本方案通过在小鼠中模拟中央束综合征（CCS），提高了实验的可重复性，并最大限度地减少了对实验动物的操作损伤，避免过度破坏解剖结构。本研究的策略具有优势，因其能够产生一致的结果，从而有利于对损伤机制的研究。
本文内容
摘要
摘要
脊髓中央束综合征（CCS）的动物模型可显著促进临床前研究。明确的解剖通路可提供微创暴露方法，并在手术过程中减少对实验动物的额外损伤，从而在实验期间维持一致且稳定的解剖形态，最小化个体间的行为学和组织学差异，提高实验的可重复性。在本研究中，我们采用脊髓损伤同轴平台（SCICP）结合微创技术暴露C6节段脊髓。在椎体稳定器的辅助下，固定椎体，并使用SCICP对C57BL/6J小鼠的脊髓施加5 g/mm2和10 g/mm2的压迫重量，以诱导不同程度的C6脊髓损伤。结果表明，该模型的损伤主要集中于中央脊髓周围的灰质，符合既往对CCS的描述，可用于进一步的CCS研究。最后，本文提供了组织学结果供读者参考。
引言
近年来，脊髓损伤（SCI）的发生率持续上升，老年人因较轻微的创伤导致的损伤更为常见1。这些损伤更多累及颈椎，且更常导致不完全性神经功能障碍2。
在21世纪，中央束综合征（CCS）是最常见的不完全性脊髓损伤类型，占所有脊髓损伤病例的一半以上。与传统的不完全性脊髓损伤相比，CCS的特点是上肢功能障碍明显重于下肢3。其主要表现为以上肢无力为主，感觉障碍和膀胱功能障碍相对较轻。目前认为CCS的病因是创伤后脊髓中央区域出血和水肿所致，或如近期研究所提出的，是由于椎管狭窄导致脊髓受压后引发的沃勒变性（Wallerian degeneration）。CCS的治疗缺乏高级别的循证医学证据指导，因而需要对其病理生理机制有全面深入的理解4。然而，目前尚未见报道CCS的动物模型。建立合适的动物模型对于阐明其病理生理机制至关重要，可为临床及临床前研究提供必要的研究基础5,6,7,8,9,10。
本研究利用脊髓损伤同轴平台（SCICP）和微创手术方案建立小鼠颈椎脊髓损伤（CCS）模型，为进一步研究和理解CCS提供了可能。在研究过程中，通过组织学、磁共振成像（MRI）以及免疫荧光分析证实了该模型的有效性。
方案
实验经山东大学齐鲁医学院实验动物伦理与福利委员会批准（批准编号：22021），并遵循美国国立卫生研究院（NIH Publications No. 85-23，1996年修订版）发布的《实验动物护理和使用指南》进行。本研究中使用的小鼠均为9至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠，购自济南朋悦实验动物有限公司（中国济南）。本研究共纳入9只小鼠，随机均分为对照组、轻度损伤组和重度损伤组。在损伤后第7、28和70天，分别处死每组中的一只小鼠。
1. C6 椎板切除术及脊髓暴露
注意：操作在显微镜下进行。通过注意以下两个方面可避免出血：(i) 应避开所有血管；(ii) 需在肌肉的起始点和止点处将其分离。
- 准备手术器械和SCICP。
注意：SCICP 的结构已在先前的研究中报道过11与之前的研究不同之处在于，本方案通过压迫方式造成脊髓损伤。该平台的两种不同重量（10.4 g 和 20.8 g）可产生 5 g/mm 的压迫力2 和 10 g/mm2, 分别（图1）。脊髓暴露和压迫步骤如图所示 图2. - 使用鼻罩通过吸入方式给予小鼠异氟烷（诱导：3%-5%，维持：1.5%-2%）。
- 麻醉生效后，探查小鼠颈部后方中线处的一个小隆起，即第二胸椎（T2）的棘突。
- 剃除周围毛发 该隆起部位。用碘伏溶液消毒皮肤，重复三次，每次交替使用75%乙醇作为皮肤消毒剂。
- 将小鼠俯卧位固定于手术台上。涂抹眼膏以保护眼睛。
- 在胸部下方放置一个3-4 mm厚的垫子，使颈椎呈弓形弯曲，以利于术中暴露椎板间隙并保持气道通畅。术前注射布托啡诺作为镇痛剂（0.05–0.1） mg/kg，皮下注射（SQ）。
- 用无菌手术刀在中心位置做一条1-1.5厘米的纵向切口nd 胸椎棘突以暴露筋膜层（图2A).
