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方法文章

从植物组织中纯化具有活性的光系统I-捕光复合物I

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DOI：

10.3791/65037

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2023年2月3日

 , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Center for Applied Structural Discovery, Arizona State University

本文内容

摘要

本方案描述了从植物组织中分离光系统I（PSI）- 捕光复合体I（LHCI）的方法。PSI与PSII共同负责在产氧光合自养生物中将光能转化为化学能，其量子效率约为1，因此成为研究光驱动能量传递的理想对象。

摘要

该方法用于从植物中分离光系统I（PSI）及其天然捕光天线——光捕获复合物I（LHCI）。PSI-LHCI是一种大型膜蛋白复合物，协调数百个捕光和电子传递因子，是自然界中效率最高的光捕获系统。由构成LHCI的四个LHCA天线蛋白吸收的光子，通过激子相互作用传递至PSI核心反应中心，驱动类囊体膜上的光诱导电荷分离，从而为光合自养生物的碳固定提供还原力和能量。PSI的高量子效率使其成为研究光驱动能量传递的理想模型。在本实验方案中，首先对植物组织进行机械匀浆，通过过滤和离心将叶绿体与大部分细胞碎片分离。随后通过渗透裂解法裂解分离得到的叶绿体，并通过离心收集类囊体膜，再使用去垢剂正十二烷基-β-麦芽糖苷（n-dodecyl-beta-maltoside）进行溶解。将溶解后的样品加载到阴离子交换柱上，以收集大多数含叶绿素的复合物。将较大的复合物从溶液中沉淀出来，重悬于少量缓冲液中，然后加载到蔗糖梯度中，以分离主要的含叶绿素复合物。对所得蔗糖梯度组分进行表征，以鉴定含有PSI-LHCI的目标条带。该方案与植物PSI-LHCI晶体结构解析所用方案高度相似，但进行了若干简化，其基础是Nathan Nelson实验室多年来发展的方法。

引言

放氧光合作用是地球上最重要的化学反应之一。光能转化为化学能的过程发生在两个光系统的反应中心内，即光系统I（PSI）和光系统II（PSII）1（图1A）。PSI是一种大型、高度保守的多亚基色素-蛋白质复合物，早在35亿年前就已进化形成2,3。该复合物包含约100个叶绿素分子和约20个类胡萝卜素分子，能够介导电子从质体蓝素向铁氧还蛋白的跨类囊体膜传递，其中铁氧还蛋白作为光合电子传递链的最终电子受体1,4,5（图1B、C）。在植物中，这种光驱动的电荷分离是由光能从PSI核心天线色素以及光捕获复合物I（LHCI）的外围天线色素共同传递至PSI反应中心而实现的（图1D）。LHCI是类囊体膜内一种PSI特异性的天线复合物，由四种结合叶绿素a/b的LHCA天线蛋白组成6,7。

光合作用示意图、电子传递链、光系统、ATP合成、蛋白质结构。
图1：光合电子传递链及PSI-LHCI复合物的整体结构。（A）光合电子传递链包含四个主要的膜结合光合复合物和三种可溶性电子载体。电子通过传递链的流动（红色箭头）以及质子向腔内的泵送（黑色箭头）被用于生成还原力（NADPH）并产生用于碳固定的ATP37,38,39,40。图示使用Biorender.com创建。（B）从腔面观察的植物PSI-LHCI结构。PsaA和PsaB是PSI中最大的亚基，构成该复合物的核心。LHCI是与PSI相关的光捕获天线复合物，由四个天线亚基LHCA1-4组成。（C）PSI-LHCI复合物协调结合了超过150个配体。图中显示了叶绿素（绿色）、类胡萝卜素（粉色）、醌类（紫色）、脂质（橙色）以及反应中心的铁硫簇（黄色/橙色）。（D）PSI的反应中心分为两条分支（A和B），起始于P700（反应中心特殊的叶绿素对），随后进入两个辅助叶绿素（A-1A/B），再进入另一对叶绿素（A0A/B）。每条分支中，这些叶绿素之后是一个叶绿醌（A1A/B，在某些文献中记为QA/B），然后两条分支在铁硫簇Fx处汇合，之后再经过由PsaC亚基配位的另外两个簇FA和FB。请点击此处查看该图的放大版本。

