兼容的聚合物经皮端口集成，该端口内含用于电生理记录的仪器连接器。随后，研究描述了从硬膜下植入到动物术后恢复的完整手术流程。我们以听觉皮层为例，展示通过声学刺激诱发脑电位的靶向区域。最后，我们描述了一套数据采集流程，包括全脑MRI成像、植入电极的电化学表征、术中及自由活动状态下的电生理记录，以及取出脑组织后的免疫组织化学染色分析。

该模型可用于研究新型皮层假体设计的安全性和功能，是设想将其转化为人类患者应用所必需的临床前研究。

引言

神经系统损伤和疾病可通过皮层脑电图（ECoG）阵列进行诊断或治疗。这些电极网格被植入大脑表面，可用于记录或刺激人类大脑皮层1。例如，在药物难治性癫痫的情况下，它们有助于界定需要切除的致痫区域2。在脑机接口等长期应用中，这些皮层电极可用于记录大脑的运动意图，以控制瘫痪患者的机械肢体3。然而，目前的电极网格由嵌入刚性聚合物基底中的坚硬金属块制成，无法满足高分辨率脑电记录和长期硬膜下生物整合（>30 天）的需求。相反，它们会引发局部组织反应，导致植入设备被纤维化包裹，从而随时间推移性能下降。近年来，已提出采用微加工技术制造的薄型聚合物基底的柔性或可拉伸电极阵列，以通过减少组织反应实现长期植入的高性能表现4,5。然而，这些新型植入技术仍需开展临床前研究，以验证其长期功能性和安全性，从而推动其向临床患者的转化应用。在此背景下，由于小型猪和猪模型器官尺寸较大且易于动物操作，已在其他医学领域（如心血管、骨骼或胃系统）的器械开发中被常规使用6,7,8。然而，针对神经生理学脑部应用的研究在文献中报道较少，主要受限于手术入路以及在活体动物上整合植入系统的技术难题9,10,11,12。这些方法通常难以适用于活体动物的慢性植入，因为可能需要开发复杂的硬件，例如可植入的嵌入式电子设备。此外，这些研究往往未考察植入系统对靶组织的影响，而这一点在转化研究的生物安全性评估中至关重要。猪模型在皮层结构、颅骨以及皮肤厚度方面与人类解剖结构相近13。此外，其具备学习行为任务的能力，使其成为研究功能康复策略或感觉感知的有力模型14。

将新技术和疗法转化至人体应用，必须按照相关医疗监管机构的要求，对其安全性和有效性进行评估。这些要求通常在技术文件和规范中有详细说明15，但这些规范仅要求通过基本测试，通常并不涉及对植入装置实际效应的深入研究，或在安全性研究的同时收集其他有用数据。为了全面评估脑部植入物的生物安全性和性能，本文在猪模型中开展了一项纵向、系统性的研究，内容包括脑部影像数据的采集、电生理测量、对植入电极电化学特性的评估，以及动物死亡后的组织病理学分析。为实现这一目标，需综合考虑多个关键方面，以建立一个完整的实验模型：（i）采用微创手术方式植入装置，并配备机械稳定的经皮接口以连接电极；（ii）建立可靠的电生理记录方案，能够在麻醉状态和自由活动状态下，均有效评估植入电极的性能输出；（iii）在多个时间点进行in vivo成像（计算机断层扫描 [CT] 和/或磁共振成像 [MRI]），以追踪脑组织和植入物的演变过程，并评估植入系统与成像设备之间的兼容性；（iv）建立标准化的组织处理流程，用于取出脑组织并进行组织学分析。

本文报道了在小型猪模型中进行软性ECoG阵列长期植入（6个月）及评估的方法（示意图见图1）。此类软性电极阵列已在我们先前的研究中报道，由嵌入弹性金薄膜作为导电通路的薄硅胶膜制成16,17。电极与组织的接触通过在硅胶基质中嵌入铂纳米颗粒实现，从而形成柔软且高效的脑组织电化学界面18。植入物通过一根柔性的电缆连接，该电缆经皮下和颅骨下隧道通向一个经皮端口，该端口固定于动物头部并容纳连接器。植入物的尺寸和形状可根据研究目标和需求进行定制。本研究中使用的电极条带与临床实际使用的条带尺寸一致。临床可用的硬质皮下条带和网格电极作为对照，采用相同方法植入。聚合物材质的磁共振兼容经皮端口通过底板系统固定于颅骨上，确保其牢固锚定。本文详细描述了从双侧大脑半球皮下植入到动物术后恢复的完整手术流程。我们以听觉皮层为例，作为目标脑区，在麻醉状态和自由活动状态下均通过声学刺激诱发脑电位。在不同时间点，动物在麻醉状态下接受脑部MRI扫描（对于临床电极则使用CT扫描），同时测量电极的电化学特性。采用电极表征方法监测植入物及其与组织界面的演变情况（详见Schiavone等人的研究19）。这些方法包括：利用计时安培法评估电极接触点的刺激能力；通过电化学阻抗谱（EIS）分析电极电阻性和电容性组分的变化；以及进行通道间电阻测量，以检测是否存在密封封装失效。最后，我们建立了一套组织提取流程，在动物安乐死后对其进行脑组织灌注，连同电极一并取出脑组织，进行切片，并使用多种炎症标志物开展组织学分析。总体而言，该方法可为未来脑部新技术和疗法的临床转化提供具有稳健多模态数据支持的临床前研究基础。