- 使用无菌显微剪剪除T2上方的部分脂肪组织，以暴露T2棘突。
- 沿正中线分离C5-T2节段双侧斜方肌和菱形肌 微型剪刀（图2B).
- 用显微剪刀分离 C5-T2 椎板上的肌肉，并用无菌显微牵开器将肌层向两侧牵开（图2C).
- 切开椎骨表面的多裂肌和颈椎脊柱肌肉。
- 根据棘突最高点定位T2。从T2向头端依次探查棘突以定位C6。图3).
- 用镊子提起C6椎板，剪除椎板，即可暴露脊髓（图 2D).
2. 颈髓压迫性损伤
- 用脊柱稳定器夹紧C6-7关节突关节，并锁定装置（图2E）。
- 将无菌重物尖端对准暴露的脊髓，确保尖端的平坦底部与脊髓背侧表面平行（图2F）。
- 调节套筒，使重物压迫脊髓。当重物与脊髓保持相对恒定位置时，停止调节（图2G）。
注意：此过程切勿过于剧烈或迅速，以免重物对脊髓造成挫伤性损伤。 - 压迫5分钟后，移除重物和脊柱稳定器。
- 在显微镜下观察压迫后脊髓的颜色变化（图2H）。
- 用无菌PBS冲洗，并用吸引器清洁手术区域。
- 使用聚丙烯不可吸收缝线（规格：6-0）逐层缝合肌肉和皮肤。
- 对手术区域进行消毒，将小鼠置于保温垫上直至完全恢复意识，然后将其放回鼠笼。
- 术后3天内每8-12小时皮下注射一次布托啡诺镇痛（0.05-0.1 mg/kg）。
3. 组织学分析
- 在损伤后第7天、第28天或第70天，通过腹腔注射1.25%三溴乙醇（0.02 mL/g体重）对小鼠进行麻醉。 随后经心脏灌注60 mL磷酸盐缓冲液（PBS）和20 mL 4%多聚甲醛11。
- 使用显微剪刀从损伤中心两侧各0.5 cm处横断脊髓，并保留中间1 cm长的节段。
- 将保留的脊髓组织置于4 ˚C的30%蔗糖溶液中浸泡48小时。
- 用OCT包埋剂包埋组织，使用冷冻切片机将组织切成6 µm厚的切片，并将切片收集到载玻片上。
- 苏木精-伊红染色
- 用1× PBS冲洗6 µm切片，每次5分钟，共3次，以去除残留的OCT。
- 将切片浸入苏木精染液中染色90秒，然后在流动水下冲洗3分钟。
- 将切片浸入伊红染液中染色4分钟，随后用95%酒精浸泡30秒以去除多余染料。
- 最后依次用95%酒精和100%酒精（各两次）脱水，每次30秒，再将切片置于二甲苯中透明2分钟。然后用树脂胶和盖玻片封片。
- 普鲁士蓝染色
- 将切片浸入等体积混合的10%亚铁氰化钾和10%盐酸溶液中，孵育20分钟。
- 用蒸馏水冲洗3次，再用核固红复染5分钟。
- 用蒸馏水冲洗3次，接着用95%酒精冲洗一次，再用100%酒精冲洗两次，每次5分钟。
- 在二甲苯中透明两次，每次3分钟，然后用树脂胶封片12。
- 免疫荧光染色
- 在37 °C下用以下一抗孵育切片1小时：兔抗离子化钙结合接头分子1（Iba-1）抗体（1:500），该蛋白在神经损伤后小胶质细胞中表达上调；鼠抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（1:300），该蛋白在中枢神经系统星形胶质细胞中表达；兔抗神经丝蛋白-200（NF-200）抗体（1:2000），该蛋白在神经丝中表达。
- 室温下用二抗孵育1小时：Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor594标记的山羊抗兔IgG（1:1,000）。
- 使用荧光显微镜拍摄图像并进行进一步分析13。
4. 磁共振成像
- 在损伤后第7天，通过微型面罩使用异氟烷麻醉剂（1%-2% 异氟烷，20%-30% O2）对小鼠进行麻醉。
- 以矢状位扫描颈段脊髓。MRI成像采用以下参数：多层面交错式自旋回波（SE）序列，TR/TE = 2500/12 ms，采集矩阵 = 256 × 128，视野（FOV）= 12 × 8 mm2，层厚 = 1 mm，激发次数（NEX）= 2。
注意：扫描过程中应保持小鼠呼吸频率在10–15次/分钟，以消除与呼吸相关图像伪影14。
结果
矢状位HE切片显示，尽管重度组灰质损伤区域更广泛，但白质区域仍保持连续性。此外，重度组与轻度组之间灰质损伤面积的差异支持了本方案中分组设置的合理性（图4）。
