方法文章

芯片上辛醇辅助脂质体组装用于生物工程

DOI：

10.3791/65032

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2023年3月17日

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了辛醇辅助脂质体组装（OLA）技术，这是一种用于生成生物相容性脂质体的微流控方法。OLA 可制备出单一分散、微米尺寸的脂质体，并实现高效的包封，支持在芯片上立即开展实验。该方案预计特别适用于合成生物学与合成细胞研究。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

微流控技术是一种广泛使用的工具，可用于以可控且高通量的方式生成各种类型的液滴和囊泡。脂质体是由脂质双层包裹水性内核组成的简单细胞模拟物，在设计合成细胞以及理解生物细胞基本特性方面具有重要价值。 体外 时尚，并且在治疗应用的货物递送等应用科学领域具有重要意义。本文描述了一种片上微流控技术——辛醇辅助脂质体组装（OLA）的详细操作方案，用于制备单一分散、微米尺寸、生物相容的脂质体。OLA 的工作原理类似于吹泡泡：内水相（IA）与周围携带脂质的1-辛醇相被含有表面活性剂的外相流体剪切，从而形成双乳液液滴，并带有突出的辛醇小袋。当脂质双层在液滴界面自组装时，辛醇小袋会自发脱离，形成单层脂质体，可直接用于后续操作与实验。OLA 具有多项优势，例如稳定的脂质体生成（>10 Hz）、生物材料的高效包封、单一分散的脂质体群体，并且仅需极小的样品体积（约 50 µL），这在处理珍贵生物材料时尤为关键。本研究详细介绍了在实验室中建立 OLA 技术所需的微加工、软光刻和表面钝化技术。此外，还通过在脂质体内诱导生物分子凝聚体的形成，展示了该技术在合成生物学中的一项原理验证应用。 通过 跨膜质子流。预计本随附的视频方案将有助于读者在其实验室中建立并优化寡霉素敏感性ATP酶（OLA）实验。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有细胞都以质膜作为其物理边界，这种膜本质上是由两亲性脂质分子自组装形成的脂双层结构。脂质体是生物细胞的最小合成对应物，其内部含有被磷脂包围的水相腔室，磷脂排列成脂双层结构，亲水头部朝向水相，疏水尾部则向内埋藏。脂质体的稳定性由疏水效应、极性基团间的亲水作用、疏水碳链之间的范德华力以及水分子与亲水头部之间的氢键共同决定1,2。根据脂双层的数量，脂质体可分为两大类：单层囊泡（由单个双层构成）和多层囊泡（由多个双层构成）。单层囊泡还可根据其尺寸进一步分类。它们通常呈球形，可制备成多种尺寸，包括小单层囊泡（SUV，直径30–100 nm）、大单层囊泡（LUV，直径100–1,000 nm），以及巨单层囊泡（GUV，>1,000 nm直径）3,4。目前已开发出多种制备脂质体的技术， broadly可分为整体法5 和微流控技术6。常用的整体制备方法包括脂质膜再水化、电形成法、反相乳液转移法和挤出法7,8,9,10。这些方法相对简单且有效，因此在合成生物学领域被广泛使用。然而，它们同时也存在显著缺陷，如粒径分布不均、层状结构难以控制以及包封效率较低7,11。连续液滴界面交叉包封技术（cDICE）12 和液滴喷射与尺寸过滤技术（DSSF）13 在一定程度上克服了这些局限性。

在过去十年中，微流控技术逐渐受到重视。微流控技术利用层流和以扩散为主的质量传递特性，可在用户定义的微通道内对流体流动提供可控的环境。由此开发出的芯片实验室装置，能够以显著减少的样品体积和多重检测能力，实现对分子的时空精确控制14。目前已开发出多种用于制备脂质体的微流控方法，包括脉冲喷射15、双重乳液模板法16、瞬时膜喷射17、液滴乳液转移18和流体动力聚焦19。这些技术可高效、高通量地生成单分散、单层、细胞尺寸的脂质体，并具有高包封效率。