方案

外科手术和行为学操作均经当地伦理委员会批准，符合《实验动物护理与使用指南》的要求，并获得地方（日内瓦州）和联邦（瑞士）兽医主管部门的批准，授权编号为 GE11120A。本研究使用了 7 只 2 至 6 月龄（5-8 kg）的雌性哥廷根小型猪。

1. 术前规划

  1. 体外软性植入系统的表征
    1. 计时安培法：将示波器并联连接至脉冲发生器，记录注入双相电流脉冲时的电压降（即电压瞬变 [VT]）。依次将脉冲发生器连接至每个电极和盐溶液（1×磷酸盐缓冲液 [PBS]）中的铂对电极。有关设置，请参见步骤 3.1。
    2. 电化学阻抗谱：使用电位计在不同频率下测量电化学阻抗。在盐溶液（1× PBS）中，依次通过铂对电极和 Ag/AgCl 参比电极将电位计连接至每个电极。有关设置，请参见步骤 3.2。
    3. 通道间电阻：在干燥状态下，使用手持式万用表测量相邻通道之间的直流（DC）电阻。
    4. 植入物筛选：完成上述三项测量后，根据以下标准选择植入物：1 kHz 时阻抗低于 100 kΩ，且无任何通道间电阻低于 1 MΩ。
  2. 灭菌
    1. 植入物灭菌：将选定的植入物单独放入灭菌袋中，并放入灭菌指示剂后密封。采用双层包装以确保手术期间的无菌状态。
      注意：本实验采用过氧化氢（H2O2）气体灭菌，因其灭菌周期短且温度低（55 °C）。替代方法包括环氧乙烷（ETO）气体或高压蒸汽灭菌，但需确保与植入系统兼容。
    2. 器械灭菌：将清洁后的器械放入双层灭菌袋或无菌器械盒中，并加入灭菌指示剂。器械最常用的灭菌方式为高压蒸汽灭菌，但也可使用 H2O2 或 ETO 作为替代方案。