冠状面HE切片显示，两组中的病灶主要存在于灰质中。在重度组中，围绕灰质的白质结构更易受到影响，但白质的轮廓仍得以保留（图5）。NF-200免疫荧光结果显示，尽管重度组中灰质周围的白质受到累及，白质仍相对完整。这些结果与先前研究中描述的CCS特征一致4（图6）。
在损伤后7天的矢状位HE切片中，轻度组和重度组均未发现红细胞。普鲁士蓝染色显示，轻度组未出现含铁血黄素沉积，而重度组则有。这些结果表明，出血的诱导可能需要相对较重的损伤程度（图7）。
免疫荧光显示，轻度和重度损伤中均存在 GFAP 和 Iba-1 表达升高的区域，提示病灶部位发生炎症反应并形成胶质瘢痕。此外，重度损伤组的病灶面积大于轻度损伤组（图8）。
磁共振成像（MRI）是一种相对微创的观察脊髓的方法。结果表明，在轻度和重度组中，病灶区域均出现低信号改变，并伴有高信号边缘。重度组的低信号区域显著更大（图9）。低信号提示该区域存在网织红细胞裂解物的沉淀，而周围高信号则提示存在炎症反应。我们在之前的研究中进行了多项行为学测试。例如，前肢抓力测试显示出显著差异15。
图 1：SCICP 的套筒与砝码。 尖端的表面积根据 C6 椎板切除术后测得的脊髓暴露面积设计为 1.3 mm × 1.6 mm。砝码表面涂有聚四氟乙烯（PTFE），可有效减少砝码与套筒内壁之间的摩擦力。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：脊髓的暴露与压迫。（A）皮肤纵向切口；（B）从T2棘突处向头侧分离肌肉；（C）分离椎板上方的肌肉；（D）C6椎板切除术；（E）固定椎体；（F）确定压迫位置；（G）脊髓压迫；（H）脊髓压迫后，脊髓上方的白质无明显损伤。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：小鼠颈椎骨骼解剖结构。 箭头所示位置为T2棘突。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：矢状位HE染色切片。（A）颈椎脊髓矢状切面。（B、C）重度组的损伤比轻度组更严重，但两组的损伤均主要集中在中央管周围的灰质区域。伤后7天、28天和70天的图像表明，在相同损伤组别中，不同时期的损伤表现无明显差异，且脊髓上下行白质的连续性得以保持。比例尺：1 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：颈段脊髓损伤冠状面HE染色切片。（A-C）损伤主要累及中央管周围的灰质，如图B和C所示。重度损伤组的损伤范围较轻度损伤组更广泛，且更可能累及白质。比例尺：400 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 6：损伤后 NF-200 冠状面免疫荧光染色结果。 白质轮廓处 NF-200 反应无显著差异。比例尺：400 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7：普鲁士蓝染色。（A-C）重度组可见含铁血黄素沉积，而轻度组未见。比例尺：400 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 8：损伤后 GFAP 和 Iba-1 的矢状面免疫荧光染色结果。 （A-C）随着损伤程度的增加，GFAP 和 Iba-1 的反应区域也随之扩大。比例尺：1 mm。 请点击此处查看该图的高清版本。
图9：颈椎脊髓损伤后的矢状位MRI（T2加权图像）。在轻度和重度损伤组中，损伤区域表现为低信号强度，且重度损伤组的低信号区域明显更广泛。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
在多种类型的脊髓损伤中，中央束综合征（CCS）是最具潜在可治疗性的损伤类型之一3,4。由于缺乏合适的实验室研究模型，20世纪50年代以来对CCS的研究主要集中在临床研究和尸体解剖分析3,16,17。本研究展示了利用相容性工具和微创操作建立小鼠CCS模型的方法。从技术角度看，该平台具有良好的可操作性和可重复性。实验结果证实了该方法的有效性，所建立的模型最接近既往研究中定义的CCS标准模型4。