本文详细介绍了基于芯片的微流控八醇辅助脂质体组装（OLA）方法的操作流程，该方法依赖于流体动力学 pinch-off 效应及随后的溶剂去润湿机制20 （图1）。OLA 的工作原理可类比于吹泡泡的过程。六通交汇结构将内水相（IA）、两股携带脂质的有机相（LO）以及两股含表面活性剂的外水相（OA）聚焦于一点，形成水-（脂质+八醇）-水的双重乳液液滴。当这些液滴向下游流动时，界面能最小化、外部剪切流以及与通道壁的相互作用促使溶剂区域脱离，在界面处形成脂质双分子层，从而生成单层脂质体。去润湿过程所需时间取决于八醇区域的大小，通常为数十秒至数分钟。在出口通道末端，密度较低的八醇液滴上浮至表面，而因包封溶液密度较高而更重的脂质体则沉降至观察室底部，便于后续实验操作。作为代表性实验，本文展示了在脂质体内进行液-液相分离（LLPS）的过程：在酸性 pH 条件下将所需组分包封于脂质体内，该条件可抑制 LLPS 的发生；通过外部触发 pH 变化，进而引发跨膜质子通量，最终在脂质体内形成相分离的凝聚液滴。该结果凸显了 OLA 系统在有效包封与操控方面的优异能力。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 制备主晶圆

  1. 取一个直径为 4 英寸（10 cm）的洁净硅片（参见材料表），并使用加压空气进一步清洁，以去除任何灰尘颗粒。
  2. 将硅片固定在旋涂仪上，轻轻在硅片中心滴加约 5 mL 负性光刻胶（参见材料表）。尽量避免产生气泡，因为气泡可能干扰后续硅片的打印过程。
  3. 为获得厚度为 10 µm 的光刻胶层，先以 100 rpm/s 的加速度在 500 rpm 下旋涂 30 秒以实现初步铺展，随后以 500 rpm/s 的加速度在 3,000 rpm 下继续旋涂 60 秒。若需不同厚度，可根据制造商说明调整旋涂参数。
  4. 将硅片置于加热板上，先在 65 °C 下烘烤 2 分钟，再在 95 °C 下烘烤 5 分钟。
  5. 待硅片冷却后，将其安装至直写式光学光刻机的打印腔内（参见材料表），并将 OLA 设计文件（图 2A，补充编码文件 1）导入软件。
    注意：OLA 设计主要包含两个 OA 通道、两个 LO 通道和一个 IA 通道，这些通道汇合形成一个六通接头，延续为后处理通道，并最终通向实验孔（EW）。
  6. 使用紫外激光（参见材料表）在涂覆好的硅片上打印 OLA 设计，曝光剂量为 300 mJ/cm2。
  7. 设计打印完成后，在 65 °C 下烘烤 1 分钟，随后在 95 °C 下烘烤 3 分钟。
  8. 此时应确认打印器件的轮廓已出现在硅片表面，并且肉眼可见。为洗去未固化的光刻胶，将硅片浸入盛有显影液的玻璃烧杯中（参见材料表），直至未固化的光刻胶完全去除。
    注意：过度显影处理可能影响设计分辨率。
  9. 依次用丙酮、异丙醇和去离子（DI）水清洗硅片，最后使用吹气枪以加压空气/N2 吹干。
  10. 在 150 °C 下对硅片进行坚膜烘烤 30 分钟，以确保打印图案牢固附着于硅片表面，在后续加工过程中不会脱落。至此，母版硅片已准备就绪，可供进一步使用（图 2B）。

