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动物护理和实验是根据印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行的。
1. 实验开始前的准备工作
- 组织制备
- 对于脂肪细胞核标记，将NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-Cre）杂交以产生Adipoq-NuTRAP小鼠，其对Adipoq-Cre和NuTRAP都是半合的。
- 如前所述，从Adipoq-NuTRAP小鼠中解剖感兴趣的脂肪组织14。
- 将组织快速冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C直至使用。
注意:每个脂肪垫可以作为一个整体储存，冷冻的组织可以在干冰上切成更小的块（~50毫克）进行实验。或者，可以将脂肪组织切割，等分并冷冻在管中储存（每管~50mg）。冷冻样品在使用前冷冻后绝不允许解冻。
- 缓冲液制备
注意:在整个实验过程中将缓冲液保持在冰上。- 制备细胞核制备缓冲液 （NPB）:250 mM 蔗糖、10 mM HEPES （pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2 和 0.1% NP40。每个样品制备 7 mL NPB。使用前向NPB中加入新鲜的100x蛋白酶抑制剂混合物（最终1x），DTT（最终1 mM）和Hoechst（最终1μg/mL）。
注意:建议准备新鲜的NPB，但可以在4°C下储存长达1个月。
- 用0.1%NP-40（PBS-N）制备1x磷酸盐缓冲盐水。
2. 细胞核分离
- 冷却玻璃 Dounce 均质机，每个样品一个玻璃 Dounce，在冰上。然后，向每杯 Dounce 中加入 7 mL 的 NPB 混合物。
注意:建议在每个实验中使用最多八个样品。处理超过八个样品会显着延迟所有步骤，并且可能会在分选过程中特别降低细胞核质量。
- 将冷冻的脂肪组织（50-100毫克）放入玻璃杯中Dounce，立即用一把长剪刀将其切成几小块。用松散的杵对所有样品进行10倍的描边，然后用紧密的杵描边10倍。
注意:脂肪纸巾很软，所以把它们切成几小块就足够了。对于稀有样品，可以使用较小的碎片（10-20毫克），尽管收集的脂肪细胞核数量可能会有所不同。
- 通过 100 μm 过滤器过滤到新的 50 mL 管中。倒入将过滤后的匀浆移至新的 15 mL 管中。在4°C下在4°C下以200× g 旋转10分钟。尽可能去除上清液。
注意:首先使用真空吸出，然后使用微量移液器去除剩余体积。
- 通过轻柔但彻底的手指敲击将沉淀重悬于 500 μL PBS-N 中。
注意:避免移液，因为这可能会损坏细胞核。
- 通过 40 μm 过滤器过滤到新的 50 mL 管中，轻轻移液。用 250 μL PBS-N 冲洗过滤器。使用微量移液器将过滤后的核重悬转移到荧光激活细胞分选（FACS）管中。
注意:如果可用，试管和细胞过滤器可用于较小的体积，以最大限度地减少样品损失。
3. 细胞核分选
- 收集管准备
- 将 500 μL PBS-N 加入新的 1.5 mL 管中，倒置几次以用缓冲液润湿所有内表面。
- 短暂旋转试管以降低所有液体，然后将它们放在冰上冷却直至分类。
- FACS （图2）
- 使用 FSC-A/FSC-H 门控清除单线，使用 FSC-A/SSC-A 清除小碎片或大碎片。
- mCherry/GFP 阳性脂肪细胞核群的门。
- 在步骤3.1制备的每个收集管中收集10，000个细胞核。
- 后分选细胞核制备