2. 柔性ECoG阵列的外科植入

  1. 麻醉
    1. 术前用药：将动物隔离并禁食过夜。皮下注射咪达唑仑（0.75 mg/kg）、阿托品（0.25 µg/kg）和氟哌啶醇（0.1 mg/kg）的混合液，等待动物进入镇静状态。在继续操作前称量动物体重。
    2. 静脉通路建立：
      1. 将动物置于手术台上，垫上加热垫。通过面罩给予3%-3.5%的七氟烷以诱导麻醉。
      2. 将心电图导联置于腹部，血氧饱和度传感器置于尾部，温度传感器插入鼻腔。
      3. 在耳缘静脉建立静脉通路，并用充满生理盐水的注射器确认回血通畅。使用眼膏保持眼球湿润。
    3. 气管插管：静脉推注阿曲库铵（0.5 mg/kg）、氯胺酮（1 mg/kg）和芬太尼（1–2 µg/kg）。将动物仰卧位放置以进行气管插管，插入一根4.5 mm的气管导管。
    4. 术中用药：插管后停止七氟烷麻醉，开始输注丙泊酚（10 mg/kg/h）、芬太尼（2 µg/kg/h）、阿曲库铵（0.2–0.5 mg/kg/h）和生理盐水（4–7 mg/kg/h）。开始输注甘露醇（1 g/kg/h），以减少术中脑组织肿胀。
      注意：若当地动物伦理委员会建议，可采用多模式镇痛方案。
  2. 术前X光检查
    1. 将动物俯卧于手术台上，呈狮身人面像姿势。暂时移除动物头颅及颅骨附近的所有金属物品（例如鼻腔内的温度探头）。
    2. 获取骨组织对比清晰的轴向和矢状面X光片。在矢状面成像视野中放置一个已知尺寸的金属标记物，作为测量大脑前后部位颅骨厚度的标尺。
    3. 识别额窦位置（表现为颅骨下方的空腔区域），并用永久性记号笔在动物头部标记其最靠后的边界点。该点将指示在下述手术入路中可进行开颅或螺钉固定的最远位置。
  3. 无菌区域建立与皮肤准备：剃除手术区域以外整个头部的毛发。使用无菌纱布彻底以聚维酮碘溶液擦洗头部。随后，在器械台和动物体表铺设无菌巾，仅暴露手术窗口。最后，再次使用无菌纱布蘸取聚维酮碘溶液对头部进行擦洗。
  4. 开颅与硬脑膜切开
    1. 皮肤切口：沿中线使用手术刀切开皮肤。使用骨膜剥离器将肌肉和骨膜从颅骨上分离（两侧距前囟25 mm，前后方向距前囟40 mm），并放置牵开器以获得最佳钻孔视野。
    2. 测量与标记：确定前囟（bregma）和后囟（lambda）位置，并使用无菌手术笔进行标记（图2A，B）。使用无菌直尺在双侧半球围绕植入目标点划定骨瓣轮廓。在本例中选择听觉皮层作为目标区域，其坐标为从前囟向后-5 mm至-15 mm，外侧-4 mm至-20 mm。随后根据植入物大小及解剖标志调整开颅范围，尽量缩小骨窗尺寸。
    3. 开颅：
      1. 使用配备圆形切割钻头的骨钻，依据步骤2.2中测得的颅骨厚度钻出开颅轮廓。钻孔过程中持续用生理盐水冲洗，防止骨组织过热。
      2. 均匀地小心钻削轮廓，直至接近硬脑膜。首次穿透时，继续钻削使骨壁变薄至几乎可破裂的程度。然后使用平头刮匙（从中线侧或外侧）作为杠杆，将骨瓣完整撬下。若阻力过大，则继续磨薄骨壁。
      3. 将取下的骨片置于无菌生理盐水中保存。
      4. 骨瓣移除后，使用Kerison咬骨钳小心修整开颅边缘，避免锐利骨缘损伤硬脑膜。
      5. 若硬脑膜或骨面出现明显出血，分别使用明胶海绵（Gelfoam）或骨蜡止血。在开颅窗内放置湿纱布（浸有无菌生理盐水的标准纱布），然后在对侧半球重复此步骤（图2B）。
    4. 硬脑膜切开：
      1. 使用6-0缝线包中的针头，在开颅窗的前部或后部、距中线与外侧中间位置小心刺破并提起硬脑膜，再用尖刀形成切口起始点。
      2. 随后，将一小块平头刮匙插入硬膜下腔作为切割基底以保护皮层，同时推进两件工具，沿前后方向在硬脑膜上做一纵行切口。确保切口略宽于植入物宽度（图2C）。若此过程中发生出血或损伤，用明胶海绵覆盖并等待止血。
        注意：若硬脑膜存在较大血管，应调整切口路径以避免出血。
  5. 植入
    1. 装置置入：
      1. 用生理盐水冲洗植入物（补充图1A）两面，以便更顺利地滑入硬膜下腔。将植入物置于硬脑膜切口上方，使用小型镊子沿切口边缘逐步将其置入硬膜下腔。
      2. 小心握住装置的基座端，推进植入物时避免产生张力阻碍插入。当连接器端到达切口上方时，停止推进。
    2. 固定植入物：为固定植入物，在电缆穿过开颅边缘或锚定翼后，放置钛桥，并使用合适的螺丝刀拧入一至两枚钛螺钉进行固定（图2D）。
    3. 接地线放置：小心剥除接地导线绝缘层约1 cm，将其置于开颅窗后端的硬膜外腔（或选择远离目标皮层或大血管的其他硬膜外位置）（见 图2E 中导线）。
    4. 在对侧半球重复步骤2.4.4及2.5.1–2.5.3。
    5. 术中X光检查以确认位置：
      1. 在手术区域覆盖湿纱布（浸有无菌生理盐水的标准纱布），以保持组织湿润。随后覆盖无菌手术巾以遮盖动物头部。
      2. 拍摄轴向和矢状面X光片，利用X光标记物确认植入物位置是否正确且无折叠。如位置不当，需移除手术巾并取出装置重新植入（重复步骤2.4.4及2.5.1–2.5.3）。
    6. 硬脑膜闭合：使用3-0可吸收缝线和小型持针器，小心地在植入物电缆周围缝合硬脑膜。尽可能将两侧硬脑膜边缘对合，避免缝线撕裂脆弱的膜结构（图2D，E）。
    7. 骨瓣复位：使用钛螺钉在每个骨瓣的前部和后部固定钛桥。注意规划钛桥的位置，以便后续步骤中足板支腿的安装。将钛桥末端拧入颅骨（图2F，G）。
  6. 基座与足板安装
    1. 定位：在此配置中，足板具有六个支腿，每个支腿上有两个螺钉孔（补充图1B）。规划足板在颅骨上的位置，以优化螺钉定位（避免将螺钉置于开颅边缘或颞肌内）。若某些孔位无法拧入螺钉，可跳过。
    2. 足板固定：拧入足板上的钛螺钉，直至其牢固固定（见 图2H）。
    3. 基座安装：移除连接电缆上的钛桥，翻转基座使其落于足板之上。将基座拧紧至足板，并检查其是否稳固（图2I）。
  7. 缝合与关闭
    1. 伤口清洁：用生理盐水冲洗皮下间隙，清除任何骨屑或其他异物。修剪基座边缘周围的皮肤，形成与圆柱形状匹配的圆形边缘。
    2. 皮下缝合：移除牵开器，将皮瓣对合。使用4-0不可吸收缝线，以间断或连续缝合法进行皮下缝合，针距3 mm。从远离基座处开始，向基座方向在切口两侧分别缝合。
    3. 真皮缝合：使用6-0不可吸收缝线进行皮肤缝合，针距5 mm。同样从远离基座处开始，向基座方向缝合。注意确保两皮瓣之间以及基座边缘附近组织良好对合，避免形成空腔（图2J）。
    4. 伤口包扎：再次使用无菌纱布和聚维酮碘溶液清洁伤口区域，然后在伤口上覆盖自粘式无菌敷料。
  8. 体内测量：进行体内测量时，请参照第3、4、5节操作。
  9. 苏醒：完成所有测量后，停止所有麻醉药物，但仍维持通气支持。为镇痛，贴敷丁丙诺啡透皮贴剂（25 mg/h）持续24小时。将动物置于覆盖有手术巾的加热垫上以加快苏醒。当自主呼吸恢复后，拔除气管导管，并给予面罩吸氧直至意识完全恢复（通常需1至4小时）。
  10. 术后动物护理：术后5天内密切观察动物状态。 给予头孢氨苄75 mg，每日两次，随食物服用，并将动物单独饲养。每日使用大量浸透聚维酮碘的无菌纱布对伤口进行消毒处理（建议在喂食期间进行）。
    注意：长期护理与饲养：手术后动物单独隔离24小时。若动物状态良好，能够与同伴正常社交，则可放回原群体。 需每日观察基座及皮肤开口情况，以监测装置在头部的整合进展。必要时，使用大量聚维酮碘清洁基座周围区域。

