使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

摘要

我们介绍一种针对脂肪细胞的高通量测序转座酶可及染色质分析（ATAC-seq）方案，该方法专门利用携带核荧光标记的转基因报告小鼠分离的脂肪组织，通过细胞核分选实现。

摘要

利用高通量测序检测转座酶可及性染色质（ATAC-seq）是一种强大的技术，可实现全基因组范围的染色质可及性分析。该技术在理解多种生物过程中基因表达调控机制方面具有重要价值。尽管ATAC-seq已针对多种样本类型进行了优化，但目前尚无针对脂肪组织的有效ATAC-seq方法改良方案。脂肪组织面临的挑战包括复杂的细胞异质性、高脂含量以及严重的线粒体污染。为克服这些问题，我们开发了一种通过荧光激活细胞核分选技术，结合转基因报告小鼠——核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）模型中的脂肪组织，实现脂肪细胞特异性ATAC-seq的实验方案。该方案能够在减少细胞核投入量和试剂用量的同时，获得高质量数据，并显著降低测序读段的浪费。本文提供了经验证的、适用于从小鼠脂肪组织中分离的脂肪细胞核进行ATAC-seq的详细分步操作指南。该方案将有助于研究多种生物学刺激下脂肪细胞中染色质动态变化，从而推动新的生物学发现。

引言

脂肪组织是一种特化用于以脂质分子形式储存多余能量的关键器官，在代谢调控中发挥重要作用。严格调控脂肪细胞的形成与维持，对脂肪组织功能及全身能量稳态至关重要¹许多转录调控因子在脂肪细胞分化、可塑性和功能调控中发挥关键作用；其中一些调控因子与人类代谢紊乱相关^2,3高通量测序技术在基因表达和表观基因组分析方面的最新进展，进一步推动了脂肪细胞生物学分子调控因子的发现⁴利用脂肪组织进行分子谱型研究由于该组织的异质性而面临挑战。脂肪组织主要由负责脂肪储存的脂肪细胞构成，但也包含多种其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。⁵此外，脂肪组织的细胞组成会因温度和营养状态等病理生理变化而发生显著改变⁶为解决这些问题，我们先前开发了一种名为核标记与翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）的转基因报告小鼠，该小鼠可在Cre重组酶依赖的方式下表达GFP标记的核糖体和mCherry标记的生物素化细胞核⁷双标记系统能够实现对组织中特定细胞类型的转录组和表观基因组分析。通过将NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性的脂联素-Cre品系（Adipoq-NuTRAP）杂交，我们先前已对纯化的脂肪细胞群体的基因表达谱和染色质....

方案

动物饲养和实验操作均按照印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行。

1. 实验开始前的准备工作

1. 组织准备
   1. 为了标记脂肪细胞的细胞核，将 NuTRAP 小鼠与脂肪细胞特异性的脂联素-Cre 小鼠品系（Adipoq-Cre）杂交，以生成 Adipoq-NuTRAP 小鼠，该小鼠对 Adipoq-Cre 和 NuTRAP 均呈半合子状态。
   2. 按照先前描述的方法，从 Adipoq-NuTRAP 小鼠中解离出目标脂肪组织¹⁴。
   3. 将组织在液氮中迅速冷冻，并于 −80 °C 保存至使用。
      注意：每个脂肪垫可整体保存，冷冻组织可在使用前于干冰上切割成较小片段（约 50 mg）用于实验。或者，也可在切割后分装至离心管中冷冻保存（每管约 50 mg）。冷冻样品在使用前严禁解冻。
2. 缓冲液配制
   注意：实验过程中所有缓冲液均需保持在冰上。
   1. 配制细胞核提取缓冲液（NPB）：250 mM 蔗糖、10 mM HEPES（pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl₂ 和 0.1% NP40。每份样品准备 7 mL NPB。使用前新鲜加入 100x 蛋白酶抑制剂混合物（终浓度 1....