- 向每个收集管中加入 500 μL PBS-N，并倒置几次以混合。
- 在4°C下在4°C下旋转收集管200×g旋转10分钟。完全除去上清液。
注意:首先使用真空去除气泡，倒出上清液，然后使用纸巾完全去除剩余的液体。此时颗粒是不可见的。在离心步骤中制备Tn5主混合物，如下所述。
4. Tn5标记（表1）
- 要制备 25 μL Tn5 主混合物，请混合 12.5 μL 2x 标记 DNA 缓冲液（TD 缓冲液）、1.25 μL Tn5 转座酶（TDE I 酶）和 11.25 μL 无核酸酶水。
- 向每个细胞核沉淀中加入 25 μL Tn5 主混合物，并通过轻轻移液重悬。使用热混合器在37°C下以600rpm孵育30分钟。
5. 脱氧核糖核酸纯化
注意:以下程序使用 材料表中提到的PCR纯化试剂盒。可以使用任何其他类似的DNA纯化方法。
- 将 25 μL 无核酸酶水加入步骤 4.2 之后获得的 25 μL Tn5 核重悬混合物中。每个样品的最终体积为 50 μL。
- 加入 250 μL 缓冲液 PB。
- 加入 5 μL 3 M 乙酸钠 （NaOAc） （pH 5.2）。
- 将混合物转移到色谱柱（随参考试剂盒一起提供）中，并在室温（RT）下以17，900 × g 离心1分钟。
- 丢弃流通管，并将离心柱放回同一收集管中。加入 750 μL 含有无水乙醇 （EtOH） 的缓冲液 PE，并在室温下以 17，900 × g 离心 1 分钟。
- 丢弃流通液，并将离心柱放回同一收集管中。在室温下以17，900× g 离心1分钟，并丢弃带有流通物的收集管。
- 要洗脱 DNA 片段，请为色谱柱配备新的 1.5 mL 管，加入 10 μL 缓冲液 EB，并在室温下放置 3 分钟。在室温下以 17，900 × g 离心 1 分钟。
注意:样品可以在4°C下储存数天或在-20°C下储存数周。
6. PCR扩增（表2）
注意:本研究中使用的引物列于 表3中。
- 要扩增转置的DNA片段，请制备PCR主混合物，而无需添加独特的Ad2.n条形码引物（引物#2）。每个样品使用 38 μL PCR 预混液:11 μL 无核酸酶水、2 μL 25 μM Ad1_noMX引物（引物 #1）和 25 μL 2x PCR 预混液。
- 将 38 μL PCR 主混合物加入 0.2 mL PCR 管中。
- 加入步骤 5.7 中 10 μL 洗脱的 DNA 片段。
- 加入 2 μL 25 μM 引物 #2，该引物需要针对每个样品。
- 根据 表2所示的循环条件运行PCR。
7. 实时定量PCR（qPCR）测试（表4）
注意:此步骤旨在确定扩增DNA所需的额外循环。它是可选的，但强烈建议使用，尤其是对于新实验。
- 在不添加引物#2的情况下制备qPCR主混合物。每个样品使用 9.975 μL qPCR 主混合物:4.41 μL 无核酸酶水、0.25 μL 25 μM 引物 #1、5 μL 2x PCR 预混液和 0.09 μL 100x SYBR Green I。
注意:要制备 100x SYBR Green I，请用无核酸酶水稀释 10，000x 原液。由于用于qPCR主混合物的100x SYBR Green I的体积可以忽略不计，因此更容易制作稀释的100x SYBR Green I的额外主混合物（例如，用于8-10个样品）。
- 将 9.975 μL qPCR 主混合物添加到 qPCR 板的每个孔中。
- 向每个孔中加入 0.25 μL 25 μM 引物 #2。
注意:请务必添加相同的引物#2，以匹配步骤6.4中添加到每个特定样品的内容。
- 加入步骤6.5中PCR扩增后获得的PCR反应5 μL，并通过移液混合。
注意:剩余的 45 μL PCR 反应将用于第二次 PCR 扩增。
