本文介绍了通过分离小鼠主动脉并提取钙化细胞外囊泡以观察其矿化潜能，从而获取和评估血管钙化的方法学。
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本文内容
摘要
摘要
心血管疾病是全球死亡的首要原因，而血管钙化是心血管事件最重要的预测指标；然而，目前尚无针对血管钙化的治疗或干预手段。钙化起始于特定的细胞外囊泡（EVs）内，这些囊泡通过聚集钙离子和磷酸盐离子作为成核位点。本实验方案描述了从小鼠主动脉中获取和评估钙化程度的方法，并分析从中提取的EVs。首先，对小鼠进行大体解剖以收集相关器官，如肾脏、肝脏和肺。随后，将小鼠主动脉从主动脉根部至股动脉段完整分离并切除。将2至3根主动脉合并后置于消化液中孵育，再经超速离心以分离目标EVs。接着，通过将EVs在高磷酸盐溶液中孵育，并在340 nm波长下测定光吸收值，评估其矿化潜能。最后，利用胶原水凝胶体系观察EVs所诱导的钙化矿物形成与成熟过程 关键词：心血管疾病，血管钙化，细胞外囊泡，小鼠主动脉，矿化，超速离心，胶原水凝胶 体外.
引言
钙化是心血管疾病死亡率和发病率最重要的预测指标1。由于钙和磷矿物质的积聚，钙化会改变动脉壁的力学特性2。在动脉粥样硬化中，钙化可加剧局部应力，导致斑块破裂，而斑块破裂是心肌梗死的主要原因。中膜钙化——常由慢性肾病引起——分布更为广泛，可导致明显的动脉僵硬、功能障碍和心脏超负荷2,3。目前尚无针对血管钙化的治疗或预防手段。
血管平滑肌细胞（VSMCs）可转化为类似成骨细胞的表型，并释放具有成矿能力的细胞外囊泡（EVs），这些囊泡可作为新生矿物质的成核位点，从而驱动钙化过程4,5,6。该过程类似于骨骼中成骨细胞的生理性矿化7。尽管血管壁与骨基质中的矿化终产物相似，但两种组织中成钙性EVs的来源机制有所不同8。目前有多种模型用于研究血管钙化。体外细胞培养模型可通过特殊培养基模拟VSMCs的成骨样转化及随后的矿物质形成。
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方案
本研究的体内实验经佛罗里达国际大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准并监督执行，符合美国国立卫生研究院（NIH）现行指南。本方案中，实验操作不因小鼠品系、体重、年龄和性别而有所不同。所研究的钙化类型、饮食及处理方式可能影响实验周期以及所用小鼠的体重，并可能依赖于研究中特定的小鼠品系和性别。在本方案中，使用了雄性和雌性C57BL/6J小鼠，并给予促钙化饮食。小鼠在20至24周龄之间被处死。
1. 主动脉的分离与切除
- 荧光标记物
- 安乐死前48小时，按照每25 g体重100 µL的推荐剂量，向小鼠注射20 µM OsteoSense 680荧光成像剂 通过 静脉注射
- 在通风橱内，放置一块带有四个t型针的泡沫板、一个内衬纸巾的桶、一个塞有纸巾的50 mL离心管、一个1.5 mL微量离心管以及解剖工具（参见 材料表），以及喷雾瓶中的乙醇。将盛有PBS的烧杯置于冰上。
- 采血
- 将2 mL异氟烷加入一个装有纸巾的50 mL锥形管中。将该管放入桶内，并盖上盖子。
警告：由于短期接触异氟烷具有毒性，操作时应在通风良好且废气不循环的空间中进行。 - 一次将一只小鼠放入桶中。待小鼠镇静后，将其置于纸巾上呈背卧位。用非....