2. 准备微流控装置

  1. 将母版晶圆放置在一块方形铝箔上，用铝箔包裹晶圆，形成一个类似井状的结构（图2C）。
  2. 在50 mL离心管中称取40 g聚二甲基硅氧烷（PDMS）和4 g固化剂（10:1，质量比，参见材料表），使用刮刀或移液器吸头剧烈搅拌2-3分钟。
  3. 剧烈混合PDMS与固化剂会导致混合物中混入气泡。将离心管以100 × g离心2-3分钟，以去除大部分较大的气泡。
  4. 将步骤2.3中配制的混合物约15-20 g倾倒至母版晶圆上，并使用真空干燥器脱气。剩余的混合物保留备用，用于制备PDMS包被的玻片（步骤3）。
  5. 将组装好的样品置于70 °C烘箱中孵育至少2小时。
  6. 从烘箱中取出母版晶圆并使其冷却。为取下固化的PDMS块，先移除铝箔，然后小心地从晶圆边缘剥离PDMS块。
    注意：晶圆较为脆弱，可能破裂，因此此操作需格外小心。
  7. PDMS块脱模后，保持其图案面朝上，使用锋利刀片或解剖刀切割出单个PDMS块，每个块包含一个独立的微流控装置。
  8. 将PDMS块放置于深色表面上，调整光源方向（台灯在此步骤中非常实用），使刻蚀的通道呈现光泽从而清晰可见。使用直径为0.5 mm和3 mm的活检打孔器分别在入口和出口通道处打孔（参见材料表）。
    注意：应使用锋利的活检打孔器，以避免PDMS产生裂纹，否则可能导致后续泄漏。轻轻将打孔器穿过PDMS块，并确保其完全穿透。取出打孔器时，应边缓慢回撤边交替旋转方向。至此，带有刻蚀OLA结构的PDMS块已准备好与PDMS包被的玻片进行键合。

3. 制备PDMS包被的玻片

  1. 取一片透明玻璃盖玻片，将约 0.5 mL 的 PDMS（在步骤 2.4 中已过量制备）倒入载玻片中心，然后轻轻倾斜载玻片，使 PDMS 均匀铺展至整个盖玻片表面，确保载玻片完全被 PDMS 覆盖。
  2. 将载玻片安装在旋涂仪上，确保其居中放置（使载玻片中心与压力轴中心重合），先以 100 rpm/s 的加速度升至 500 rpm 并旋转 15 秒，随后以 500 rpm/s 的加速度升至 1,000 rpm 并旋转 30 秒。
  3. 将涂有 PDMS 的载玻片（涂层面向上）放置于培养皿内一个抬高的平台（如一块 1 cm × 1 cm 的 PDMS 块）上，盖上培养皿盖，于 70 °C 下烘烤 2 小时。

4. 微流控装置的键合

  1. 用市售透明胶带（见材料表）对PDMS块（步骤2中制备）粘贴并撕除两次以进行清洁。确保清洁面朝上放置，直至使用。
  2. 使用吹尘枪以加压空气/N2 清洁涂有PDMS的载玻片，并保持清洁面朝上。
  3. 将PDMS块（微通道面朝上）和涂有PDMS的载玻片（涂层面朝上）放入等离子清洗机的真空腔室中（见材料表）。
  4. 开启真空，以12 MHz射频（RF模式调至高）进行15秒的空气等离子体处理，以活化表面。氧等离子体呈现淡粉色辉光。
  5. 等离子处理后立即取出，将涂有PDMS的载玻片置于洁净表面上，PDMS面朝上。轻柔地将PDMS块的微流控图案面朝下贴合至PDMS涂层载玻片上，使其键合（图2D）。
    注意：必须排除器件中夹带的空气，以确保完全键合。
  6. 将键合好的器件在70 °C下烘烤2小时。

