本实验方案的目的是通过LC3免疫荧光染色及LC3点状结构定量分析，检测胰腺癌细胞和胰腺腺泡细胞中的自噬水平。
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摘要
摘要
自噬是一种特异性的分解代谢过程，可选择性降解细胞质成分，包括蛋白质和受损的细胞器。自噬使细胞能够对各种应激刺激产生生理反应，从而维持细胞内稳态。癌细胞可能通过调节其自噬水平，以适应缺氧、营养缺乏或化疗引起的损伤等不利条件。导管型胰腺腺癌是最致命的癌症类型之一。由于自噬相关蛋白的转录水平上调以及翻译后激活，胰腺癌细胞表现出高水平的自噬活性。
本研究采用 PANC-1 细胞系作为人胰腺癌细胞的模型，AR42J 胰腺腺泡细胞系作为高度分化的哺乳动物细胞的生理模型。研究利用微管相关蛋白轻链 3（LC3）的免疫荧光作为自噬激活状态的指标。LC3 是一种自噬相关蛋白，在基础状态下于细胞质中呈弥散性分布（此状态下的 LC3 称为 LC3-I）。自噬诱导会触发 LC3 与新形成的自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺发生共价结合，形成 LC3-II，这是一种膜结合蛋白，有助于自噬体的形成与扩展。为了定量标记的自噬结构数量，使用了开源软件 FIJI，并借助 "3D Objects Counter" 工具进行分析。
在生理条件和癌细胞中检测自噬水平，可使我们研究在缺氧、化疗处理或某些蛋白质敲低等不同条件下自噬的调控情况。
引言
巨自噬（通常称为自噬）是一种特异性的分解代谢过程，可选择性地降解细胞质成分，包括蛋白质和受损的细胞器1,2。自噬使细胞能够对各种应激刺激产生生理反应，从而维持细胞内的稳态3。在自噬过程中，会形成一个双层膜囊泡：即自噬体。自噬体包裹待降解的货物分子，并将其运送至溶酶体进行降解1,4。
自噬体上装饰有自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3（LC3）5。当自噬未被诱导时，LC3以LC3-I构象弥散分布在细胞质和细胞核中。相反，当自噬被诱导时，LC3会与自噬结构膜上的磷脂酰乙醇胺发生共价结合6。这种新的LC3构象被称为LC3-II1。LC3构象的转变会引起其细胞定位以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）迁移行为的改变，这些变化可通过免疫荧光和蛋白质印迹等技术检测到5,7。因此，LC3的共价修饰是自噬过程中的一个关键事件，可用于评估自噬活....
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方案
1. 细胞准备
- 将直径12 mm的圆形盖玻片浸入无水乙醇中，然后垂直放入24孔板的孔内。
- 打开盖子，将多孔板暴露于紫外线下照射15分钟。
- 将盖玻片水平放置，并用杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）洗涤。
- 接种低代次的胰腺细胞。接种量应根据固定当天达到50%–75%融合度进行调整16。
注意：建议每孔接种2.5 × 104个PANC-1细胞或4 × 104个AR42J细胞，以在接种后第3天进行细胞固定。 - 将细胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5%二氧化碳（CO2）的湿润环境中培养。
注意：对于PANC-1细胞，建议在细胞接种后培养2天再进行后续操作。在此之后，可对细胞进行转染、处理或固定。本方案以未转染的PANC-1细胞经吉西他滨处理，以及未转染的AR42J细胞进行分化和PP242处理为例进行说明。
2. 细胞处理
- 吉西他滨处理 PANC-1 细胞
- 在接种后第 2 天，配制浓度为 1 µg/µL 的吉西他滨 DMEM 溶液。每孔加入 2.6 µL 该....
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结果
本方案通过在不同条件下对胰腺细胞系中的LC3进行免疫荧光染色，以测定自噬水平。该实验的结果获得了来自红色和蓝色通道的细胞图像，分别对应LC3和DAPI。LC3图像显示了该蛋白在细胞内的分布情况，而DAPI则显示细胞核的定位。图2A展示了在基础条件或吉西他滨处理条件下PANC-1细胞中LC3免疫荧光及其与DAPI染色合并的代表性图像。一组LC3染色图像使用FIJI软件中的3D Objects Counter工具进行分析。利用该软件，定量了每个细胞中LC3斑点的数量。图2B中的柱状图显示了PANC-1细胞在基础条件与吉西他滨处理条件下LC3斑点数量的定量结果。该图显示，在吉西他滨处理下LC3斑点数量显著增加，LC3斑点数直接反映了自噬活性。我们此前也已证实，吉西他滨可诱导胰腺癌细胞发生自噬12。总体而言，本文所介绍的方法可用于检测吉西他滨在这些细胞中诱导的自噬活化水平的升高程度。
尽管本.......
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讨论
本方案中描述的方法可用于观察细胞内源性LC3的分布，并在不同条件下定量自噬水平。另一种用于分析LC3分布并确定自噬激活状态的类似方法是转染荧光标记的LC3（例如RFP-LC3）19。RFP-LC3转染的优势在于无需固定细胞（因此可用于活细胞成像20），成本较低，且不依赖于LC3抗体的反应性。另一方面，LC3免疫荧光的优势在于能够呈现内源性LC3的图像，从而避免因LC3过表达可能引起的问题，例如形成与自噬无关的蛋白质聚集体21。此外，该方法不受细胞转染难易程度的影响，因此适用于多种细胞系。然而，该方法的效果取决于所使用的LC3抗体及其反应性，某些细胞系中可能无法有效工作。某些抗体可能对特定物种效果良好，但对其他物种无效，即使理论上这些抗体应能兼容不同物种。以本方案中使用的抗体（LC3B D11）为例，我们发现其在人源细胞（PANC-1、HEK293T、HeLa）和大鼠细胞（AR42J）中效果良好，但在小鼠细胞（MEF细胞）中不适用，因其出现非特异性的细胞核染色。值得注意的是，无论针对内源.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了布宜诺斯艾利斯大学（UBACyT 2018-2020 20020170100082BA）、国家科学与技术研究委员会（CONICET）（PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO；和 PUE 22920170100033）以及国家科学技术促进局（PICT 2019-01664）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm 圆形盖玻片 | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 孔细胞培养板 | Sorfa | 220300 | |
| 无水乙醇 | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG (H+L) | Invitrogen | R37119 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM 800 | |
| 地塞米松 | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| 胎牛血清 | NATOCOR | Lintc-634 | |
| 吉西他滨 | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 3868S | |
| 甲醇 | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M"（实验室封口膜） | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biotechnology | SC-301606 | |
| 胰蛋白酶 EDTA | Gibco | 11570626 |
参考文献
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36<....
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重印与许可