- 将2 mL异氟烷加入一个装有纸巾的50 mL锥形管中。将该管放入桶内，并盖上盖子。
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结果
主动脉提取后，使用近红外光学扫描仪成像可直观显示主动脉及其血管钙化情况（图1）。扫描所得荧光图像中的像素强度值代表钙化分布情况，并以彩色热图形式展示。定量分析方法包括确定阳性阈值，报告主动脉中高于该阈值的区域所占百分比，和/或报告主动脉内像素的平均荧光强度。如图2和图3所示，实验采用市售的原代人冠状动脉平滑肌细胞来演示相关技术。可利用血管平滑肌细胞（VSMCs）的条件培养基来测定细胞外囊泡（EVs）的促钙化潜能。通过酶标仪在480 nm波长处检测吸光度，可定量测定随时间推移的矿物质形成情况（图2A、B）。在矿化快速阶段进行线性回归分析显示，促钙化样品的吸光度增长速度比对照样品快1.5倍。在胶原水凝胶中，可通过成像Osteosense荧光来观察钙沉积物（图3A、B）。单个钙化灶.......
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讨论
在执行该实验方案时，需注意获得成功结果的关键步骤。在分离小鼠主动脉的过程中，正确进行灌流至关重要。注射 PBS 时，必须小心避免刺穿右心室，否则液体会直接从心室漏出，无法流经肺部，导致主动脉内残留血液。在正确完成灌流并开始显微解剖后，必须在结束操作和扫描前彻底清除主动脉周围的所有脂肪和脂肪组织。残留的脂肪会导致在将数据归一化至总组织大小时，主动脉显得更大。
由于小鼠主动脉在解剖过程中尺寸较小，常会刺破或将其切为两半。若发生此情况，建议继续正常进行解剖。主动脉片段可紧密排列用于成像。主动脉也可分段放入消化液中用于细胞外囊泡（EV）的分离。在开始EV分离时，需要多个主动脉样本才能获得足够的蛋白量。这一限制意味着必须解剖更多小鼠，以收集足够量的组织，从而获得可靠的结果。
在本演示方法中，我们展示了如何直接从培养的血管平滑肌细胞条件培养基中的细胞外囊泡（EVs）测量其矿化潜能。光散射检测法是一种简单的方法，可用于实时测量EVs的矿化形成。14这有助于了解细胞外囊泡（EVs）内钙化发生的时.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家心肺血液研究所（National Heart, Lung, and Blood Institute）的资助（项目编号：1R01HL160740 和 5 T32GM132054-04）以及佛罗里达心脏研究基金会的支持。 我们感谢 Kassandra Gomez 在水凝胶的合成与成像工作中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 8孔腔室盖玻片 | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL 注射器 | BD | 302995 | |
| 20 G 1英寸针头 | BD | 305175 | |
| 高浓度大鼠尾胶原蛋白 | Corning | 354249 | |
| 胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004174 | |
| 弯头镊子 | Roboz Surgical Instrument | RS-8254 | |
| 解剖皿 | Living Systems Instrumentation | DD-90-S | |
| 解剖盘与石蜡 | United Scientific Supplies | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022.FS | |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| 显微解剖弯剪（24 mm刀片） | Roboz Surgical Instrument | RS-5913 | |
| 显微解剖弹簧剪（13 mm刀片） | Roboz Surgical Instrument | RS-5677 | |
| 显微解剖弹簧剪（5 mm刀片） | Roboz Surgical Instrument | RS-5600 | |
| 显微解剖镊子（0.10 × 0.06 mm尖端） | Roboz Surgical Instrument | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL 超速离心机 | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce蛋白酶抑制剂 | Thermo Scientific | A32963 | |
| 氯化钾 | Fischer Chemical | P217 | |
| RIPA裂解与提取缓冲液 | G Biosciences | 786-489 | |
| 氯化钠 | Fischer Chemical | BP358 | |
| 氢氧化钠 | Thermo Scientific | A4782602 | |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| 蔗糖 | Sigma | S7903 | |
| Synergy HTX 多功能酶标仪 | Agilent | ||
| 组织培养板，96孔 | Thermo Fisher | 167008 | |
| T型固定针 | United Scientific Supplies | TPIN02-PK/100 | |
| 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 | Fischer Chemical | BP153 |
参考文献
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Media....
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重印与许可