5. 微流控装置的表面功能化

注意：在进行表面功能化之前，必须根据制造商的方案（参见材料表）校准压力泵，并组装管路以将其连接至微流控装置。

  1. 将微流控装置连接至压力泵
    1. 将压力驱动流控器连接至外部气压源（最高可达 6 bar）。至少需要四个独立的空气压力通道：三个 0–2 bar 的独立模块，以及一个 −0.9–4 bar 的模块。
    2. 根据制造商的协议校准压力泵（参见 材料表）。
    3. 将管路（外径 1/16 英寸，内径 0.02 英寸）切成四段等长的部分，每段长约 20 cm。
    4. 在每段管路的一端插入 23 G 不锈钢 90° 弯接头（参见 材料表）。该端随后插入微流控装置的三个入口（OA、LO 和 IA），第四个接头用于去除多余溶液（步骤 5.2.5）。
    5. 将管路的另一端插入微流控储液槽支架，并使用微流控接头密封，确保管路足够长以触及储液槽底部（1.5 mL 管，参见 材料表）。这可防止在 PVA 处理/脂质体生成过程中有不希望的气泡进入微流控装置。
  2. PVA 对出口通道的处理
    注意：在生成脂质体之前，必须使装置在生成结点下游的部分区域具有一定的亲水性。这可通过使用 5% (w/v) 聚乙烯醇（PVA）溶液处理这些通道来实现。PVA 溶液的制备方法是将 PVA 粉末（参见 材料表）在 80 °C 下溶于水中，持续磁力搅拌 3 小时。使用前需过滤该溶液。装置键合后，由于等离子体诱导的表面活化作用，微流控通道初始呈亲水性，但会逐渐恢复疏水性。建议在烘烤（步骤 4.6）后等待 2 小时再开始 PVA 处理。
    1. 取 200 µL 的 5% w/v PVA 溶液加入 1.5 mL 离心管中，并将其连接至微流控储液槽支架。插入管路（即步骤 5.1.3 中提到的管路），使一端浸入 PVA 溶液中，另一端连接至微流控装置 OA 通道的入口。
      注意：PVA 浓度过低可能导致表面功能化效果不佳。
    2. 重复上述步骤，但不使用 PVA 溶液（使用空的 1.5 mL 管），并将其连接至 LO 和 IA 通道。
    3. 将 OA 相的压力提高至 100 mbar，使 PVA 溶液在 OA 通道中流动。将 IA 和 LO 相的压力提高至 120 mbar，以防止 PVA 溶液倒流进入这些通道（图 2E）。
      注意：如有需要，可调节各通道的压力，以保持生成结点处弯月面稳定。
    4. 以这种方式使 PVA 溶液流动约 5 分钟，确保出口通道完全功能化。
    5. 为去除 PVA 溶液，先将管路从 OA 入口断开，立即提高 LO 和 IA 通道的压力至 2 bar。同时，使用连接至负压通道（−900 mbar）的管路，先从出口通道、再从 OA 入口去除多余的 PVA 溶液（图 2F）。
    6. 将装置在 120 °C 下烘烤 15 分钟，冷却后即可使用。该装置可在常温环境下储存至少 1 个月。
      注意：建议在进行 OLA 操作前于室温下静置 1 天，以确保未经处理的 PDMS 在等离子体处理后恢复其疏水性。

