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利用细胞外囊泡介导的血管钙化分析 体外 和 在体 内 模型

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DOI：

10.3791/65013

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2023年1月27日

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1Department of Biomedical Engineering, Florida International University

本文内容

摘要

本文介绍了通过分离小鼠主动脉并提取钙化细胞外囊泡以观察其矿化潜能，从而获取和评估血管钙化的方法学。

摘要

心血管疾病是全球死亡的首要原因，而血管钙化是心血管事件最重要的预测指标；然而，目前尚无针对血管钙化的治疗或干预手段。钙化起始于特定的细胞外囊泡（EVs）内，这些囊泡通过聚集钙离子和磷酸盐离子作为成核位点。本实验方案描述了从小鼠主动脉中获取和评估钙化程度的方法，并分析从中提取的EVs。首先，对小鼠进行大体解剖以收集相关器官，如肾脏、肝脏和肺。随后，将小鼠主动脉从主动脉根部至股动脉段完整分离并切除。将2至3根主动脉合并后置于消化液中孵育，再经超速离心以分离目标EVs。接着，通过将EVs在高磷酸盐溶液中孵育，并在340 nm波长下测定光吸收值，评估其矿化潜能。最后，利用胶原水凝胶体系观察EVs所诱导的钙化矿物形成与成熟过程 关键词：心血管疾病，血管钙化，细胞外囊泡，小鼠主动脉，矿化，超速离心，胶原水凝胶 体外.

引言

钙化是心血管疾病死亡率和发病率最重要的预测指标1。由于钙和磷矿物质的积聚，钙化会改变动脉壁的力学特性2。在动脉粥样硬化中，钙化可加剧局部应力，导致斑块破裂，而斑块破裂是心肌梗死的主要原因。中膜钙化——常由慢性肾病引起——分布更为广泛，可导致明显的动脉僵硬、功能障碍和心脏超负荷2,3。目前尚无针对血管钙化的治疗或预防手段。

血管平滑肌细胞（VSMCs）可转化为类似成骨细胞的表型，并释放具有成矿能力的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡可作为新生矿物质的成核位点，从而驱动钙化过程4,5,6。该过程类似于骨骼中成骨细胞的生理性矿化7。尽管血管壁与骨基质中的矿化终产物相似，但两种组织中成钙性EVs的来源机制有所不同8。目前有多种模型用于研究血管钙化。体外细胞培养模型可通过特殊培养基模拟VSMCs的成骨样转化及随后的矿物质形成。

当研究时 体内 钙化，所使用的模型取决于所研究的钙化类型。高脂血症小鼠模型常用于研究动脉粥样硬化性钙化，后者在富含脂质的斑块中呈现更为局灶性的分布9相比之下，中膜钙化在血管系统中分布更为广泛，通常采用富含腺嘌呤的饮食方案诱导肾功能衰竭，或通过手术切除大部分肾脏的慢性肾病模型进行研究。10,11. 血管钙化的激进模型已联合使用高脂血症和慢性肾病模型12本方案提供了一种用于评估小鼠主动脉中膜钙化和动脉粥样硬化性钙化的方法，从主动脉壁提取细胞外囊泡（EVs），并观察所获得的EVs的矿化潜能。 体外 细胞培养模型。未来的研究可利用这些方法对血管钙化的机制进行分析，并评估潜在的治疗干预措施。

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方案

本研究的体内实验经佛罗里达国际大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准并监督执行，符合美国国立卫生研究院（NIH）现行指南。本方案中，实验操作不因小鼠品系、体重、年龄和性别而有所不同。所研究的钙化类型、饮食及处理方式可能影响实验周期以及所用小鼠的体重，并可能依赖于研究中特定的小鼠品系和性别。在本方案中，使用了雄性和雌性C57BL/6J小鼠，并给予促钙化饮食。小鼠在20至24周龄之间被处死。

