使用口内荧光相机对牙菌斑进行半自动平面测量定量分析

摘要

本研究介绍了一种基于口内荧光相机所获取图像的半自动化数字图像分析流程，用于对暴露的牙菌斑进行平面测量定量。该方法可在科研环境中快速、可靠地定量牙菌斑。

摘要

牙菌斑的累积可通过临床指数或平面测量菌斑指数（PPI）进行量化， 后者用于测量牙齿表面被菌斑覆盖的相对面积。与临床指数相比，PPI具有更高的区分能力，但传统的平面测量法分析过程耗时较长，因为必须使用图像处理软件对每张图像中被菌斑覆盖和清洁的牙面区域进行手动测定。本文介绍一种半自动化的牙菌斑平面测量定量方法，可同时快速处理多达1,000张图像。该方法利用口内相机获取的荧光图像中显色菌斑、健康牙面与软组织之间增强的对比度，实现高效分析。临床操作的规范执行和图像采集的准确性，是成功实现菌斑覆盖区域半自动化识别的关键步骤。该方法适用于健康唇面及口腔内牙面、大多数复合树脂修复体以及正畸托槽存在情况下的牙齿平面测量，但不适用于金属修复体。与传统的PPI记录方法相比，半自动化平面测量显著减少了分析所需时间及人为主观干预，从而提高了平面测量结果的可重复性。

引言

在科研环境中，牙菌斑的定量检测通常采用临床指数法，或记录平面菌斑指数（PPI）¹。临床指数（如经Turesky改良的Quigley-Hein菌斑指数）依赖操作者对菌斑覆盖面积进行视觉评估，并据此在有序等级量表上赋予评分²。尽管评分过程较快，但使用临床指数需要繁琐的检查者间和检查者内校准，且评分结果始终存在一定程度的主观性^3,4,5。此外，由于评分等级数量有限，临床指数可能无法检测出菌斑覆盖面积中的显著差异⁶。

在进行平面测量记录时，通过将数字图像中牙菌斑覆盖区域的面积除以牙齿表面的总面积来确定菌斑覆盖程度⁷。使用连续性评分尺度可提高准确性，并在统计分析中表现出较高的区分能力^8,9,10。此外，有人认为平面测量法主观性较低，因为该指数是由计算得出，而非由检查者主观估计¹¹。传统上，用于菌斑指数（PPI）记录的菌斑覆盖区域和牙齿总面积是通过使用图像处理软件在每张图像中手动绘制感兴趣区域来确定的^7,12。因此，以往的平面测量分析非常耗时，限制了其在较大规模临床研究中的应用⁶。

在传统的白光图像中，牙菌斑覆盖区域、清洁牙面区域以及周围组织之间的对比度较弱，因此严重阻碍了通常依赖基于强度的物体检测的自动图像处理^13,14。使用荧光相机获取的图像则显著增强了显示的牙菌斑、在绿光谱中强烈自体荧光的清洁牙齿以及无荧光的软组织之间的对比度¹。

本文介绍了一种半自动化的平面测量方法，与传统的PPI记录相比，该方法显著减少了图像分析所需的时间。该方法采用标准的显影流程、市售的荧光相机以及一款免费的图像分析软件。文中讨论了图像采集与图像分析中的关键参数，以及该方法常见的错误和局限性。