6. 辛醇辅助脂质体组装（OLA）

  1. 准备脂质储备液
    注意：此处以1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明B磺酰基)（Liss Rhod PE）脂质混合物为例（参见材料表）；用户应以类似方式配制所需组成的脂质。
    1. 使用不同的玻璃注射器，将76 µL DOPC（25 mg/mL）和16.6 µL Liss Rhod PE（1 mg/mL）加入圆底烧瓶中。
    2. 保持圆底烧瓶直立，使用压缩N2 吹扫枪向瓶内通入温和的氮气流，以蒸发氯仿并在瓶底形成干燥的脂质膜。
    3. 将烧瓶置于真空干燥器中，在持续真空条件下至少放置2小时，以去除残留的氯仿。
    4. 向圆底烧瓶中加入100 µL乙醇，随后轻轻吹打或振荡，确保脂质完全溶解，形成10%（w/v）的脂质储备液。
      注意：若某种特定脂质组成在乙醇中不能完全溶解，可使用乙醇/氯仿混合溶剂，但应尽可能减少氯仿的体积。
    5. 将溶液转移至避光玻璃小瓶中。使用吹扫枪向瓶内通入氮气，置换空气以形成惰性气氛。用石蜡膜密封瓶盖，并在−20 °C下保存。
      注意：该储备液可使用数月。每次打开小瓶时，应轻柔地用氮气置换空气，并重新用石蜡膜密封瓶盖。
  2. 准备OLA溶液
    1. 配制必需组分的储备液：20 mM葡聚糖（分子量6,000）；60%（v/v）甘油；以及任选缓冲液。本实验中配制了5倍浓度的磷酸盐缓冲液（0.68 M NaCl，13.5 mM KCl，50 mM Na2HPO4，9 mM KH2PO4；pH 7.4）（参见材料表）。
      注意：由于纯甘油黏度较高，建议将移液枪头末端斜向剪去一小段，以便有效移取。
    2. 分别准备100 µL的内相（IA）、脂质-油相（LO）和出口溶液（ES，即用于填充收集腔的所需溶液）。为便于观察，本实验在IA溶液中添加了黄色荧光蛋白（YFP）。通过计算包封组分的渗透压，并在必要时向OA中加入适量糖或盐，检查IA与OA之间的渗透平衡。此步骤旨在防止脂质体在制备过程中破裂或收缩。
      注意：三相的最终组成为：
      IA：15%甘油，5 mM葡聚糖（分子量6,000），5.4 µM YFP，1倍PBS
      OA：15%甘油，5% F68表面活性剂，1倍PBS
      ​ES：15%甘油，1倍PBS
      F68表面活性剂浓度过低会负面影响双乳液的生成。
    3. 通过将4 µL脂质储备液加入76 µL 1-辛醇中（参见材料表），用移液枪配制80 µL的LO相。DOPC的终浓度为5 mg/mL。
    4. 在进行微流控实验前，将样品以700 x g离心60秒，以去除任何大尺寸聚集体。此举可防止明显的堵塞物进入微流控芯片。
  3. 脂质体制备
    1. 将溶液（IA、LO、OA）分别加入三个1.5 mL离心管中，按步骤5.1所述组装，并连接至经PVA处理的微流控芯片（步骤5.2.6）。
    2. 对三个通道施加正压：IA和LO通道约为100 mbar，OA通道约为200 mbar。
      注意：由于OA压力高于其他两相，OA溶液将最先到达收集腔（EW）；此顺序强烈推荐。
    3. 当OA溶液到达EW后，将OA压力降至100 mbar，同时将LO压力升至200 mbar。  LO溶液到达生成结点时，可能因LO通道中的空气被排出而产生气泡。待气泡排入EW后，将LO压力调节至100 mbar。最后，将IA压力升至200 mbar，并等待IA通道中的所有空气被完全排出。因此，三相到达结点的理想顺序为OA、LO、IA。
    4. 在三通道空气完全排出后，将所有通道压力调整为50 mbar，并向出口腔中加入10 µL ES。加样后，在出口孔上覆盖盖玻片以防止蒸发。若LO发生回流，可逐步以1 mbar为增量缓慢提高LO压力，直至其重新流向结点。
    5. 当三相在结点处开始共流时，确认双乳液生成已启动，并根据其质量进行调节（图3A-C）。应逐步调节压力（每次0.1–1 mbar），避免突变，除非需要改变压力以清除通道中的异常堵塞。
      注意：需调节的通道取决于结点处的具体情况。例如，若乳滴过大，则需降低IA压力；若双乳液形成但未断裂而是破裂，则需提高OA压力；若辛醇液滴过大，则需降低LO压力。
    6. 检查双乳液液滴是否顺利向下游流动至EW。随着流动，辛醇区域逐渐明显，最终断裂形成脂质体（图3D-F）。确保产后期通道足够长，且双乳液迁移速度足够慢，以完成去润湿过程。
      注意：在稳定生成开始数分钟后，脂质体和辛醇液滴将离开产后期通道并进入EW。由于辛醇密度低于水，辛醇液滴将上浮至ES表面。而由于IA中添加了葡聚糖，脂质体密度高于周围环境，将沉降至腔室底部，便于后续观察和操作。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究展示了无膜凝聚体的形成 通过 以脂质体中液-液相分离（LLPS）的过程作为代表性实验。