先前的压缩损伤研究主要采用动脉瘤夹、球囊和校准的镊子9,10,18此外，大多数损伤发生在胸段脊髓水平18选择脊髓C6节段作为本研究的损伤节段，以研究中央束综合征（CCS）的特征。值得注意的是，CCS模型的存活率也是确保实验一致性的关键因素之一。本研究报道了对小鼠颈段脊髓造成双侧压迫性损伤，而高位脊髓创伤性损伤，尤其是双侧损伤，若过于严重，可能导致实验动物死亡。根据El-Bohy的研究，C4/5节段脊髓损伤更易影响下行球脊束及与呼吸相关的运动神经元，从而导致实验动物出现呼吸抑制甚至死亡。18,19,20,21,22,23在本研究中，颈椎脊髓C6节段受到不同程度压迫的小鼠，其组织学检测结果显示损伤特征存在显著差异。尽管Forgione报道的小鼠颈椎脊髓钳夹模型在行为学和组织学上均表现出显著差异，但该模型需破坏椎弓根、关节突、椎板甚至神经根，以便使用改良钳子夹持脊髓，这一过程对颈椎结构的稳定性造成了显著影响。24另一项关于颈椎损伤的研究报道了使用横突作为固定位点5尽管关节突已避免受损，但过度的肌肉组织损伤同样可能影响脊髓的稳定性。在本研究中，仅对6th 切除颈椎椎板以维持颈髓的稳定性，同时保留相邻的关节突关节，并避免过度的肌肉损伤。与此同时，来自脊髓上方的减压可防止对神经根造成损伤。
HE 检测结果表明，各组小鼠颈髓损伤区域主要位于中央脊髓附近的灰质，符合中央脊髓综合征（CCS）的特征，且不同组之间的损伤范围存在显著差异。值得注意的是，我们所展示的病理切片可能低估了损伤表现，因为标本是在损伤后数天采集的。免疫荧光（NF-200）结果显示脊髓白质区域的神经传导束损伤较轻，进一步证实 CCS 的损伤主要集中于中央脊髓周围。该免疫荧光结果与先前的病理组织学结果一致。既往研究表明，CCS 可导致中央脊髓附近水肿，进而引发血肿，并最终造成外侧皮质脊髓束内侧部分功能障碍3。出血被认为是 CCS 的典型特征之一，但在后续的影像学和尸检研究中却很少被观察到17。本研究中，损伤后第 7 天的 HE 检测结果提示所有组均出现组织水肿迹象，但在损伤区域未发现残留的红细胞。因此，采用普鲁士蓝染色检测损伤区域是否存在出血，结果显示在严重损伤组损伤后第 7 天的损伤区域可见含铁血黄素沉积，而轻度损伤组则未见此现象。MRI T2 加权像显示，轻度和重度损伤组在损伤后第 7 天的损伤区域均出现低信号区，提示该处存在网织红细胞裂解物沉积。这些结果间接表明，既往研究结果之间的差异可能源于 MRI 检测相比组织学检测具有更高的敏感性14，此外，损伤的严重程度也可能影响损伤区域出血量。GFAP 在损伤区域也有广泛表达。同时，在未受损区域也观察到 Iba-1 的表达，提示炎症反应持续存在，这与 MRI 结果一致：病灶区域低信号周围出现高信号环，提示存在炎症反应。最终，根据本研究结果，模型中的损伤区域集中于中央脊髓周围的灰质，总体上与既往报道的描述基本一致13。遗憾的是，我们未对每只实验动物重复进行 MRI 检查以动态观察损伤部位随时间的变化情况。未来的研究者可在工作中纳入此项检测，以更深入地探究 CCS。此外，还可加入针对 NeuN 等神经元标记物的免疫标记，以明确定义灰质区域。
综上所述，病理学和MRI扫描所见特征与既往研究中描述的CCS特征具有高度相似性4。本研究建立的CCS可行模型为进一步研究和理解CCS提供了支持。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由干细胞及转化研究国家重点研发计划（2019YFA0112100）和国家自然科学基金重点项目（81930070）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 固定液 | Solarbio | P1110 | 4% |
| 抗神经丝重链多肽抗体 | Abcam | ab8135 | 稀释比例 (1:2000) |