方案

本研究经丹麦中日德兰地区伦理委员会批准（编号：1-10-72-259-21），并依照《赫尔辛基宣言》及其后续修订版本的规定进行。

1. 定制间隔垫片的制备（可选）

注意：在图像采集过程中，可使用定制的3D打印间隔器来标准化相机头的定位。该间隔器并非荧光图像记录所必需。

1. 间隔件的设计
   1. 设计一个适配口内荧光相机镜头的间隔件。为此，使用数字扫描仪对相机镜头进行扫描，并将扫描数据导入专用软件中。
   2. 根据所需的形态和与相机镜头的定位距离（例如 4 mm）设计间隔件，并以 STL 文件格式导出（设计示例见附件 Supplemental File S1）。
2. 间隔件的增材制造
   1. 打开与打印机配套的增材制造软件，选择基本设置。点击 Printer | 选择可用的 3D 打印机 | Next | 形状：Clear | Next | 打印模式：50 microns | Next | 构建样式：Standard | Next。
   2. 通过点击 File | Import 导入 STL 文件 | 选择 STL 文件 | Open。
   3. 定义间隔件在打印平台上的位置；点击 Transform，并将间隔件拖动至平台角落，尽可能靠近平台表面。
   4. 如需打印多个间隔件，点击 Copy | Linear pattern。调整数量和间距以适配打印平台，然后点击 Set。
   5. 为设计物件的支撑结构，点击 Smart support | Style: General | Generate | Type: Gate | Create support。
   6. 将打印任务发送至 3D 打印机。点击 Add to queue。软件在添加任务至队列时会自动对 STL 文件执行质量检查以识别错误。然后，点击 Add to queue | Job name | F4X | Add to queue。
   7. 在 3D 打印机上安装清洁的打印平台，并加入合适的树脂。点击 Start job，并扫描树脂的二维码。确认打印平台干净且无残留物，树脂槽已加满，且树脂在加入前已充分搅拌。点击 Start job。
   8. 打印完成后，从打印平台上取下间隔件。
   9. 将间隔件置于异丙醇中超声清洗 3 分钟。使用新鲜异丙醇重复清洗一次。将间隔件自然晾干。
   10. 将间隔件放入后固化炉中进行 10 分钟的聚合，以确保材料完全固化。
   11. 去除支撑材料，并对间隔件进行染色处理，防止光线穿透材料。

2. 菌斑显示与图像采集

1. 将定制的间隔件安装到荧光相机上（可选）。将口内相机连接至计算机，并打开相机软件。
2. 点击 患者 | 新建患者 以在系统中创建患者档案。填写患者信息。点击 患者 | 保存 以保存患者数据。点击 视频。此时口内相机已准备就绪，可以使用。
3. 调暗室内灯光。
4. 使用棉球将红色显影染料（例如 5% 赤藓红）涂抹于目标牙面，以显示菌斑。
5. 指导患者用水漱口 10 秒，以去除多余染料。用棉球清除任何牙龈染色。每颗牙齿吹气干燥 3 秒。
6. 将口内相机水平放置于目标牙齿前方，使间隔件接触牙龈或邻牙。按下相机按钮获取荧光图像。
   注意：确保目标牙面的整个区域均聚焦并完整呈现在图像中，且不包含对颌牙或对侧牙的表面。
7. 对所有目标牙齿重复步骤 2.4–2.6。
8. 在相机软件中标记所有图像。在菜单中点击 保存图像/视频 以保存图像。
   注意：请确保图像保存在“菌斑”模式下，而非“龋齿”模式下。菜单中的 P/C 符号表示当前模式。
9. 如需导出图像，请进入查看器（Viewer）。选择要导出的图像。点击 文件 | 导出（另存为…） | 导出患者的所有图像。在导出窗口中，选择以下设置：模式：标准 | 导出路径：选择目标文件夹 | 图像类型选择：勾选左侧复选框 | 图像状态：原始数据。展开导出窗口以显示更多选项。选择以下内容：文件名包含：卡号 或 用户输入 或 患者姓名 | 格式：TIF。点击 确定 以导出图像。
   1. 或者，在成像前设置自动文件导出。点击 选项 | 显示配置 | 模块 | 查看器 | 导出/邮件 | 导出选项 | 模式：自动导出 | 导出路径：选择目标文件夹 | 图像状态：原始数据。选择以下内容：文件名包含：卡号 或 用户输入 或 患者姓名 | 格式：TIF。点击 确定 以设置默认导出参数。当自动导出设置完成后，图像在保存时（步骤 2.8）将自动导出。