样品制备
IA、OA、ES 和进料溶液（FS）的制备方法如下：

IA：12% 甘油，5 mM 葡聚糖，150 mM KCl，5 mg/mL 多聚-L-赖氨酸（PLL），0.05 mg/mL FITC 标记的多聚-L-赖氨酸（PLL-FITC），8 mM 三磷酸腺苷（ATP），15 mM 柠檬酸-HCl（pH 4）

OA：12% v/v 甘油，5% w/v F68，150 mM KCl，15 mM 柠檬酸-HCl（pH 4）

ES：12% 甘油，150 mM KCl，15 mM 柠檬酸-HCl（pH 4）

FS：12% 甘油，150 mM KCl，75 mM Tris-HCl（pH 9）

脂质体内部凝聚相的形成
一种简单的pH敏感性复合共凝聚实验被用于演示脂质体中液-液相分离（LLPS）现象，该实验基于带正电的聚-L-赖氨酸（PLL）与带负电的多价三磷酸腺苷（ATP）之间的相互作用。为防止PLL与ATP在包封过程中发生相分离，溶液pH维持在4，在此条件下ATP呈电中性。通过加入FS（pH为9的缓冲液）提高外部溶液（ES）的pH，质子跨膜流动最终导致脂质体内部pH升高，使ATP带负电，进而触发其与带正电的PLL发生相分离。21 (图4A。在生成脂质体约2小时后，关闭IA和LO的压力。保持OA通道压力为100 mbar，以缓慢将剩余脂质体流入观察室。当通道内所有脂质体均被回收至EW后，关闭压力以停止流动并防止脂质体继续移动。在较低pH条件下生成的脂质体在其腔内显示出均匀的荧光（来自包封的荧光标记PLL-FITC）图4B,D）。通过小心地从顶部吸出5 µL溶液，去除漂浮在表面的辛醇液滴，以防止其影响后续的移液操作。随后，向乳浊液（EW）中加入10 µL FS缓冲液，诱导包封的PLL和ATP发生相分离。每个脂质体中原本均匀分布的FITC荧光逐渐转变为明显的荧光凝聚液滴。最终，这些独立的液滴融合成一个更大的凝聚液滴，并在脂质体内自由扩散（图4C,E-G).

双乳液装置示意图，包含压力泵、脂质体形成及辛醇液滴分离过程。
图 1：OLA 装置组装与工作原理示意图。 压力控制器连接至分别盛有外水相、含脂质的辛醇溶液和内水相的储液池。插入储液池的管路分别连接至 OLA 装置对应的入口。通过调节三个通道中的适当流速，形成水-（含脂质辛醇）-水的双乳液液滴。生成的双乳液液滴迁移至出口孔，过程中辛醇液滴脱离，形成脂质体。所形成的脂质体收集于孔底部，用于观察及后续实验。 请点击此处查看该图的放大版本。

