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甚至在 2017 年生物分子冷冻电子显微镜 （cryoEM） 获得诺贝尔奖之前，该领域就已经引起了人们的兴奋。分辨率革命正在顺利进行，结构生物学正在寻求冷冻电镜作为一种接近 X 射线晶体学金标准的表征方法1。早期，冷冻电镜领域主要包括冷冻透射电子显微镜（cryoTEM）生成的数据。现在，随着显微镜、样品制备仪器和样品制备方法的进步，生成的数据类型变得更加多样化。冷冻电镜不再用于冷冻透射电镜的蛋白质表征。该领域已经发展壮大，现在包括冷冻扫描电子显微镜和聚焦离子束 （cryoSEM/FIB） 生成的数据。这种影响在多个学科中得到更广泛的体现，包括分子、细胞、组织和水凝胶等合成材料的成像研究。
成像能力的进步一直是冷冻电镜开发的驱动力。相机、探测器和图像处理的改进为以更少的能量输入进行成像铺平了道路，这使得脆弱的生物样品能够在成像过程中存活下来。在透射电镜中，低剂量光束曝光已转化为断层扫描的应用，其中单个样品在多个角度重复成像以生成3D重建2,3。SEM/FIB 的进步也提高了分辨率，同时使用更少的能耗。重要的是，这导致了非导电样品成像的改进，从而在SEM / FIB中转化为更好的体积成像4,5。这些改进推进了所有生物电子显微镜成像，但它们特别改进了冷冻成像，其中样品很脆弱，并且没有添加额外的重金属来提高对比度。
随着成像能力的进步，样品制备仪器也在不断进步。在冷冻电镜样品制备中，第一步是样品成功玻璃化。水合样品被冷冻形成无定形冰，从而避免了冰晶形成造成的损害。主要策略是在液态乙烷中对分子和小细胞进行急冻，或对厚度达几百微米的较大样品进行高压冷冻 （HPF）。急冻技术的进步通过减少沿空气/水界面的自组装，可以更好地捕获所有方向的分子6。此外，HPF 技术的进步允许在冷冻前对样品进行光和电刺激7。最近，开发了一种新的HPF技术，可以与荧光显微镜接口，允许活细胞的荧光成像和HPF冷冻之间的短时间延迟（<2秒）8。
上述进展为冷冻电镜领域注入了活力，并激发了新方法的发展。既定技术也得到了重振。在这里，我们提出了一系列专注于推进冷冻电镜的方法，旨在将这些策略传播到快速扩展的研究领域。
虽然成像能力和样品制备仪器的改进一直是冷冻电镜领域进步的主要驱动力，但这项研究的一个主要障碍仍然是样品的实际制备。Truong等人9 提出了一种利用空气/水界面脂质单层形成的方法。在 TEM 网格上形成脂质层，并充当目标膜蛋白的支架。对于多层或堆叠膜样品，Johnson等人10 提出了一种“剥离”多余层的策略，在网格上留下适合TEM成像的单层。在另一篇文章中，Chang 等人 11 认识到一些蛋白质是温度依赖性的，并且在高温下观察到相关结构。他们描述了一种改进的插入式冷冻方法，该方法允许在高温下将样品施加到网格上，同时在插入式冷冻后仍能获得玻璃冰。为了进一步控制冷冻网格制备的过程，Kang等人12 提出了一种高通量方法，用于生产用于TEM网格的微图案芯片，其中孔隙具有可控的深度。该方法可以提供另一个变量来控制网格制备过程中无定形冰的厚度。
多种成像方式的相关性具有影响力。Bieber 等人 13 描述了一种冷冻工作流程，其中在冷冻荧光显微镜中对冻结网格进行成像，以定位感兴趣的荧光区域。然后将网格转移到冷冻SEM/FIB，其中基准用于将荧光图像与SEM图像对齐，从而允许荧光区域成为FIB铣削的目标。将目标区域变薄至几百纳米，然后将网格转移到冷冻透射电镜上，对变薄的目标位置进行断层扫描。DiCecco等人14 证明了液体TEM和冷冻TEM之间的相关性，从而更接近将高分辨率冷冻TEM数据与动态运动分子的TEM数据耦合的目标。
大型数据集的自动采集也是一个感兴趣的领域。宝贵的仪器时间需要最大化，而自动化是关键步骤。Kumar等人15 描述了用于冷冻TEM成像的自动数据采集软件的逐次点击设置。
随着冷冻电镜领域的不断发展，样品制备将取得进一步的进步，冷冻电镜的影响将在更多学科中得到广泛体现。一些进步将涉及的不是新技术，而是加强现有技术。这些技术将更快、更容易、更稳健，吞吐量更高。随着自动化增加数据输出，发展的关键领域将是图像分析和数据处理。此外，人工智能将发挥重要作用。我们应该期待看到仪器成本和占地面积的减少，这将使这项技术能够更广泛地普及，尽管这些发展的实现速度可能较慢。