1. 主动脉的分离与切除

  1. 荧光标记物
    1. 安乐死前48小时，按照每25 g体重100 µL的推荐剂量，向小鼠注射20 µM OsteoSense 680荧光成像剂 通过 静脉注射
    2. 在通风橱内，放置一块带有四个t型针的泡沫板、一个内衬纸巾的桶、一个塞有纸巾的50 mL离心管、一个1.5 mL微量离心管以及解剖工具（参见 材料表），以及喷雾瓶中的乙醇。将盛有PBS的烧杯置于冰上。
  2. 采血
    1. 将2 mL异氟烷加入一个装有纸巾的50 mL锥形管中。将该管放入桶内，并盖上盖子。
      警告：由于短期接触异氟烷具有毒性，操作时应在通风良好且废气不循环的空间中进行。
    2. 一次将一只小鼠放入桶中。待小鼠镇静后，将其置于纸巾上呈背卧位。用非优势手的手掌固定小鼠，以拇指和食指将耳朵向后压住。
    3. 使用镊子摘除其中一只眼睛。将小鼠置于1.5 mL离心管上方开始采血，采集血量应为1 mL。待血液停止流出后，将小鼠放回桶中继续麻醉。
  3. 安乐死
    1. 在解剖垫上放置一张纸巾。待小鼠麻醉后，将其仰卧置于垫上，使用T形针固定每个肢体，以保持小鼠仰卧姿势。
    2. 用酒精喷洒小鼠腹部。用镊子提起胸部区域的皮肤，使用剪刀沿中线剪开至胸腔。 sternum 沿中线剪开后，分别剪断肋笼两侧的膈肌。
    3. 如有必要，切除肋骨前部以暴露心脏和肺。
  4. 器官摘除
    1. 使用镊子提起皮肤，沿中线做切口。去除多余的皮肤和脂肪。移除生殖器官和膀胱，以及中线以外的所有脂肪。
    2. 将胃肠道（GI）器官移至右侧，沿中线追踪肠道。找到后，提起中线部位，切除直至胃的胃肠道组织。
    3. 从正中线提起肾脏并切除。尽可能靠近肾脏进行切割。
    4. 接下来，通过提起肝叶并从中线处剪离来开始切除肝脏。
    5. 灌注心脏和主动脉。使用10 mL注射器将冷的PBS注入右心室。等待肺部膨胀并变为白色。取出肺组织，以及多余的膈肌或肋骨。
  5. 骨组织去除
    1. 将剪刀充分张开，在小鼠尾部上方的下部区域放置。向下剪开，并开始将脊柱从皮肤中剥离。清除中线两侧的脂肪组织。皮肤完全分离后，在心脏上方稍高位置剪断，取出脊柱及完整器官。若需转移至体视显微镜下操作，将脊柱及完整器官置于盛有PBS的烧杯中，并放入冰桶内。
    2. 将脊柱和器官移入解剖皿中，加入预冷的PBS。用针固定脊柱和肋骨。
    3. 在解剖显微镜下，用镊子小心提起心脏，从脊柱上方和主动脉下方开始剪切。持续剪切直至脊柱底部。将脊柱从解剖皿中移除，固定心脏以及任何多余的脂肪或肌肉。
  6. 显微解剖
    1. 从心脏下方区域开始，辨认出三条管状结构：食管、下腔静脉和主动脉。去除食管和下腔静脉，以获得清晰的主动脉视野。
    2. 使用显微解剖镊子和剪刀，开始抬起脂肪组织，并尽可能贴近主动脉进行剪切，注意不要损伤主动脉。沿中线继续操作，直至暴露整段主动脉及股动脉。
    3. 在心脏处，清除所有脂肪组织，暴露主动脉弓的三个分支。将显微解剖剪插入左心室，剪除主动脉周围的心肌组织，从而分离主动脉根部与左心室。
    4. 主动脉分离并清洗后，使用近红外扫描仪对主动脉成像，以观察血管钙化情况。
    5. 使用自定义的 MATLAB 脚本（补充文件 1使用 MATLAB 脚本（需安装生物信息学工具箱插件）对主动脉近红外扫描所得 TIFF 文件中的钙示踪剂总信号进行定量，并将信号值归一化至扫描的主动脉总面积。首先在 MATLAB 中指定主动脉近红外扫描 TIFF 文件的存储路径，随后依次打开各文件，并从 TIFF 文件中提取像素强度值。
      1. 当图像以彩色图谱形式呈现给用户时，选择钙化程度最高的主动脉作为标尺的最大值。
      2. 当 MATLAB 提示时 "图像中有多少个样本？" 在命令窗口中输入当前图像中主动脉的数量，并逐一选择每根主动脉。每选定一根主动脉后，MATLAB 将生成两幅二值图像：一幅包含主动脉总面积的掩膜，另一幅包含主动脉钙化区域的掩膜。随后利用这些掩膜图像中的数值，计算钙化的总面积、主动脉的总面积、钙化阳性区域所占百分比以及钙化区域的平均强度。
      3. 选择主动脉时，在屏幕上的最新图像中，通过单击左键选取主动脉感兴趣区域的四个角点，围绕图像绘制一个矩形框。要闭合该框，请双击第一个角点。
        ​注意：阈值可能因所使用的钙化模型不同而有所差异。用户需自行确定用于判定血管钙化阳性信号的阈值。一旦实验中设定了阈值，在整个实验过程中必须保持一致。
    6. 定量数据提取后，采用单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey事后检验，以显示各组之间的显著性差异。