- 根据 表5中所示的循环条件运行qPCR。
- 检查扩增曲线，并通过估计达到最大值~35%的循环次数来确定所需的额外PCR循环次数（图3A）。
注意:通常，10，000个细胞核需要五到八个额外的PCR循环。
8. 额外的 PCR 扩增
- 根据步骤7.6（表6）中的计算，使用剩余的45 μLPCR反应的所有PCR运行PCR。
注意:每个样品可能需要不同数量的扩增周期。
9. 使用PCR纯化试剂盒进行第二次DNA纯化
- 使用与第 5 节相同的程序，但用 20 μL 缓冲液 EB 洗脱扩增的 DNA 片段。
10. DNA片段大小选择
注意:使用固相可逆固定珠，如下所述。任何其他类似的DNA纯化微球都可以根据制造商的说明使用。SPRI珠悬浮液在使用前应完全重悬并在室温下旋转平衡。
- 将洗脱的DNA转移到新的PCR管中，并加入80 μL缓冲液EB，使最终体积为100 μL。
- 加入 55 μL SPRI 磁珠（0.55 倍样品体积），并通过移液混合。在室温下孵育5分钟，然后在用于PCR 8管条的迷你磁性支架上分离5分钟。
- 将 150 μL 上清液转移到新的 PCR 管中。加入 95 μL SPRI 磁珠，并通过移液混合。
注意:上清液含有大约500 bp或更小的DNA。
- 在室温下孵育5分钟，然后在迷你磁性支架上分离5分钟。小心丢弃上清液。
- 用 200 μL 70% EtOH 洗涤珠子 1 分钟。重复两次，总共洗涤三次。
注意:在洗涤过程中，请勿将PCR管从磁性支架上移开。
- 最后一次洗涤后，以 1，000 × g 离心管 1 分钟，然后移出剩余的 EtOH。在PCR仪上将盖子在37°C下打开2分钟，干燥沉淀。
注意:珠子颗粒干燥后应仅显示一些轻微的裂缝。避免过度干燥。
- 通过移液将沉淀与 20 μL 缓冲液 EB 重悬，并在室温下孵育 5 分钟。 在迷你磁性支架上分离 5 分钟，然后将含有最终文库的 18 μL 上清液转移到新的 1.5 mL 管中。
注意 在执行质量检查时，库可以存储在-20°C。
11. 使用荧光计进行DNA定量
- 要制备主混合物，请将 200x dsDNA 高灵敏度 （HS） 试剂与 dsDNA HS 缓冲液稀释至终浓度为 1x。
- 对于标准品，向荧光计管中加入 190 μL 1x 主混合物和 10 μL 标准品 1 或标准品 2。
注意:在开始定量之前，在黑暗中在室温下平衡标准品。
- 对于文库样品，将 198 μL 的 1x 主混合物和 2 μL 的每个样品添加到单独的荧光计管中。
注意:如果样品量有限，样品体积可以减少到 1 μL，1x 主混合物体积可以增加到 199 μL。
- 涡旋或摇动荧光计管，让它们在黑暗中在室温下静置5分钟。使用荧光计的dsDNA HS测定法测量DNA浓度。
12. 通过高灵敏度电泳系统进行文库质量检查
- 取ATAC-seq文库，用无核酸酶水稀释至终浓度为1-5ng/μL。
- 按照制造商的实验方案，使用高灵敏度的自动电泳系统分析 ATAC-seq 文库的大小分布。
13. 使用靶向qPCR对ATAC-seq文库进行质量检查
- 取 5-10 ng 的 ATAC-seq 文库，并用 50 μL 无核酸酶水稀释。
- 根据 表7所示的循环条件，使用靶向已知在脂肪细胞中具有活性的启动子和增强子的引物运行qPCR。
- 使用靶向封闭/沉默基因组区域的阴性对照引物（表7）。
- 计算启动子/增强子对阴性对照的富集（表8）。
注意:预计成功样品的富集量将增加≥10-20倍。
14. 排序
- 提交 ATAC-seq 文库进行测序。使用配对末端测序（2 x 34 bp、2 x 50 bp 或更长），每个样本的平均读取数为 10-3000 万次读取。