3. 在体 软性植入物的表征

  1. 计时电流法：使用示波器并联连接脉冲发生器，记录注入双相电流脉冲序列（即 VT）时的电压降。将脉冲发生器依次连接至每个电极和接地线。以 100 µA 的电流、300 µs 的脉宽和 100 Hz 的频率执行刺激脉冲。
  2. 电化学阻抗谱：使用电位计在不同频率下测量电化学阻抗。将脉冲发生器依次连接至每个电极，并以接地线同时作为对电极和接地。设置激励电压为 200 mV，频率范围为 1 Hz 至 1 MHz，每十倍频程采集三个数据点。
  3. 通道间短路测量：使用手持式万用表测量相邻通道之间的直流电阻。In vivo 情况下，仅测量通道间的直流电阻以确认是否出现低于 1 kΩ 的短路，从而判断是否存在完全封装失效。

4. 电生理记录

  1. 自发活动：通过基座连接无线记录系统，记录 2-3 分钟的基础活动。这些记录将作为对照，用于分析听觉诱发电位。
  2. 听觉诱发电位：除无线系统外，将扬声器插入动物耳道内的闭合声场中。以约 70 dB 声压级（SPL）播放不同频率（范围为 200-20,000 Hz）的短音脉冲声学刺激，重复 120 次。然后对记录信号进行平均，并在刺激时间段内对齐，以供分析。
  3. 感觉诱发电位：在吻部三个不同位置插入针电极。使用脉冲发生器以不同强度刺激吻部约 30 秒，诱发感觉电位，从而获得募集曲线。

5. 在体内的 成像

  1. 动物转运：按照步骤 2.1 所述，保持动物处于丙泊酚麻醉状态。使用配备有呼吸机、注射泵和生命体征监护仪的转运车，将动物从手术室转运至影像学检查设施并返回。
  2. 计算机断层扫描（CT）：将动物放置于扫描仪载物台上，并移除头部周围的任何金属物体（例如温度传感器）。采用各向同性采集模式，使用自动电流和电压选择以获得骨组织对比度，在最小分辨率下（0.4 mm 层厚）进行 CT 扫描。
  3. 磁共振成像（MRI）：移除动物身上所有含金属的设备（使用与 MRI 兼容的静脉导线和气管插管）。将动物保持通气状态，并通过位于 MRI 扫描室外部、经由长管连接至动物的呼吸机，以 3%–3.5% 七氟烷维持麻醉。在首次序列扫描前，静脉推注芬太尼 1–2 µg/kg。采用三种各向同性序列，在最小分辨率下进行扫描：T1 加权、T2 加权和快速自旋回波（TSE）加权序列（参数见补充文件 1）。

6. 自由活动记录

  1. 按照第4节中所述的相同步骤记录大脑的清醒信号。通过将动物抱在实验者臂中或用零食分散其注意力的方式，连接无线前置放大器。使用放置在动物附近的外部扬声器提供声学刺激。

7. 灌注与组织制备

  1. 可选：如果动物尚未麻醉，请按照步骤 2.1 执行麻醉方案。
  2. 颈动脉插管以进行灌注（补充图 2）
    1. 颈动脉和颈静脉解剖：使用电灼器/剪刀沿颈部正中线切开。先切开皮肤，然后沿中间白色中线（下方无血管）剪开肌肉（补充图 2A）。
    2. 进一步用手分开组织，在气管周围及肌肉下方留出空间。寻找颈动脉（呈搏动性、粉红色）；迷走神经有时也位于附近（白色），颈静脉可能位于下方或侧面（红色）。放置牵开器（见补充图 2B）。
    3. 使用精细镊子和圆头剪刀开始解剖颈动脉。用剪刀剪开结缔组织。若无血管，直接剪开；若有血管，先电灼后再继续向前分离（补充图 2C, D）。当解剖足够长度后，使用夹子从颈动脉下方穿过，使其完全游离（补充图 2E）。
    4. 对颈静脉重复相同操作（补充图 2F）。
    5. 当两条血管均完全解剖并游离后，在其周围放置缝合线。暂不结扎。在颈动脉周围放置两根缝合线，一根位于最基部（缝线 1—心脏侧，用于脑灌注），另一根位于对侧（缝线 2），如补充图 2G所示。
    6. 在颈静脉周围放置一根缝合线（缝线 3），暂不结扎；用胶带标记 缝合线以便后续切开静脉时识别。
    7. 将缝线 1 牢固结扎，否则会出血（补充图 2H）。打三个结。在缝线上夹一个夹子以增加重量，使颈动脉保持张力。
    8. 在颈动脉解剖对侧使用血管夹夹闭颈动脉（脑侧用于脑灌注；补充图 2I）。缝线 2 位于中间，暂未结扎。
    9. 使用黑色镊子夹住并轻拉颈动脉。用精细剪刀在解剖起始端附近（靠近缝线 1，心脏侧）剪开约一半的颈动脉（见补充图 2J）。确保切口尽可能整齐，并深入至血管壁本身，而不仅仅是"鞘膜"；否则导管无法插入。按补充图 2K所示插入导管。
    10. 先用 PBS 冲洗并充满导管，确保导管内无残留空气（补充图 2K插图）。
    11. 将缝线 2 结扎至足够紧固以防滑脱，但不要过紧，以便导管仍可轻微移动（补充图 2L）。随后移除血管夹，尽可能将导管完全插入，并最终牢固结扎缝线 2。
    12. 如有需要，可利用缝线 1 处的缝合线将导管基部固定于伤口出口处的皮肤上，作为额外安全措施。然后将动物转移至灌注区域，并连接 PBS/肝素。灌注开始后，拉紧缝线 3 并剪断颈静脉。
  3. 安乐死：静脉注射戊巴比妥（90 mg/kg），并用生理盐水冲洗管路，确保完全给药。
  4. 灌注：使用灌注泵（200 mL/min），将颈动脉导管依次连接至 PBS/肝素（15 kg 猪使用 1 L）和含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS（15 kg 猪使用 5 L）。灌注开始后，拉紧缝线 3 并剪断颈静脉。
  5. 组织采集
    1. 断头：灌注结束后，使用手术刀切断皮肤和肌肉，并将刀片插入第一与第二椎骨之间，将动物头部与身体分离。
    2. 后固定：将头部浸入含 4% PFA 的 PBS 中，在 4 °C 下继续固定 48 小时，随后转移至 PBS 中，待脑组织取出。
    3. 脑组织与植入物取出：
      1. 使用手术刀去除皮肤，然后使用咬骨钳从第一椎骨开始小心地切割颅骨，沿脊髓方向至小脑。暴露小脑后，小心去除颞骨，暴露顶叶和额叶。
      2. 此时，将基座从底板上旋下，并用钳子剪断底板的脚部。去除颅骨上电缆进入部位周围的骨质，使植入系统从骨组织中松脱，但不要将植入物从硬脑膜出口处拉出。
      3. 若植入电缆嵌入骨内，则尽可能靠近出口处剪断电缆。当暴露足够脑表面后，使用小剪刀沿中线小心剪开硬脑膜。
      4. 将植入电缆从硬脑膜出口处松脱。拍摄植入物在脑表面位置的照片。然后使用小勺将脑组织从下方的颅神经上分离。小心取出脑组织。将植入物从脑组织中移除。
    4. 脑组织后固定：根据灌注质量，将取出的脑组织在含 4% PFA 的 PBS 中于 4 °C 下再次后固定 24 小时。之后保存于 0.1 M PBS 中，4 °C 保存直至切片。
    5. 脑组织切片：使用剃刀刀片将两个半球分离。然后将脑组织垂直切成四个部分。将植入区域切成两半，获得两个分别包含植入区域和对照区域的组织块。若需要更多对照切片，可保存其余两个组织块。
    6. 脑组织冷冻保护与冷冻：先将脑组织块转移至 15% 蔗糖溶液，再转移至 30% 蔗糖溶液，4 °C 下孵育直至组织沉底并达到平衡。随后，在组织冷冻系统中将组织置于 -55 °C 的异戊烷中冷冻。