3. 数字图像分析

注意：数字图像分析可在图像采集后的任何时间进行。最多可同时处理 1,000 张荧光图像。如果大规模图像批次的分析超出计算能力，可在分析前减小图像尺寸。

1. 牙齿总面积的定量分析
   1. 将所有图像重命名为连续的序号（例如，Planimetry_001、Planimetry_002，…）。通过点击文件 | 导入图像 | 以彩色模式导入，将荧光图像序列以红-绿-蓝（RGB）模式导入专用图像分析软件（例如 Daime¹⁵）中。
   2. 点击分割 | 自动分割 | 自定义阈值，对图像序列进行基于阈值的分割。将“低”阈值设置为高于口腔软组织的强度值（例如，80）。将“高”阈值保持在255。这样，软件仅将牙齿（包括清洁区域和牙菌斑覆盖区域）识别为对象。点击应用 | 确定 | 分割！以启动分割过程。
   3. 通过双击图像序列的名称打开可视化窗口。进入对象编辑器（OBJ）。对分割后的图像进行视觉质量控制，并通过拒绝和删除来清除伪影对象。
   4. 合并所有图像中的剩余对象（在所有图像中 | 合并所选对象）。此时每幅图像中仅有一个对象。量化每幅图像中的牙齿总面积（分析 | 测量对象 | 清除全部 | 像素）。导出数据。
2. 牙菌斑覆盖面积的定量分析
   1. 再次将荧光图像序列导入软件中，此次以分离的红、绿、蓝三色通道模式导入（文件 | 导入图像 | 以灰度模式导入）。关闭蓝色通道图像。将对象层从RGB图像传输至红色通道图像（分割 | 传输对象层）。
   2. 使用对象编辑器删除红色通道图像中的非对象像素（在所有图像中 | 删除非对象像素（体素））。此时软组织已从图像中去除。
   3. 为了增强牙菌斑覆盖区域与清洁牙面之间的对比度，将红色通道图像序列乘以2倍（编辑 | 图像计算器 | 乘法 | 参数：因子 2.00 | 应用 | 确定）。
   4. 为了从图像中去除清洁牙面区域，用增强后的红色通道图像序列减去绿色通道图像序列（编辑 | 图像计算器 | 第二操作数图像：Planimetry_green | 减法 | 应用 | 确定）。
   5. 为了识别牙齿上的牙菌斑覆盖区域，对所得图像序列进行基于阈值的分割（分割 | 自动分割 | 自定义阈值）。将“低”阈值设置为高于清洁牙面区域的强度值（例如，80）。将“高”阈值保持在255。此时软件仅将牙菌斑覆盖区域识别为对象。点击应用 | 确定 | 分割！以启动分割。
   6. 在对象编辑器中对分割后的图像进行视觉质量控制，并通过拒绝和删除来清除伪影对象。合并所有图像中的剩余对象（在所有图像中 | 合并所选对象）。量化每幅图像中牙菌斑覆盖的面积（分析 | 测量对象 | 清除全部 | 像素）。导出数据。
   7. 在专用软件中打开导出的数据表。根据公式（1）计算牙菌斑指数（PPI）：
      公式（1）     

结果

本方法可实现对牙齿上菌斑覆盖区域进行快速、半自动化的平面测量定量分析（图1）。菌斑通过赤藓红染色显示，而清洁的牙面区域以及已形成的获得性膜则不着色¹⁶（图2A）。当使用荧光相机获取图像时，清洁牙面区域、菌斑覆盖区域与周围软组织之间的对比度显著增强（图2B、C）。荧光相机具有两个检测通道，分别为绿色和红色光谱范围。与清洁牙面区域相比，菌斑覆盖区域在红光通道中呈现轻微亮化（图2D、E）；而在绿光通道中，菌斑覆盖区域显著掩盖了牙齿自身的自发荧光（图2F）。在图像分析过程中，利用这一遮蔽效应，将绿光通道图像从红光通道图像中减去（图2G）。所得图像中清洁区域与菌斑覆盖区域之间形成强烈对比（图2H），从而可通过基于强度阈值的半自动化方法确定菌斑指数（PPI）。每次可同时处理多达1,000张荧光图像。

可使用定制的3D打印间隔器，以确保相机镜头与目标牙齿保持相同距离，实现标准化定位。该间隔器还能屏蔽环境光对牙齿的干扰，从而增强所获取图像中菌斑显示区域、清洁牙面区域以及周围软组织之间的对比度。间隔器通过三个固位元件安装在相机镜头上（图3）。

所述方法可用于对牙齿唇面和舌面的龈上菌斑和牙石进行平面测量记录（图4A-D）。根据牙弓曲度的不同，可能难以将间隔器紧贴牙龈放置，从而难以保持相机镜头与牙齿之间的距离恒定。由于菌斑面积覆盖率是相对于牙齿总面积来确定的，因此此类差异不太可能影响PPI的记录结果。不同颜色的牙齿修复材料在绿色光谱中具有不同程度的自发荧光强度^17,18,19。因此，通常可使用标准图像分析算法对含有玻璃离子水门汀和复合树脂修复体的牙齿进行PPI测定（图4E-H）。相比之下，银汞合金和铸造修复体在红色和绿色通道中通常仅有微弱发射信号，因此无法在这些表面上准确测定菌斑覆盖情况（图4I,J）。金属正畸托槽同样存在此问题，但由于托槽表面通常被排除在PPI记录范围之外，因此半自动平面测量法适用于正畸患者（图4K,L）。

