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表征发育和再生过程中细胞形态和蛋白质定位的方法

June 9th, 2023

1Biological Sciences, University of Arkansas

In This Article

Abstract

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文章讨论：

  1. Hagen， OL， Kim， Y.， Kushkowski， E.， Rouse， H.， Cerveny， KL 活斑马鱼幼虫的眼睛切除以检查视觉系统的神经支配依赖性生长和发育。可视化实验杂志。（180），e63509 （2022）。
  2. Jacques-Fricke， BT， Roffers-Agarwal， J.， Gustafson， CM， Gammill， LS 鸡颅神经嵴细胞培养物的制备和形态学分析。可视化实验杂志。（184），e63799 （2022）。
  3. Shah， HP， Devergne， O. 果蝇卵子发生过程中极化细胞内运输和基底膜蛋白分泌的共聚焦和超分辨率成像。可视化实验杂志。（183），e63778 （2022）。
  4. Parveen， S.， Jones， N.， Millerschultz， I.， Paré， AC. 使用扩增显微镜物理放大整个安装式果蝇胚胎以进行超分辨率成像。可视化实验杂志。（194），e64662 （2023）。

Discussion

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动物是高度复杂的系统，由数百种不同的细胞类型组成，这些细胞类型被组织成数十个不同的组织和器官。研究细胞群在胚胎发育过程中如何相互影响及其环境，不仅可以让我们更好地了解成人身体是如何构建的，还可以揭示疾病和出生缺陷的分子和细胞基础。某些模型系统比其他模型系统更适合解决特定的生物学问题，科学家们采用各种各样的物种和实验技术来探索生物生物学的全部多样性。例如，给定的发育生物学实验可能涉及基因工程、动物解剖、分子生物学、生物化学和高分辨率显微镜。仅根据书面描述和数字复制此类方法可能具有挑战性，因此，以视频形式记录它们以促进正确技术和分析方法的传播非常重要。

发育机制与再生之间的关系，特别是在神经系统中，是一个非常感兴趣的领域，斑马鱼 Danio rerio 因其终生生长和再生能力而成为该领域的关键模型。值得注意的是，视网膜和视顶盖中的细胞之间存在复杂的相互作用，当新的神经元被添加到眼睛和大脑中时，这种相互作用对于建立适当的连接是必要的1。Hagen 等人描述了一种技术，用于表征活斑马鱼胚胎摘眼后去神经支配如何影响神经生长和发育2.他们详细描述了如何 1） 进行摘眼手术，2） 手术后培养幼虫，3） 固定、解剖和储存大脑样本，4） 进行免疫荧光，以及 5） 正确安装和成像样本。该技术可用于研究固定组织中的各种神经发育过程，也可以针对活胚胎的实验进行修改。

神经嵴细胞 （NCC） 代表了产生色素细胞、软骨、骨骼、平滑肌、神经元和神经胶质细胞的重要发育谱系，这些细胞与多种类型的出生缺陷有关3。除了令人印象深刻的多能性外，NCC在发育过程中还经历了上皮到间充质的转变，然后是广泛的迁移，从而使它们成为理解细胞命运和形态之间相互作用的迷人范式4。雏鸡胚胎是研究 NCC 生物学的强大系统，因为 NCC 可以在 体内 可视化和 离体培养，从而允许进行其他系统难以进行的多种类型的分子处理。Jacques-Fricke等人描述了一种灵活的方法，用于培养颅神经皱襞，以在纤连蛋白涂层的盖玻片上产生原代NCC培养物，然后可以进行固定成像或实时成像实验5。他们描述了如何 1） 孵育和分离胚胎，2） 解剖和铺设神经皱襞，3） 固定和染色 NCC，以及 4） 量化和分析 NCC 形态。

基底膜——沿着上皮细胞基底表面产生的细胞外基质——对于动物组织形态和器官功能的建立至关重要6。围绕形成卵的 果蝇 滤泡上皮是研究基底膜如何形成的绝佳模型，因为它分泌基底膜的所有主要保守成分7，并且基质朝向卵室的“外部”，从而促进基于显微镜的分析8。Shah 和 Devergne 描述了使用最流行的超分辨率显微镜类型之一——Airyscan——来检查囊泡运输如何影响基底膜形成9。他们展示了如何 1） 收集和固定 果蝇 卵巢，2） 进行免疫荧光，3） 正确安装样品，以及 4） 捕获用于三维分析的高质量超分辨率数据集。我们注意到，本文包括一个非常有用且简洁的教程，介绍如何正确获取非饱和三维共聚焦数据集，任何希望量化荧光图像的人都应该对此感兴趣。

虽然基于显微镜的超分辨率技术（例如，STED，SIM和Airyscan）10 正变得越来越普遍，但它们比标准共聚焦显微镜更昂贵，并且并非所有研究人员都可以使用。获得超分辨率图像的另一种技术是膨胀显微镜（ExM），它涉及通过将生物样品嵌入并结合到可溶胀的水凝胶11上，在三维空间上物理放大生物样品。然后可以使用标准共聚焦显微镜对扩展的样品进行可视化，以生成横向分辨率为数十纳米量级的图像，可与其他类型的超分辨率显微镜相媲美12。我们的小组描述了如何在全安装果 蝇 胚胎中实施ExM，以揭示标准共聚焦显微镜无法检测到的肌动球蛋白细胞骨架和线粒体网络的亚细胞特征13。我们描述了如何 1） 选择正确分期的胚胎，2） 进行免疫荧光，3） 准备和安装胚胎进行扩增，3） 消化和扩育胚胎，以及 4） 收集超分辨率数据集。该技术应该可以针对 1 毫米量级的各种生物标本进行修改，使其可供广泛的生物学实验室使用。

发育生物学必然是一个极具创造力和跨学科的领域，它利用不同科学领域的技术来量化动物体内发生的细胞生物学。在这里，我们重点介绍了斑马鱼、雏鸟和果蝇的四种发育生物学方法，这些方法采用经典和尖端技术来探测动物发育过程中的细胞形态和亚细胞蛋白定位。目前，该领域的重点是将细胞形态和行为的定量分析与转录组学和蛋白质组学实验相结合，以揭示控制动物发育的分子和生物力学力的全部多样性。

Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们要感谢美国国立卫生研究院 （NIH） 下属的国家普通医学科学研究所 （NIGMS） 的慷慨资助，他们促进了该集合和社论的生成。Paré 实验室由 Paré 博士的 AREA 赠款 （1R15GM143729-01） 资助，我们也是阿肯色州综合代谢研究中心 （1P20GM139768-01 5743） 的一部分，该中心是 NIH 生物医学研究卓越中心。

References

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  2. Hagen, O. L., Kim, Y., Kushkowski, E., Rouse, H., Cerveny, K. L. Eye removal in living zebrafish larvae to examine innervation-dependent growth and development of the visual system. Journal of Visualized Experiments. (180), e63509(2022).
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  13. Parveen, S., Jones, N., Millerschultz, I., Paré, A. C. Using expansion microscopy to physically enlarge whole-mount Drosophila embryos for super-resolution imaging. Journal of Visualized Experiments. (194), e64662(2023).

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