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无细胞表达系统：生产和使用方法

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DOI：

10.3791/65014

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2023年7月28日

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1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

本文内容

摘要

文章讨论：

Grasemann， L.， Lavickova， B.， Elizondo-Cantú， MC， Maerkl， SJ OnePot PURE 无细胞系统。 可视化实验杂志。（172），doi：10.3791/62625 （2021）。

史密斯， PEJ， 斯洛卡， T.， 达巴斯， M.， 奥扎， JP使用无细胞自诱导工作流程，在 24 小时内从细胞合成到无细胞蛋白质。可视化实验杂志。（173），doi：10.3791/62866 （2021）。

Cooper， R. M.， Tonooka， T.， Didovyk， A.， Hasty， J. 快速、经济且简单的细菌无细胞裂解物生产。可视化实验杂志。（176），doi：10.3791/62753 （2021）。

Dopp， J. L.， Reuel， N. F. 使用无细胞系统扩增用于蛋白质原型设计的最小线性模板的快速酶促方法。可视化实验杂志。（172），doi：10.3791/62728 （2021）。

McManus， J. B. et al. 用无细胞系统快速表征遗传部分。可视化实验杂志。（174），doi：10.3791/62816 （2021）。

Toh， M.， Chengan， K.， Hanson， T.， Freemont， P. S.， Moore， SJ用于合成生物学和天然产物应用的高产量链霉菌转录翻译工具包。可视化实验杂志。（175）， doi：10.3791/63012 （2021）.

Dinglasan， J. L. N.， Reeves， D. T.， Hettich， R. L.， Doktycz， MJ 液相色谱与示差折光或质谱检测联用，用于基于裂解物的无细胞系统中的代谢物分析。可视化实验杂志。（175），doi：10.3791/62852 （2021）。

Drachuk， I.， Harbaugh， S.， Kelley-Loughnane， N.， Chávez， J. L. 制备载有编码 RNA 适体和核糖开关的 DNA 质粒的多功能丝基微胶囊。可视化实验杂志。（176），doi：10.3791/62854 （2021）。

Jaenes， K. et al. 基于纸张的脚趾固定开关诊断的开发和患者验证的设计到实施研究。可视化实验杂志。（184），doi：10.3791/63223 （2022）。

社论

无细胞表达 （CFE） 系统是一套工具，可在细胞1 的范围之外重建转录、翻译和代谢的关键细胞过程。通过去除细胞膜 来 简化实验，通过去除基因组 DNA 降低 复杂性以及遗传构建体与宿主之间相互作用的相应复杂性，此类方法迅速普及。CFE 系统现在用于基础研究、传感、生物制造和教育。该方法集介绍了生产和使用无细胞系统的新方法的九个示例。

其中三种方法侧重于使无细胞系统的生产更容易获得。Grasemann等人描述了一种更简单的方法来制造PURE系统，这是一种CFE系统，可以重构转录和翻译所需的所有成分，而不是使用细胞裂解物2。作者没有表达和纯化 36 种蛋白质成分中的每一种，而是汇集表达菌株，在一周内生产功能性 PURE 系统。Smith等人使用简化的培养方法为生产基于裂解物的CFE系统提供了一种简化的工艺，该方法将总工作流程缩短至24小时，可在正常工作时间内完成3。Cooper 等人描述了一种使用改良的大 肠杆菌 菌株的方法，该方法能够通过冻融进行细胞裂解，无需其他方法所需的专用设备4。所有这些方法都有助于努力使基础设施较少的实验室能够生产无细胞系统，并且在复杂的传统协议方面具有较少的专业知识。随着竞争性商业试剂盒的出现，越来越多的实验室可以以很小的风险探索 CFE 系统的优势。通过此处介绍的方法，这些实验室可以选择根据自己的需求制作自己的 CFE 系统，而无需在设备或时间上投入大量资金。

两种方法侧重于CFE系统可能进行快速和高通量实验的优势。Dopp等人提出了一种扩增线性DNA模板的方法，用于快速筛选遗传构建体5。使用他们的方法，可以从 DNA 合成公司订购基因设计，然后在 24 小时内扩增和筛选。McManus等人描述了一种类似的方法，其中报告基因用编码不同调节成分的不同引物扩增6。寡核苷酸与 CFE 系统相结合的低成本可以快速、经济高效地筛选启动子等组分。这两种方法都凸显了 CFE 系统在快速实验方面的潜力，将设计和测试结构的时间从使用传统克隆的数周缩短到数天甚至数小时。

接下来的三种方法为 CFE 系统的专业用途提供了工具。Toh 等人提供了一种从 委内瑞拉链霉菌7 创建 CFE 系统的方法。大多数 CFE 方案都基于 大肠杆菌，包括本集合中的所有其他方法。这种针对 委内瑞拉链球菌 的新方法将 CFE 系统的优势带到了对天然产物生产具有广泛兴趣的生物体。Dinglasan等人提供了一种测量无细胞反应中代谢物浓度的方法8。这种测量对于无细胞代谢工程的应用至关重要，在无细胞代谢工程中，CFE 系统的完整代谢用于生产感兴趣的非蛋白质产品。第三，Drachuk等人提出了DNA的微胶囊化，以添加到CFE反应中9。这种方法代表了一组技术，这些技术能够在CFE体系的制造过程中去除天然膜后，将区室化的优势合理地重新引入CFE体系中。这些方法中的每一种都使 CFE 系统的应用范围多样化。

最后，Jaenes等人描述了基于CFE系统10的寨卡病毒真实世界诊断的方法。与 PCR 等竞争技术相比，这些测试和仪器成本较低，作者已经使用多个国家的患者样本成功测试了他们的诊断方法。这项工作是需求点传感应用的一个有力例子，这也许是 CFE 系统准备对现实世界产生最直接影响的领域。

作为一个集合，这些方法捕捉了近年来 CFE 系统活跃研究的主要领域的代表性领域。改进 CFE 系统生产和实现高通量实验的方法得到了很好的体现，并且提供了 CFE 系统许多更具体用途的示例。其他感兴趣的领域包括生产用于医疗应用的复杂蛋白质、非经典氨基酸的掺入、长期储存的优化以及人工细胞的开发。鉴于进入门槛的降低、快速实验的潜力以及更广泛的功能，我们预计 CFE 系统的采用将继续加速，所有这些都可以通过本集合中介绍的方法实现。其余挑战取决于应用领域。对于生物制造来说，通过转向更便宜的基材和改善回收来大规模降低成本至关重要。对于传感，需要在Jaenes等人的例子基础上进行大量工作，以在各种需求点应用中展示强大的性能。从广义上讲，该领域需要继续完善核心技术，同时扩大 CFE 系统可以完成的工作范围。

披露

作者没有什么可透露的。

致谢

作者感谢国防部长办公室的 Applied Research for the Advancement of S&T Priorities 计划支持促成该集合的合作。

参考文献

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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