8. 组织学

  1. 组织切片
    1. 冷冻切片机：将冷冻脑组织置于冷冻切片机中，修片至获得完整切面后，将脑组织切成40 µm厚的切片，并以每组三片的形式浸入盛有0.1 M PBS的多孔板中。仔细记录各孔板的顺序。
    2. 切片选择：根据待分析区域（植入区域或对照区域）选择切片。依次从多孔板中取出切片，使用细毛刷检查是否有损伤，并将其转移至装有0.1 M PBS的新多孔板中，用于后续染色。
  2. 免疫组织化学
    1. 预处理：将切片在0.3% Triton X/PBS中孵育15分钟，随后在3%牛血清白蛋白（BSA）/PBS中室温（RT）孵育1小时。
    2. 一抗孵育：在1% BSA/PBS中加入一抗，室温孵育48小时（抗GFAP抗体，大鼠来源，1/300稀释；抗Iba1抗体，兔来源，1/400稀释；抗NeuN抗体，豚鼠来源，1/1,000稀释）。用铝箔包裹多孔板以避光。
    3. 洗涤：用0.1 M PBS洗涤三次，每次5分钟。
    4. 二抗孵育：在1% BSA/PBS中加入二抗，室温孵育2小时（Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 555，均按1/400稀释）。
    5. DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）染色：将切片与DAPI在1% BSA/PBS中孵育15分钟（1/1,000稀释）。
    6. 洗涤：用0.1 M PBS洗涤五次，每次15分钟。
    7. 封片：使用封片剂和盖玻片进行封片。将载玻片置于4 °C冰箱中避光保存。
  3. 成像
    1. 全片成像：使用载玻片扫描显微镜在三个不同波长（640 nm、560 nm、485 nm）下以10倍放大倍数（物镜工作距离值 = 3,100 µm）对载玻片进行成像。所有激光功率和增益参数信息详见补充文件2。
    2. 显微成像：使用共聚焦显微镜在四个波长（Alexa Fluor 647、DAPI、Cy3、EGFP）下以20倍放大倍数（复消色差物镜20x/0.8 M27）对感兴趣区域进行成像。所有激光功率和增益参数信息详见补充文件3。

结果

为了确认装置的位置（图3A）和功能，在基台放置后术中进行电生理记录。首先，在无刺激条件下记录2分钟的基础信号，作为基础活动的对照。其次，使用不同频率（500-20,000 Hz）的声调脉冲对动物进行声学刺激，并对刺激期间的原始数据进行平均，以绘制阵列上的听觉诱发电位（例如，800 Hz时与基础状态的比较；图3B）。此处显示的数据未经处理，但如果噪声过大，可应用陷波滤波器和带通滤波器。手术室中常见的噪声来源包括加热垫、已插入电源的钻头、吸引器或电凝器（以及其他设备），应在数据采集前移除。在清醒状态下的记录中，应避免头部周围的大范围肌肉运动（如咀嚼），以获得更清晰的数据集。