在荧光图像上成功实现菌斑覆盖区域的半自动识别，在很大程度上依赖于临床操作中各个步骤的精确执行。如果环境光线过多进入图像，红色通道背景的亮度会升高，导致牙齿与软组织之间的区分变得困难（图5A、B）。因此，在图像采集过程中需要调暗室内灯光。如果患者在图像采集时张口不足，对颌牙可能被同时摄入图像，从而干扰半自动处理过程（图5C）。当对前磨牙或磨牙进行平面测量时，正确调整相机角度至关重要，以避免拍摄到咬合面的部分区域（图5D、E）。一旦菌斑沉积物被染色显示，操作者应立即进行图像采集；否则，赤藓红可能被冲洗掉，导致菌斑覆盖区域与清洁牙面之间的对比度变得过于微弱。然而在某些情况下，染色液可能对牙龈造成明显着色，且该着色在随后的冲洗中难以去除（图5F）。为避免高估菌斑覆盖面积，可通过额外冲洗或用棉球轻轻擦拭牙龈以减轻染色。

图1：牙齿表面菌斑覆盖半自动定量分析的工作流程。 缩写：PPI = 平面菌斑指数。 请点击此处查看此图的放大版本。

图2：数字图像分析流程。（A）牙菌斑暴露后的白光图像（26号牙，唇面）。（B）使用荧光相机获取的对应图像（红-绿-蓝 [RGB] 模式）。注意菌斑覆盖区域与清洁牙面区域之间的对比度增强。（C）通过基于强度阈值的分割方法识别出牙齿的总面积（橙色轮廓标记）。（D）将RGB图像中的目标层转移至红色通道图像（橙色轮廓），并删除非目标像素（背景、软组织）。（E）红色通道图像的亮度增强两倍。（F）绿色通道图像。注意菌斑覆盖区域的自发荧光减弱。（G）将绿色通道图像（F）从经增强的红色通道图像（E）中减去后，菌斑覆盖区域与清洁牙面区域之间的对比度明显可见。（H）经过基于强度阈值的分割后，菌斑覆盖区域被识别为目标物（橙色轮廓），并可计算平面菌斑指数（PPI）（PPI = 81.6%）。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：定制间隔器。 定制间隔器的（A）正面、（B）侧面和（C）背面视图。（D）安装了间隔器（橙色轮廓）的荧光相机。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：半自动平面测量法的应用与局限性。（A）牙齿唇面的荧光图像。（B）对应的处理后图像，显示被菌斑覆盖的区域（橙色轮廓；平面测量菌斑指数 [PPI] = 51.9%）。（C）牙齿𬌗面的荧光图像。（D）对应的处理后图像，显示被菌斑覆盖的区域（橙色轮廓；PPI = 14.5%）。（E–H）带有复合树脂修复体的牙齿图像。图 E 中的修复体在绿色光谱中强烈荧光，而图 G 中的修复体荧光强度略低于周围清洁的牙体组织。在这两张图像中，均可使用标准图像分析算法确定 PPI。（F、H）处理后的图像，显示被菌斑覆盖的区域（橙色轮廓；PPI 分别为 20.3% 和 20.2%）。（I、J）带有银汞合金修复体的牙齿（I）和带有金属烤瓷冠的牙齿（J，蓝色轮廓为手动添加）的荧光图像。这两种修复体均不产生荧光，因此无法通过半自动平面测量法对菌斑沉积进行定量分析。（K）带有金属正畸托槽的牙齿荧光图像。由于在分析中排除了托槽区域，因此仍可使用标准图像分析算法确定 PPI（L，橙色轮廓，PPI = 31.5%）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：临床操作对图像质量及半自动平面测量结果的影响。（A）在环境光调暗条件下获取的荧光图像。经基于阈值的图像分割后，牙齿总面积被正确识别（橙色轮廓）。（B）在环境光开启条件下对同一颗牙齿获取的荧光图像。由于红色光谱背景信号增强，基于阈值的分割无法准确区分牙面与周围软组织（橙色轮廓）。（C）在张口不足条件下获取的荧光图像。未暴露的对颌牙在图像中可见，因此被纳入总牙面积（橙色轮廓）。为获得准确的平面测量菌斑指数，需在图像分析过程中手动去除这些区域。（D）在相机探头位置最佳条件下获取的荧光图像。总牙面积（橙色轮廓）仅限于唇面区域。（E）对（D）中同一颗牙齿在相机探头角度欠佳条件下获取的荧光图像。部分咬合面被捕捉到，导致总牙面积增大（橙色轮廓）。（F）菌斑显色后的白光图像，显示牙龈染色明显。红色光谱的高强度发射可能导致菌斑覆盖面积被高估。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件 S1： 请点击此处下载该文件。