光刻与器件制备流程；微流控器件表面处理示意图。
图 2：OLA 芯片的制备（光刻、微加工、表面处理）。（A）数字设计图，展示 OLA 芯片的关键结构特征，包括三个进样口、一个出样口以及一个六通反应交汇区。（B）主模板晶圆的示意图，显示通过紫外光刻技术制备的多个 OLA 设计结构。（C）将 PDMS 弹性体浇铸在主模板晶圆上，置于铝箔制成的培养孔中，并在 70 °C 下烘烤 2 小时以固化。（D）通过氧等离子体处理将 PDMS 块键合到经 PDMS 涂覆的玻璃载片上，形成微流控器件。（E）对制备好的芯片进行表面功能化处理，使器件部分区域具有亲水性。该步骤通过从外侧水相通道向出口通道注入 5% w/v 的聚乙烯醇（PVA）溶液 5 分钟完成；其他通道施加正压空气，防止 PVA 溶液进入这些通道。（F）通过在出口通道施加真空去除 PVA 溶液。器件在 120 °C 下烘烤 15 分钟后即可使用。请点击此处查看该图的放大版本。

微流控液滴形成；显微镜图像；脂质通道 Rh-PE；蛋白质包封 YFP。
图3：OLA高效生成单分散双乳液并最终形成具有优异包封率的脂质体的演示。 （A）明场图像显示双乳液液滴的快速生成。（B）荧光脂质通道显示由于部分去润湿而形成的辛醇相口袋。辛醇-脂质相包含DOPC（5 mg/mL）和Lis Rhod PE，比例为1,000:1。（C）内层水相显示黄色荧光蛋白（YFP）的包封。（A-C）中的插图展示了各图板的代表性放大视图（比例尺 = 10 µm）。（D-F）出口通道中辛醇相口袋的去润湿过程，最终形成脂质体。请点击此处查看该图的放大版本。

多聚赖氨酸/ATP的包封、pH触发的凝聚、显微镜图像、强度图。
图 4：脂质体内部pLL/ATP的pH触发液-液相分离。 （A）脂质体内包封的pLL与ATP均相溶液（左侧）向相分离的pLL/ATP凝聚体（右侧）转变的pH依赖性示意图。脂质体内部初始的酸性环境使ATP分子电荷呈中性，从而抑制凝聚作用的发生。当脂质体内部pH随外部施加的pH升高而达到平衡时，ATP获得负电荷，从而触发凝聚。 （B-C）线图（分别对应于图中[D]和[G]的虚线位置），显示pLL（绿色通道）和膜（红色通道）的空间分布。 （D-G）时间推移图像，展示脂质体内pLL/ATP凝聚体的形成过程。外部加入碱性缓冲液后，脂质体内部pH在数分钟内逐渐升高，并启动凝聚过程。t = 0 min表示首次发生凝聚事件前的时刻。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充编码文件1：OLA设计的CAD文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

细胞的复杂性使得在整体水平上研究活细胞时极难理解其行为。通过在体外重建关键组分，降低细胞的冗余性和相互关联性，对于深入理解生物系统以及为生物技术应用构建人工细胞模拟物至关重要22,23,24。脂质体是研究细胞现象的优良简约体系。这些现象包括但不限于：细胞骨架动力学及其引发的膜形变25,26、生物分子凝聚体的时空调控27,28 及其与膜的相互作用29、多种生物分子的包封，包括无细胞转录-翻译系统30、无细胞脂质合成31以及蛋白质的进化32,33,34。脂质体还被广泛用作药物递送载体，并已获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准用于临床11。脂质体和基于脂质的纳米颗粒被用作药物递送载体，包括近期新冠疫苗中的mRNA疫苗35。

本研究详细描述了一种结合光刻、微流控组装和表面功能化的协议，用于在芯片上执行OLA技术以生成脂质体图1 和 图3）。使用OLA制备的脂质体呈单一分散性（变异系数：平均值的4%–11%），粒径处于生物细胞尺寸范围（通常直径为5–50 µm），并通过调节内相和外相水相通道的适当流速实现调控36例如，所观察到的脂质体群体在 图1 粒径分布为 23.3 µm ± 1.8 µm（n = 50）。在10-30 Hz的典型生成频率下，所形成的脂质体为单层结构，此前通过插入单个仅特异性结合双层膜的跨膜蛋白——α-溶血素，已证实了这一点。36，进入膜中，以及使用连二亚硫酸盐漂白实验37OLA 还兼容多种脂质组成，为用户选择脂质提供了灵活性。重要的是，初始使用的脂质组成会直接反映在最终的脂质体组成中38.