| 伊红染色液（水溶性） | Biosharp | BL727B | |
| 乙醇 | 富宇试剂 | ||
| 荧光显微镜 | KEYENCE | BZ-X800 | |
| 冷冻切片机 | Leica | ||
| GFAP (GA5) 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling TECHNOLOGY | #3670 | 稀释比例 (1:600) |
| 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR | 稀释比例 (1:1000) |
| 山羊抗兔 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | 稀释比例 (1:1000) |
| 苏木精染色液 | Biosharp | BL702A | |
| 小鼠 | 济南朋悦实验动物有限公司 | C57BL/6J | |
| 显微外科器械 | 山东优莱特生物科技有限公司 | 所有手术器械均为定制 | 眼科剪、蚊式钳、显微外科镊、显微剪 |
| 正常羊血清封闭液（工作液） | 中杉金桥 | ZLI-9022 | 工作液 |
| O.C.T. 包埋剂 | SAKURA | 4583 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Solarbio | P1020 | pH 7.2–7.4 |
| 普鲁士蓝铁染色试剂盒（含伊红） | Solarbio | G1424 | |
| RWD 实验动物吸入麻醉工作站 | RWD 生命科学有限公司 | R550 | |
| 小动物活体显微CT成像系统 | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| 脊髓损伤同轴定位平台 | 山东优莱特生物科技有限公司 | 定制（冯氏标准） | https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~ 1~b0yRFKOq&alg_id= 0&slg=tagGoodList-default%2COpBottom%2Cuuid% 2CabTraceId&components_ style_layout =1&reft=1659409105184&spm= g.930111970_f.81386274&alias= 367x5ovgn69q18g&from_uuid= 1362cc46-ffe0-6886-2c65-01903 dbacbba&sf=qq_sm&is_share= 1&shopAutoEnter=1&share_cmpt =native_wechat&is_silence_auth=1 |
| 手术显微镜 | 卓茂 医疗科技有限公司 | zumax, OMS2355 | |
| Tris 缓冲盐水+Tween (TBST) | Solarbio | T1082 | 稀释比例 (1:19) |
| 二甲苯 | 富宇试剂 |
参考文献
- Liu, C., et al. Survival in 222 Patients With Severe CSCI: An 8-Year Epidemiologic Survey in Western China. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 100 (10), 1872-1880 (2019).
- Qi, C., Xia, H., Miao, D., Wang, X., Li, Z. The influence of timing of surgery in the outcome of spinal cord injury without radiographic abnormality (SCIWORA). Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 223(2020).