2. 从主动脉中分离和提取细胞外囊泡

注意：主动脉组织分离并取出后，即可从中提取细胞外囊泡（EVs）。通过消化液处理及多次离心步骤，可收集EVs，并用于多种不同技术，包括钙化检测、凝胶电泳和免疫印迹13。EVs的分离与提取步骤如下：

  1. 扫描主动脉后，立即汇集两到三根主动脉，以获得足够的蛋白浓度。
  2. 配制消化液，包含 0.25 M 蔗糖、0.12 M 氯化钠（NaCl）、0.01 M 氯化钾（KCl）、0.02 M 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）和 600 U/mL 胶原酶13。
  3. 将汇集的两到三根主动脉置于 1.5 mL 消化液中，37 °C 孵育 2 小时。收集消化液，于 1,000 × g 离心 15 分钟，以去除细胞碎片。
  4. 将上清液在 33,000 × g 下进一步离心 30 分钟，以去除微囊泡。收集上清液，并评估其钙化潜能（见第 3 节）。
    注意：若需对细胞外囊泡（EVs）进行凝胶电泳和蛋白免疫印迹分析，请继续执行后续步骤。
  5. 将上清液在 100,000 × g 下超速离心 1 小时，以分离目标 EVs。
  6. 在上清液进行超速离心的同时，通过加入蛋白酶抑制剂并涡旋至完全溶解，配制 RIPA 裂解与提取缓冲液（见材料表）。
  7. 超速离心完成后，吸除上清液，保留含有 EVs 的沉淀。将沉淀重悬于已配制的 RIPA 裂解液与蛋白酶抑制剂混合液中。样品即可用于凝胶电泳和蛋白质免疫印迹分析。

3. 利用光散射吸光度评估细胞外囊泡的钙化潜能

注意：为了实时测量细胞外囊泡（EVs）的矿化形成，我们采用了一种最初用于研究来自细胞培养的生长板软骨细胞外囊泡矿化形成的检测方法14。由于磷酸钙沉积是钙化的标志性特征，因此由磷酸钙化合物形成引起的光散射吸光度增加可反映其钙化潜能14。体外血管平滑肌细胞（VSMC）模型便于评估细胞外囊泡的钙化潜能。在该技术中，使用配备短波长滤光片的酶标仪可定量检测细胞外囊泡的体外钙化情况。吸光度在340 nm处读取，较高的吸光度表明有更多磷酸钙矿物形成。光散射吸光度检测的实验步骤如下：

  1. 将收集的VSMCs条件培养基在1,000 × g 下离心5分钟，以去除细胞碎片14。
  2. 将上清液在33,000 × g 下离心30分钟，收集上清液并转移至新管中。
    注意：可通过动态光散射（DLS）或纳米颗粒追踪分析（NTA）确认收集的上清液中是否存在EVs
  3. 配制300 mM的磷酸二氢钠（NaH2PO4）无菌溶液。必要时过滤溶液以确保无菌条件。
  4. 向EV样品中加入1%（v/v）的300 mM NaH2PO4，轻轻吹打混匀。取200 µL混合液转移至96孔板中，在37 °C下将96孔板放入酶标仪中孵育。
  5. 设置酶标仪每1分钟记录一次340 nm波长下的吸光度。

4. 利用胶原水凝胶评估细胞外囊泡的矿化钙化形成

注意：通过胶原蛋白水凝胶可观察到细胞外囊泡（EV）的聚集以及微小钙化灶的形成。这些水凝胶作为支架，模拟了体内观察到的胶原蛋白密度in vivo15，从而展示了胶原蛋白对钙化生长的影响。评估EV在水凝胶中矿化形成的实验方案如下：

  1. 第1天
    1. 在DMEM中配制2.5 mg/mL的胶原蛋白溶液。缓慢向胶原蛋白/DMEM混合液中加入5 M氢氧化钠，直至溶液颜色变为红色。检查溶液pH值是否约为7。
      注意：如果溶液变为紫色且碱性过强，请重新开始该步骤。
    2. 将300 µL pH为7的2.5 mg/mL胶原蛋白溶液加入8孔玻璃培养板的每个孔中。在37 °C、5% CO2 及湿度控制条件下孵育72小时。
  2. 第4天
    1. 向部分孔中加入300 µL DMEM作为对照。
    2. 向其余孔中加入先前收集的300 µL EV培养基样品。
    3. 在37 °C、5% CO2 及湿度控制条件下孵育6天。
  3. 第10天
    1. 将2.5 µL Osteosense 680EX与22.5 µL DMEM混合配制溶液。
    2. 向每个孔中加入2.5 µL Osteosense与DMEM的混合液。在37 °C、5% CO2 及湿度控制条件下孵育24小时。
  4. 第11天
    1. 使用适合Osteosense荧光的滤光片对水凝胶进行成像。可通过倒置显微镜从盖玻片底部进行观察，或使用长工作距离物镜从顶部成像。
    2. 使用ImageJ软件中的颗粒分析功能对所采集图像中的钙化数量和钙化大小进行评估。
      1. 使用图像 | 调整 | 阈值命令对图像进行二值化处理，使仅Osteosense信号显示为白色。使用分析 | 分析颗粒命令获取图像中每个钙化区域的信息。为保证一致性，所有图像应采用相同的阈值参数。