结果

为了使用本ATAC-seq方案分析脂肪组织，我们构建了饲喂普通饲料的Adipoq-NuTRAP小鼠，并通过流式细胞术从附睾白色脂肪组织（eWAT）、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和棕色脂肪组织（BAT）中分离出脂肪细胞核。分离得到的细胞核用于进行标签化（tagmentation），随后进行DNA纯化、PCR扩增、质量检测、测序及数据分析，具体步骤如上所述。本代表性实验的目的是对从不同脂肪储存部位分离出的纯脂肪细胞群体的染色质可及性进行分析。

我们观察到，通过流式细胞术分析Adipoq-NuTRAP小鼠脂肪组织中分离出的细胞，mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核能够与其他细胞类型的细胞核明显区分开来（图2A-C）。不同脂肪储存部位的脂肪细胞比例存在差异：eWAT中约为50%，iWAT中约为30%，BAT中约为65%（图2D）⁷。每个样本可在2-1.......

讨论

本文中，我们介绍了一种优化的ATAC-seq实验方案，用于评估脂肪细胞特异性的染色质可及性 体内该使用Adipoq-NuTRAP小鼠的ATAC-seq方案成功获得了脂肪细胞特异性的染色质可及性图谱。成功且可重复的ATAC-seq实验最关键的因素是细胞核质量。分离的脂肪组织必须立即在液氮中速冻，并在使用前安全保存于−80 °C，避免反复冻融。在细胞核分离与分选过程中，防止脂肪细胞核损伤也至关重要。样品操作过程中必须轻柔处理 通过 在细胞核分离的整个过程中，采用低速离心并尽量减少移液操作。

在细胞核分选过程中仔细设门对于选择性分离mCherry/GFP标记的脂肪细胞核至关重要（图1）。必须确保mCherry/GFP阳性与阴性群体之间有清晰的分离。同样，轻柔操作和快速分选对于保持细胞核内染色质的天然状态十分必要。如果荧光信号较弱、分选时间过长，和/或脂肪细胞组分偏离预期范围，则提示样本可能存在异常，或细胞核分离过程出现问题。本方案可根据具体实验条件进行调整。首先，ATAC-seq所需的细胞核.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>动物
Adiponectin-Cre 小鼠	杰克逊实验室	28020
NuTRAP 小鼠	杰克逊实验室	29899
<强>试剂 &和材料
1.5 mL DNA-LoBind 管	Eppendorf	86-923
100 µm细胞滤筛	Falcon	352-360
15 mL 离心管	VWR	525-1071
2x TD缓冲液	Illumina	15027866
384孔PCR板	应用生物系统公司	4483285
40 µm细胞滤筛	Falcon	352-340
50 mL 离心管	VWR	525-1077
AMPure XP 试剂（SPRI 磁珠）	贝克曼库尔特	A63881
Bioanalyzer 高灵敏度 DNA 试剂盒	安捷伦科技	5067-4626
透明粘性薄膜	应用生物系统	4306311
无DNase/RNase的蒸馏水	Invitrogen	10977015
Dounce 组织研磨器	DWK生命科学	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 侧边裙板磁铁	赛默飞世尔科技	12027
FACS 管	Falcon	28719128
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl（2 M）	Boston BioProducts	MT-252
用于PCR 8联管条的磁力分离架	EpiCypher	10-0008
MgCl2 (1 M)	Boston BioProducts	MT-200
MinElute PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28004
NEBNext 高保真 2x PCR 预混液	BioLabs	M0541S
NP40	赛默飞世尔科技	28324
PCR 8孔排管	美国科学	1402-4708
蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）	赛默飞世尔科技	78439
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Invitrogen	Q32851
蔗糖	Sigma	S0389-1KG
SYBR Green I（10,000×）	Invitrogen	S7563
TDE I 酶	Illumina	15027865
<强>仪器
流式细胞仪	BD 生物科学	FACSAria Fusion
Qubit 荧光仪	Invitrogen	Q33226
实时荧光定量PCR系统	赛默飞世尔科技	QuantStudio?5