该方案应用于每次记录的时间点，可对单个通道的信号进行时间上的比较。一个示例如图3C所示，展示了反应的稳健性及其演变过程。通过计算每个时间点基线信号的标准差，可评估各电极触点在整个实验过程中的记录能力（图3D）。在本研究中，信噪比在第0天至第6个月期间逐渐下降并趋于稳定，尽管由于记录时间较短（即2分钟）而存在一定的波动性。这一变化可进一步与电极阻抗相关联。

术后进行体内成像以评估脑部状态和植入物的位置。在本方案的首次实施中，未进行术中X射线检查，导致植入设备发生折叠，这一点在图4A的T1加权MRI序列中可见（另见图4B）。动物未表现出行为改变，但随着时间推移，由于植入部位周围脑组织受到宏观压迫，导致设备周围出现纤维化包裹（图4C）。基于此次经验，后续引入了术中X射线检查，如图4D所示，其中放射显影标记物（见插图图4D中植入物上的黑色条带）位置良好。此后，脑表面保持完整，可在术后MRI图像中观察到（图4E）。总体而言，采用该植入物与基座系统可实现全脑成像。冠状面的不同成像序列可显示解剖结构（图4F、G；T1和T2 MRI序列）或植入物周围液体及血液的存在情况（图4H；TSE加权MRI序列）。基座系统几乎不产生伪影，仅在钛螺钉周围出现少量低信号暗区（见图4G）。此外，本研究中使用临床电极作为对照，但由于发热和安全性问题，这些电极无法进行MRI成像。因此，对这些动物进行了CT扫描，结果如图4I所示。电极清晰可见，且基座系统未影响图像质量。

植入期结束后，对动物进行灌注并取出脑组织。本研究中，炎症反应的分析分别在每个半脑独立进行。将脑组织一分为二有利于切片前的组织处理，并且其优势在于切片可直接贴附于标准显微载玻片上。下图显示了一个脑组织样本在（图 5A）以及之后（图5B）切成块状。植入物的轮廓清晰可见，并在脑组织上形成了一个小凹陷。通过平行切面进行切割，组织已与冷冻切片机对齐，可直接切片，无需修片即可避免组织损失。图5C）。染色完成后，对整个组织切片进行成像（图5D），例如，神经元层的细节清晰可见（参见NeuN标记）。整个切片较为脆弱，有时可能导致部分组织丢失（参见底部 图 5D），但感兴趣区域保持完整。通过40倍共聚焦显微镜成像的近距离观察，细胞轮廓清晰，可对炎症标志物等进行精细研究（图5E可进一步进行定量分析，以比较对照组与植入侧半脑之间的炎症反应。 图6 显示植入电极的电化学表征。 体外 柔性电极阵列的电化学阻抗谱，显示了阻抗模量和相位 图6A 以及植入后6个月内1 kHz时的阻抗模量如图所示 图6B.

硬膜下ECoG阵列植入示意图，磁共振兼容，长期皮层记录，小型猪。
图1：实验示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

手术操作流程：开颅、切口置入、足板设置及用于研究的基座。
图 2：软质 ECoG 在脑部的微创植入。（A）颅骨手术入路，标示出前囟位置。（B）双侧开颅，硬脑膜清晰可见。（C）第一侧半球的硬脑膜切开。（D）软质 ECoG 的硬膜下植入及硬脑膜闭合。（E）第二侧半球的硬脑膜切开；使用钛桥固定第一侧半球骨瓣。（F）第二侧半球软质 ECoG 的植入及硬脑膜闭合。（G）第二侧半球骨瓣的固定。（H）足板在颅骨上的定位。（I）将基座固定至足板上。（J）围绕基座底部的皮肤缝合。请点击此处查看该图的放大版本。

脑刺激示意图；听觉诱发电位幅度图和反应分析图表；神经科学研究。
图3：听觉诱发电位的记录。（A）颞叶表面电极放置的示意图。（B）基线活动（灰色轨迹）和对800 Hz声调脉冲刺激的听觉诱发电位（紫色轨迹）的代表性图谱。每条平均轨迹对应柔性ECoG阵列上的一个通道。平均过程由声音刺激的模拟输入信号触发。左下角的一个通道中标注了“开启”（ON）和“关闭”（OFF）声学刺激时段。（C）单个通道在声学刺激后的反应随时间的变化（第0天、第2个月和第5个月），与无刺激时的基线信号（灰色）进行比较。平均过程由声音刺激的模拟输入信号触发。“开启”和“关闭”刺激时段在底部标出。“开启”刺激的诱发电位用箭头标示。（D）基线记录中每个时间点各通道的标准差（彩色圆点）。中位数值以粗体蓝色表示。请点击此处查看该图的放大版本。

脑部 MRI 与 CT 序列；T1、T2 加权、灰度扫描及用于诊断的植入方法
图 4: 体内 脑部成像与植入电极的影像。 (A) 术后冠状位 T1 加权 MRI。箭头指示折叠的植入物。B) 放大部分的 A，其中植入物的折叠在脑组织上形成一个凹痕。 (C植入1个月后的T1加权MRI，显示由于脑部在相同位置发生纤维化包裹，导致脑组织受压 C. (D术中X光平片验证植入物位置及无折叠，通过显影标记物位置观察确认。插图：可见显影标记物的植入物照片。E术后冠状面T1加权MRI，显示植入物位置理想。F) 植入后1个月的T1加权MRI。G) 植入后1个月的T2加权MRI。箭头指示固定颅骨足板的钛钉所产生的成像伪影。H) 植入后1个月的TSE加权MRI。I) 植入临床电极的动物的CT扫描图像。 请点击此处以查看此图的放大版本。