讨论

与传统的平面测量法相比，基于荧光图像的半自动平面测量法在科研环境中对健康牙面牙菌斑的定量分析具有改进意义²⁰。半自动平面测量法可通过预设的后期处理算法，同时对多达1,000张图像进行牙菌斑指数（PPI）的测定。因此，该方法在时间效率上显著优于传统平面测量法，后者需在图像处理软件中手动绘制感兴趣区域，以确定牙齿总面积和菌斑覆盖面积^7,12。此外，图像分析过程中人为判断的影响仅限于选择图像分割的亮度阈值。因此，所有图像均采用相同方式处理，大大降低了检查者主观性带来的影响¹¹。

该方案中的关键步骤主要涉及临床操作，这些操作必须以高度标准化的方式进行，以获得最佳的图像质量。显影液必须轻柔且均匀地涂抹，并在冲洗和吹干后立即采集图像，以避免染料被洗脱，从而导致图像对比度下降。此外，应避免牙龈出血，因为血红蛋白可能会增强红色通道中记录的荧光信号¹⁹。图像采集时应调暗室内灯光，以减少环境光的干扰；患者需充分张口，确保对颌牙齿不会出现在图像中。相机镜头必须垂直于牙齿长轴放置，以避免拍摄到咬合面部分或对侧牙齿。

由于图像采集不理想而产生的伪影，在大多数情况下可以在图像分析过程中予以消除，但会显著增加处理时间。在分割过程中被识别为对象的一些伪影，可通过对象编辑器简单删除来清除。如果伪影与被识别为牙菌斑的区域相互融合，则必须先在对象编辑器中将生成的对象进行拆分，然后再予以移除。在极端情况下，操作者可能需要通过在软件中手动绘制感兴趣区域，来确定洁净牙面和牙菌斑覆盖区域。如果所有临床操作均准确执行，那么图像分析过程中操作者的主观干预仅限于确定基于阈值分割的截断值。通常情况下，图像中牙菌斑覆盖区域与洁净牙面区域界限清晰，但需指出的是，所选阈值的微小差异确实会对计算出的牙菌斑指数（PPI）值产生一定影响，尽管影响程度相对较低。由于特定研究中获取的所有图像均可使用相同的阈值进行分割，因此截断值的主观选择不会影响治疗组或患者组之间的差异。

与手动描记法类似，由于使用了显色剂，半自动描记法不适用于牙菌斑长期积聚情况的纵向记录。赤藓红可能通过其抗菌活性干扰生物膜的生长^21,22,23，但更重要的是，明显的染色意味着在患者离院前必须进行专业的菌斑清除。然而，所描述的方法可用于临床中对习惯性菌斑水平的定期量化。半自动描记法的另一局限性源于个体牙齿之间的大小差异。尽管可以标准化相机与牙齿表面之间的距离，从而标准化视场大小，所获取的图像仍可能包含邻近牙齿的部分结构。这些干扰部分无法通过批量操作去除，只能在分析过程中通过手动裁剪图像来消除。虽然半自动描记法适用于健康牙面龈上菌斑和牙石²⁴的量化，但该方法在存在发育缺陷²⁵、龋洞与非龋洞性龋损以及重度着色等情况时的表现，仍有待进一步研究确定。

总之，半自动平面测量法是一种利用荧光相机快速、可靠地量化斑块面积覆盖率的方法，可应用于评估 从头合成 不同患者群体中的菌斑形成，或不同治疗方案对菌斑清除的影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3D Sprint 基础版	3D systems		增材制造软件
5% 赤藓红；Top Dent Rondell Röd	Top Dent Lifco Dental AB	6327	显色溶液
D1000 实验室扫描仪	3 Shape		用于扫描相机探头的实验室扫描仪
DBSWIN 5.17.0	Dürr Dental		VistaCam 软件
微生物生态学中的数字图像分析（Daime），版本 2.2.2			图像分析免费软件
LC-3D Print Box	NextDent		聚合装置
Meshmixer 3.5	Autodesk		用于设计定制间隔器的免费软件
NextDent 5100	3D systems		3D 打印机
NextDent Ortho IBT	3D systems		间隔器材料
超声波清洗槽 T660/H	Elma Schmidbauer GmbH
VistaCam iX HD 智能口内相机	Dürr Dental		与荧光相机探头联用