- Brooks, N. P. Central cord syndrome. Neurosurgery Clinics of North America. 28 (1), 41-47 (2017).
- Avila, M. J., Hurlbert, R. J. Central cord syndrome redefined. Neurosurgery Clinics of North America. 32 (3), 353-363 (2021).
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A mouse model of bilateral cervical contusion-compression spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- López-Dolado, E., Lucas-Osma, A. M., Collazos-Castro, J. E. Dynamic motor compensations with permanent, focal loss of forelimb force after cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 30 (3), 191-210 (2013).
- Allen, L. L., et al. Phrenic motor neuron survival below cervical spinal cord hemisection. Experimental Neurology. 346, 113832(2021).
- Reinhardt, D. R., Stehlik, K. E., Satkunendrarajah, K., Kroner, A. Bilateral cervical contusion spinal cord injury: A mouse model to evaluate sensorimotor function. Experimental Neurology. 331, 113381(2020).
- Ropper, A. E., Ropper, A. H. Acute spinal cord compression. The New England Journal of Medicine. 376 (14), 1358-1369 (2017).
- Sun, G. D., et al. A progressive compression model of thoracic spinal cord injury in mice: function assessment and pathological changes in spinal cord. Neural Regeneration Research. 12 (8), 1365-1374 (2017).
- Elzat, E. Y., et al. Establishing a mouse contusion spinal cord injury model based on a minimally invasive technique. Journal of Visualized Experiments. (187), 64538(2022).
- Lu, J., Xu, F., Lu, H. LncRNA PVT1 regulates ferroptosis through miR-214-mediated TFR1 and p53. Life Sciences. 260, 118305(2020).
- Zeng, H., et al. Lentivirus-mediated downregulation of α-synuclein reduces neuroinflammation and promotes functional recovery in rats with spinal cord injury. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 283(2019).
- Bilgen, M., Al-Hafez, B., Berman, N. E., Festoff, B. W. Magnetic resonance imaging of mouse spinal cord. Magnetic Resonance in Medicine. 54 (5), 1226-1231 (2005).
- Yilihamu, E. E., et al. A novel mouse model of central cord syndrome. Neural Regeneration Research. 18 (12), 2751-2756 (2023).
- Chikuda, H., et al. Effect of early vs delayed surgical treatment on motor recovery in incomplete cervical spinal cord injury with preexisting cervical stenosis: A randomized clinical trial. JAMA Network Open. 4 (11), e2133604(2021).
- Jimenez, O., Marcillo, A., Levi, A. D. A histopathological analysis of the human cervical spinal cord in patients with acute traumatic central cord syndrome. Spinal Cord. 38 (9), 532-537 (2000).
- Menezes, K., et al. Human mesenchymal stromal/stem cells recruit resident pericytes and induce blood vessels maturation to repair experimental spinal cord injury in rats. Scientific Reports. 10 (1), 19604(2020).
- Hutson, T. H., Di Giovanni, S. The translational landscape in spinal cord injury: focus on neuroplasticity and regeneration. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 732-745 (2019).
- El-Bohy, A. A., Schrimsher, G. W., Reier, P. J., Goshgarian, H. G. Quantitative assessment of respiratory function following contusion injury of the cervical spinal cord. Experimental Neurology. 150 (1), 143-152 (1998).
- El-Bohy, A. A., Goshgarian, H. G. The use of single phrenic axon recordings to assess diaphragm recovery after cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 156 (1), 172-179 (1999).
- Gonzalez-Rothi, E. J., Lee, K. Z. Intermittent hypoxia and respiratory recovery in preclinical rodent models of incomplete cervical spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 113751(2021).
- Locke, K. C., Randelman, M. L., Hoh, D. J., Zholudeva, L. V., Lane, M. A. Respiratory plasticity following spinal cord injury: perspectives from mouse to man. Neural Regeneration Research. 17 (10), 2141-2148 (2022).
- Forgione, N., et al. Bilateral contusion-compression model of incomplete traumatic cervical spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 31 (21), 1776-1788 (2014).
重印与许可
