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肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 是一种毁灭性的神经退行性疾病，一生中大约每 400 人中就有 1 人受到影响。该疾病最初表现为上运动神经元和下运动神经元损伤，最终在症状1 出现后 2-5 年内发展为因呼吸衰竭而瘫痪和死亡。ALS 可以是遗传性的，有 30 多种不同的基因突变，但只有 4 个基因变异（C9orf72、FUS、SOD1、TARDBP）约占家族性 ALS 的 55%。大多数 ALS 病例（约 90%）代表散发性 ALS，其主要原因尚不完全清楚2。迫切需要通过使用适当的工具和模式生物来揭示 ALS 的机制。在这个方法集中，我们概述了模仿这种疾病的最新研究进展，并希望最终找到治疗方案。例如，可以分化为运动神经元或星形胶质细胞的诱导多能干细胞（iPSC）的应用提供了人源化模型系统3,4,5。此外，在此方法集合中，还介绍了动物模型，例如果蝇研究体内葡萄糖摄取和神经肌肉接头 （NMJ） 6,7，小鼠研究皮质神经元8，秀丽隐杆线虫或斑马鱼研究运动障碍 9,10 和死后患者组织11。
斑马鱼幼虫是透明的，它们的运动神经元是直接可见的， 使其成为非侵入性 体内 研究的完美工具。Asakawa 等 人显示了光遗传学表达的TDP-43在单个脊髓运动神经元中的相变9。辐照后，可以观察和分析TDP-43的细胞质重定位。细胞质 TDP-43 的聚集是 ALS 中退化运动神经元的标志。该方法允许以亚细胞、时间方式对ALS相关蛋白进行功能研究和分析。
Coyne和Rothstein采用超分辨率结构照耀显微镜（SIM），详细介绍了分离细胞核的方案，并描述了如何研究核孔蛋白复合物11。核孔蛋白复合物由大约 30 种不同核孔蛋白 （Nups） 的多个拷贝组成。核质转运 （NCT） 损伤和 Nup 改变已被证明是许多神经退行性疾病（包括 ALS）的早期标志。通过提取细胞核，可以在3D中研究鼻咽癌和核质中的单个Nup蛋白。有趣的是，这不仅可以应用于 iPSC 衍生的细胞，还可以应用于死后组织。
Currey 和 Liachko 描述了两种测定方法，用于区分 ALS10 秀丽隐杆线虫模型中的轻度、中度和重度运动障碍。在径向运动测定中，测量表面上的爬行，使其成为一种简单且经济高效的测定。在他们的第二种方法，即游泳测定中，可以使用基于计算机的跟踪方法测量抽打运动。作者用它来研究 TDP-43 和 tau。
Hayes 等 人还描述了一种研究NCT8的方法。他们将透化方法应用于神经元培养物。他们使用原代小鼠皮质神经元，描述了一种通过使用低渗裂解与牛血清白蛋白垫相结合来维持核膜完整性的方法。通过这样做，核进口仍然以依赖能源的方式发挥作用，从而提供了一个高内涵的显微镜和分析平台。该平台未来将具有广泛的适用性，用于研究原代神经元的被动和主动核转运。
快速评估作、疾病相关蛋白质或 RNA 如何影响突触过程以及治疗药物是否可以恢复这些功能对于 ALS 研究至关重要。使用iPSC衍生的运动神经元以及来自小鼠的原代神经元，Krishnamurthy 等人 提出了一种协议，能够实时监测突触前钙流入动力学和突触囊泡膜融合3。作者证明 C9orf72-（GA）50 转染会损害突触传递，强调这些方法适用于检测基于突变的突触功能差异。
葡萄糖摄取改变是 ALS 的病理生物学特征之一。在这个 果蝇 模型中，Loganathan 等人 描述了一种基于FRET的方法来测量特定细胞中葡萄糖摄取的细胞内变化6。使用基因编码的葡萄糖 FRET传感器，他们用TDP-43表达神经元验证了他们的方法，这些神经元显示出更高的葡萄糖摄取。在TDP-43G298S 突变品系中，只有在葡萄糖刺激下才能检测到葡萄糖摄取增加。该方法为研究 ALS 中的糖酵解以及与运动神经元再生相关的一般糖酵解提供了重要工具。
保留 NMJ 结构的解剖技术对于研究 果蝇 腿沿运动神经元随时间的变化至关重要。史迪威和阿古德洛利用一种技术，可以表征NMJ以使用免疫细胞化学7识别运动神经元乔木。有趣的是，成年神经元在苍蝇的一生中都存在，大约是 90 天。将 SOD1H71Y 突变与野生型进行比较，作者展示了年龄依赖性胸花肿胀、蛋白质聚集体和线粒体肿大的不同标志物。
使用共培养系统模拟 NMJ 的创新满足了研究运动神经元和肌管之间解离的迫切需求。就这种方法而言，Stoklund Dittlau 等 人描述了如何培养人iPSC衍生的运动神经元和人类原代成血管母细胞衍生的肌管以形成功能活性NMJ4。作者通过激活运动神经元在 Fluo-4 标记的肌管中用氯化钾和钙流入来显示它们的功能，这被 NMJ 阻滞剂的施用所消除。
最近，共培养系统越来越受到关注。与使用单培养细胞的方法相比，不仅研究培养皿中的一种细胞类型，而且研究多种细胞类型的好处是更好地模拟生理条件。ALS 相关的病理生物学，例如星形胶质细胞介导的毒性和神经元过度兴奋性，可以使用这种方法进行研究。在Taga 等人的视频中，显示了在共培养中皮质神经元和星形胶质细胞的产生，并结合多电极阵列（MEA）设置，用于监测电生理学5。可以随着时间的推移监测功能活性，从而在细胞组成和不同的培养条件下具有灵活性。这还提供了一个平台来测试药物的治疗潜力及其对功能活性的影响。
目前，FDA批准的ALS治疗方法只有三种，应用潜力有限。为了找到更有前途的治疗方法，未来的研究必须通过采用多种模型系统和方法来更好地了解病理生物学。毫无疑问，人类 iPSC 衍生模型将为研究潜在的分子机制提供一个有趣的平台。这与斑马鱼、 秀丽隐杆线虫、 果蝇或啮齿动物等模型系统相结合，将导致该领域的进步。此外，未来的流行病学研究有望为环境因素如何在 ALS12 的发展中发挥作用提供更多见解。随着数据集的不断扩大和生物信息学的高速发展，未来揭示神经退行性疾病的共同点将变得更加容易。这将带来新的治疗甚至预防途径。