小鼠脑切片、包埋、免疫染色；荧光显微镜；GFAP、NeuN、Iba1 标记物。
图 5：长期植入后脑组织的组织学分析。 （A）取出并灌注后的脑组织——左半球照片。（B）灌注后的脑组织在冷冻前被切割成组织块。（C）冷冻切片机上完整组织块切片装置的照片；可对整个“预切组织块”进行切片。（D）整个半脑的免疫染色成像（切片扫描仪，20倍物镜），以及（E）皮层最表层的局部放大图像（共聚焦成像，40倍物镜），显示胶质细胞、星形胶质细胞和神经元。 请点击此处查看该图的高清版本。

电化学阻抗谱结果；频率与模量、相位及体内阻抗的关系。
图6植入电极的电化学表征。 (A) 体外 柔性电极阵列的电化学阻抗谱（每通道以灰色细线表示，红色为平均值），包括阻抗模量（上图）和相位（下图）。B) 植入后6个月内1 kHz阻抗模量的变化（蓝色为平均值；灰色线为各个通道） 体外 测量值以红色标示作为参考。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：与MRI兼容的基座。（A）用于连接柔性电极阵列的慢性植入式、与MRI兼容的经皮连接系统（基座）。（B）带有电极的基座，其电极已安装在用于颅骨固定的底板上。插图：底板的细节。请点击此处下载该文件。

补充图 2：优化脑灌注的手术通路。 （A）切开皮肤，暴露颈动脉和颈外静脉的位置。（B）解剖血管周围的组织。（C、D）识别并解剖颈动脉和颈外静脉周围的组织。（E）将颈动脉从其下方组织中分离出来。（F）将颈外静脉从其下方组织中分离出来。（G）在颈动脉周围放置缝合线（缝合线 1 和缝合线 2）以及在颈外静脉周围放置缝合线（缝合线 3）。（H）在颈动脉根部（靠近心脏一侧）结扎缝合线 3，以防止血管切开时出血。（I）在与 H 相对的一侧夹闭颈动脉。（J）切断颈动脉。（K）将导管插入 J 所示切口处。插图：用注射器将生理盐水从导管末端冲洗导管，使其预充填。（L）结扎缝合线 2，以固定导管位置并使其贴合动脉走向。请点击此处下载该文件。

补充文件1：T1加权（第1-2页）、T2加权（第3-4页）和TSE加权（第5-6页）MRI序列的参数。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：用于染色脑切片全片成像的切片扫描仪元数据。 请点击此处下载该文件。

补充文件3：染色脑切片放大区域共聚焦成像的元数据。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文报道了一种用于长期植入和评估柔性ECoG阵列的方法。在本研究中，我们设计了一种稳定且微创的手术方案，用于在双侧颞叶（此处靶向听觉皮层）表面植入功能性电极网格。首先，我们通过在整个研究期间（6个月）成功记录诱发电位，并追踪电极的电化学特性（见图6），评估了电极网格的功能性。其次，我们通过使用磁共振成像（MRI）并建立完全兼容MRI的系统，在活体（in vivo）条件下评估了网格的生物安全性；同时，通过设计组织取材和免疫染色的实验流程，在死后进行了组织学评估。

为了尽量减少侵入性，我们优化了开颅窗的尺寸。为了到达位于颞叶的听觉皮层并避免切除颞肌，我们开发了一种将植入物在硬脑膜下进行滑入的技术。该技术可显著减少脑组织暴露的表面积，同时仍能到达较远的目标区域。尽管此类植入看似缺乏直视引导，但在设备上设置可在术中X光平片中显影的放射显影标记物，能够验证植入位置，并确保电极阵列在硬脑膜下未发生折叠。在我们进行的多次实验中，硬脑膜下滑入技术已被证实是安全的。此外，采用狭缝状切开硬脑膜的方式可最大程度减少开颅期间脑组织的膨出，并便于在植入物周围直接闭合硬脑膜，无需使用人工硬脑膜等可能影响炎症反应的附加材料。最后，该手术方法的优势在于其可推广性，通过调整立体定位坐标、开颅位置以及可定制的设备尺寸，该技术能够覆盖大脑皮层的大部分区域。

本文所介绍的手术方法，以及功能评估和随时间推移对生物整合性的研究，并不仅限于本报告中使用的柔性电极技术。其他正在开发用于临床转化的硬膜下电极也可采用相同的方案进行评估。该方法的优势在于，大多数组件（如电缆和基座）均为模块化、可个性化设计，并可根据被测设备的具体需求进行调整。此外，也可使用皮层内或深部穿透探针，单独使用或与硬膜下电极联合使用，仅需相应调整开颅和硬脑膜切开的几何形状即可。随后可将这些长期结果与其临床对应物进行比较，正如我们在本研究中所做的那样。

本方法的一个主要局限在于小型猪颅骨中存在鼻窦，这些鼻窦在出生后第一年内逐渐发育12。因此，需要考虑的重要因素包括植入时动物的年龄及其体型大小。在成年颅骨上实施开颅手术会破坏鼻窦的完整性，从而在慢性实验条件下导致严重感染的高风险。这些鼻窦在术前的X光平片和CT扫描中可见。另一方面，若在动物过小、颅骨仍处于快速生长和重塑阶段时过早进行慢性植入，也并非理想选择。我们推测，术后颅骨的"移动"可能导致植入物移位或折叠，最终对实验造成不利影响。本研究发现，植入时年龄约为5至6个月、体重约8 kg的哥廷根小型猪可获得最佳实验结果。