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结果

主动脉提取后，使用近红外光学扫描仪成像可直观显示主动脉及其血管钙化情况（图1）。扫描所得荧光图像中的像素强度值代表钙化分布情况，并以彩色热图形式展示。定量方法包括确定阳性阈值，报告主动脉中高于该阈值的区域所占百分比，和/或报告主动脉内像素的平均荧光强度。如图2和图3所示，实验采用市售的原代人冠状动脉平滑肌细胞来演示相关技术。可利用血管平滑肌细胞（VSMCs）的条件培养基来测定细胞外囊泡（EVs）的促钙化潜能。通过酶标仪在480 nm波长下检测吸光度，可定量随时间推移的矿物质形成情况（图2A、B）。在矿化快速期进行线性回归分析显示，促钙化样本的吸光度增长速度比对照样本快1.5倍。在胶原水凝胶中，可通过Osteosense荧光成像观察钙沉积（图3A、B）。单个钙化灶在水凝胶中表现...

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讨论

在执行该实验方案时，需注意获得成功结果的关键步骤。在分离小鼠主动脉的过程中，正确进行灌流至关重要。注射 PBS 时，必须小心避免刺穿右心室，否则液体会直接从心室漏出，无法流经肺部，导致主动脉内残留血液。在正确完成灌流并开始显微解剖后，必须在结束操作和扫描前彻底清除主动脉周围的所有脂肪和脂肪组织。残留的脂肪会导致在将数据归一化至总组织大小时，主动脉显得更大。

由于小鼠主动脉在解剖过程中尺寸较小，常会刺破或将其切为两半。若发生此情况，建议继续正常进行解剖。主动脉片段可紧密排列用于成像。主动脉也可分段放入消化液中用于细胞外囊泡（EV）的分离。在开始EV分离时，需要多个主动脉样本才能获得足够的蛋白量。这一限制意味着必须解剖更多小鼠，以收集足够量的组织，从而获得可靠的结果。

在本演示方法中，我们展示了如何直接从培养的血管平滑肌细胞条件培养基中的细胞外囊泡（EVs）测量其矿化潜能。光散射检测法是一种简单的方法，可用于实时测量EVs的矿化形成。14这有助于了解细胞外囊泡（EVs）内钙化发生的时...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute）的资助（项目编号：1R01HL160740 和 5 T32GM132054-04）以及佛罗里达心脏研究基金会的支持。 我们感谢 Kassandra Gomez 在水凝胶的合成与成像工作中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
8孔腔室盖玻片Thermo Scientific155409PK
10 mL 注射器BD302995
20 G 1英寸针头BD305175
高浓度大鼠尾胶原蛋白Corning354249
胶原酶Worthington BiochemicalLS004174
弯头镊子Roboz Surgical InstrumentRS-8254
解剖皿Living Systems InstrumentationDD-90-S
解剖盘与石蜡United Scientific SuppliesDSPA01-W
DMEMCytivaSH30022.FS
异氟烷Sigma-Aldrich26675-46-7
LI-COR OdysseyLI-CORDLx
显微解剖弯剪（24 mm刀片） Roboz Surgical InstrumentRS-5913
显微解剖弹簧剪（13 mm刀片）Roboz Surgical InstrumentRS-5677
显微解剖弹簧剪（5 mm刀片）Roboz Surgical InstrumentRS-5600
显微解剖镊子（0.10 × 0.06 mm尖端）Roboz Surgical InstrumentRS-4976
Optima MAX-TL 超速离心机Beckman CoulterB11229
OsteoSense 680EXPerkin ElmerNEV10020EX
Pierce蛋白酶抑制剂Thermo ScientificA32963
氯化钾Fischer ChemicalP217
RIPA裂解与提取缓冲液G Biosciences786-489
氯化钠Fischer ChemicalBP358
氢氧化钠Thermo ScientificA4782602
磷酸二氢钠Sigma-AldrichS0751
蔗糖SigmaS7903
Synergy HTX 多功能酶标仪Agilent
组织培养板，96孔Thermo Fisher167008
T型固定针United Scientific SuppliesTPIN02-PK/100
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐Fischer ChemicalBP153

参考文献

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  15. Hutcheson, J. D., et al. Genesis and growth of extracellular-vesicle-derived microcalcification in atherosclerotic plaques. Nature Materials. 15 (3), 335-343 (2016).

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EV

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