作为一种相对较新的技术，OLA 仍有进一步改进的空间。例如，使用聚乙烯醇（PVA）进行表面功能化至关重要，但操作繁琐。若能采用更简便的方法对器件表面进行功能化处理，将显著缩短芯片制备时间，并降低芯片间的差异性。Pluronic F68 表面活性剂是外水相中的重要组分，用于初步稳定双乳液；然而，其应用在某些情况下可能受到限制。用生物相容性更高的表面活性剂替代 Pluronic F68，或完全去除表面活性剂，可能提升系统的通用性。在生成的双乳液经出口通道迁移过程中，可能因剪切力而破裂。因此，优化 OLA 设计以增强双乳液的稳定性并改善辛醇液滴的分离效果，有望提高通量。尽管如此，OLA 仍具有多项优势，主要包括高效的包封能力、单一分散且为单层脂质体的生成，以及可控的芯片上实验操作。

OLA 已被应用于并适应于多种研究，包括脂质体的生长与分裂39、液-液相分离过程27 及其与膜相互作用的研究21，以及理解脂质体中细菌生长与生物产物的形成40。基于 OLA 的高通量检测也被用于研究离子跨膜运输41 和药物在脂质双分子层中的渗透性37，作为治疗用途的药物递送系统42，研究抗菌剂对膜的影响43，以及作为封装液晶的工具44。除了 OLA 技术广泛的应用范围外，针对特定用途的 OLA 改进版本也正在被开发45,46,47,48,49,50。总体而言，在综合考虑其优缺点后，我们坚信 OLA 是一个适用于合成生物学的多功能平台。

披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢 Dolf Weijers、Vera Gorelova 和 Mark Roosjen 慷慨提供 YFP。S.D. 感谢荷兰研究理事会提供的经费支持（资助编号：OCENW.KLEIN.465）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-辛醇Sigma-AldrichNo. 297887
1.5 mL 离心管Fisher Scientific10451043Eppendorf 3810X 聚丙烯微量离心管
ATPSigma-AldrichNo. A2383
活检打孔器Darwin 微流控公司PT-T983-05直径 0.5 mm 和 3 mm
柠檬酸盐缓冲液Sigma-AldrichNo. 71405
葡聚糖Sigma-AldrichNo. 31388分子量 ~6,000
直写式光刻机Durham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Baby设备及软件
DOPC 脂质AvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
玻璃盖玻片Corning#1, 24 × 40 mm
甘油Sigma-AldrichNo. G2025
盐酸Thermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE 脂质AvantiSKU:810150C
封口膜（Parafilm）Sigma-AldrichNo. P7793
光刻胶Micro resist technology GmbHEpoCore 10
光刻胶显影液micro resist technology GmbHmr-Dev 600
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-32G
聚二甲基硅氧烷DowSylgard 184PDMS 及固化剂
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichNo. P7890
聚-L-赖氨酸–FITC 标记Sigma-AldrichNo. P3543
聚乙烯醇Sigma-Aldrichno. P8136分子量 30,000–70,000，87%–90% 水解
压力控制器Elveflow OBK1 Mk3+流量控制器
透明胶带Magic Tape Invisible Matt Tape
硅晶圆Silicon Materials0620R16002
匀胶机 Laurell Technologies CorporationModel WS-650MZ-23NPP
不锈钢 90° 弯曲 PDMS 连接器Darwin 微流控公司PN-BEN-23G
Tris 缓冲液Sigma-AldrichNo. 252859
Tygon 管Darwin 微流控公司1/16" 外径 × 0.02" 内径
紫外激光器 波长 365 nm

参考文献

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