为了评估植入式硬膜外皮层脑电图（ECoG）在电生理记录中的性能，我们建立了一种快速的听觉诱发电位（AEP）记录方案，该方案可用于自由活动的动物以及在镇静状态下进行记录。该方案包括在几分钟内呈现一系列特定频率的声学纯音短声刺激。此类方案的优势在于，可通过减少探测频率的数量，根据可用的记录时长灵活调整实验参数。在麻醉状态下记录皮层信号时，一个挑战是在分析和比较数据时必须考虑动物的意识水平。

通过观察提取脑组织的质量，我们逐步优化了灌注方案。实际上，我们发现仅插管颈动脉而不插管颈外静脉更为简便。最初，文献中描述的方法包括插管颈外静脉以排出废液20。但在实际操作中，这种方法限制了液体从脑组织中的流出，导致血液清除不充分，整体灌注质量下降。通过切断颈外静脉，并让液体直接流入动物所处的大容量容器中，可显著提高灌注效率。

我们开发了一种可靠的组织制备方法，可与常规用于炎症示踪的抗体兼容。出于操作便利性考虑，我们将大脑分为两个半球，因为猪脑的一半可适配标准显微镜载玻片，从而兼容组织学实验室中大多数现有的成像设备。通过将脑组织切割成若干组织块，可直接接触目标区域，而无需对整个脑组织进行进一步切片或大量修剪。40 µm 的脑切片可收集于标准多孔板中，并采用游离漂浮法进行染色，其操作流程与其它物种的免疫染色相比无需重大调整。此外，也可通过例如 CLARITY 方法实现全脑免疫染色21。

总体而言，本方案涵盖了个性化植入体设计、植入手术、功能随访及生物安全性评估，具有良好的稳健性和可重复性。我们在此证明了其用于研究听觉系统的可行性，但该方案也可推广应用于其他生理功能的测试。此外，本方法的优势在于不仅限于小型猪，还可完全适用于绵羊、山羊或非人灵长类等其他物种。在一定程度上，该方法也可便捷地 adapted 用于大鼠。

披露

F.F. 和 S.P.L. 是 Neurosoft Bioelectronics SA 的联合创始人及股东，该公司致力于开发柔性电极阵列。

致谢

作者感谢Bertarelli基金会以及瑞士国家科学基金会（SNSF）Sinergia项目（CRSII5_183519）提供的资金支持。作者还感谢洛桑联邦理工学院（EPFL）的Katia Galan在组织学染色方案开发方面的帮助，感谢日内瓦Wyss生物与神经工程中心神经微系统平台工作人员在器件制备过程中的协助，感谢日内瓦大学（UNIGE）日内瓦大学医学中心（CMU）动物实验平台工作人员在小型猪的动物护理、手术协助及术后管理方面的支持（John Diaper、Xavier Belin、Fabienne Fontao和Walid Habre），感谢日内瓦大学生物医学成像中心（CIBM）团队成员（Julien Songeon、François Lazeyras和Rares Salomir）的帮助，感谢日内瓦大学医院（HUG）病理科工作人员（Sami Schranz、Francesca Versili、Ruben Soto和Coraline Egger）的协助，以及感谢格勒诺布尔-阿尔卑斯大学（Université Grenobles-Alpes）的Blaise Yvert在慢性小型猪实验方面的建议与交流。作者还感谢Neurosoft Bioelectronics SA公司的员工（Benoit Huguet和Margaux Roulet）在器件制备过程以及小型猪实验中提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
骨钻BBraunElan 4 配 GA861 手柄
骨钻头BBraunNeurocutter GP204R
骨蜡EthiconW31G
导管VenisystemsAbbocath 14G
共聚焦显微镜ZeissLSM 880
冷冻切片机LeicaCM1950
明胶海绵PfizerGelfoam
插入式耳机EtymoticEtymotic ER2 插入式耳机
万用表FlukeFluke 1700
示波器TektronixMDO3014 混合域示波器
灌注泵ShenzenLabS3/UD15
恒电位仪Gamry InstrumentsReference 600
一抗 Anti-GFAPThermofischerAnti-GFAP, 大鼠, # 13-0300
一抗 Anti-Iba1FujifilmAnti Iba1, 兔, 019-19741
一抗 Anti-NeuNSigmaAldrichAnti-NeuN, 豚鼠, ABN90
脉冲发生器AM SystemsModel 2100 隔离式脉冲刺激器
记录头级Multichannel systemsW2100-HS32
记录系统Multichannel systemsW2100
螺丝刀Medtronic手柄: 001201, 杆: 8001205
二抗 488Thermofischer山羊抗大鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗, Alexa Fluor 488, # A-11006
二抗 555Thermofischer山羊抗豚鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗, Alexa Fluor 555, # A-21435
二抗 647Thermofischer山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗, Alexa Fluor 647, # A-21245
切片扫描仪OlympusVS120
速冻装置ExciloneExcilone Snapfrost
stab刀Fine Science Tools10316-14
皮肤缝合线EthiconVicryl 2-0
硬脑膜缝合线EthiconMersilk 5-0 
导管固定缝合线EthiconVycril 3-0 无针
提拉硬脑膜用缝合线EthiconProlene 6-0 配 BV-1 针
皮下缝合线EthiconVicryl 4-0
钛桥MedtronicTiMesh 015-2001-4裁剪至所需尺寸
钛螺钉Medtronic9001635, 9001640
X射线系统GEGE OEC 9800 Plus C型臂

参考文献

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皮层下柔性脑皮层电图（ECoG）阵列植入及小型猪长期皮层记录
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