1966年首次从植物中分离出光系统I（PSI），揭示了PSI与PSII在捕光色素组成上的差异，表明PSI中β-胡萝卜素含量显著高于PSII，且含有细胞色素f和b6 （细胞色素b的一部分）6f复合物）与光系统I（PSI）结合不紧密，而是松散地存在于类囊体膜中8九年之后，通过对分离的光系统I（PSI）进行SDS处理以实现部分变性，研究发现小分子量PSI亚基的解离会抑制PSI介导的NADP+光还原反应，而P700信号及大部分叶绿素仍保留在剩余的大分子量PSI颗粒中，从而证实了某些PSI小亚基对实现其完整生物学功能的必要性，并确定了PSI反应中心的位置9. 关于PSI核心与LHCI之间关联的研究最早发表于20世纪80年代初，当时观察到不同大小的PSI复合物中叶绿素a与P700的比例各异，表明PSI与一个含叶绿素的外周天线系统存在关联10,11,12,13然而，直到2003年，植物光系统I（PSI）的首个晶体结构才被发表14植物PSI-LHCI的晶体结构凸显了植物与蓝细菌PSI核心之间的显著保守性，并首次揭示了植物PSI核心及LHCI天线中叶绿素的排列方式，进一步深化了对植物PSI-LHCI复合体内部能量传递路径的理解14在过去十年中，更多植物PSI-LHCI结构被解析，为该超复合体的结构描述增添了原子水平的细节15,16,17,18,19.

光系统I（PSI）不仅具有接近1的量子效率，而且在自然界中拥有最负的还原电位20,21。要理解光驱动的能量传递过程，并将仿生策略应用于未来的光捕获技术，全面了解PSI-LHCI及其特性至关重要。为了进一步阐明PSI-LHCI及其众多亚基如何实现如此高效的能量转换，用于研究的复合物必须保持完整且具有活性。本实验方案可实现该复合物在活性状态下的温和纯化22,23。

本方法通过机械破碎植物组织，并利用离心法分离含有光合电子传递链的叶绿体。在低渗裂解叶绿体后，分离类囊体膜，随后使用去垢剂正十二烷基-β-麦芽糖苷（β-DDM）进行溶解。含有叶绿素的膜蛋白复合物通过阴离子交换色谱进行分离，再通过蔗糖梯度离心进一步纯化光系统I-捕光复合物I（PSI-LHCI）。从梯度中收集目标组分后，通过光谱学分析及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行表征，即可将该复合物用于后续实验。本方案可用于从植物中纯化PSI-LHCI复合物，且无需使用任何亲和标签。通过少量修改，该方法还可适用于从其他生物中制备该复合物、稳定其他形式的PSI复合物，或分离光合电子传递链中的其他复合物。类似方案已被用于制备适用于高分辨率结构分析的光系统I复合物23,24,25,26,27,28,29,30。

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方案

1. 菠菜叶片类囊体膜的制备

  1. 在制备过程中尽量在冰上操作，并避免光照。如果叶绿素浓度较高，且样品尽可能保持遮盖状态，则低光照环境已足够。除非另有说明，所有离心步骤均在 4 °C 下进行。
  2. 用剪刀去除菠菜叶片（500 g）的茎部，将叶片轻轻压入搅拌机中，并用预冷的蔗糖-三（羟甲基）氨基甲烷-氯化钠（STN）缓冲液（表 1）完全覆盖。使用脉冲模式将植物组织在 STN 缓冲液中匀浆两次，每次 10 秒（共 20 秒），两次脉冲之间间隔 10 秒，以防止过热。
    注意：缓冲液与叶片的典型比例为每 500 g 菠菜叶片使用 1 L STN 缓冲液。
  3. 将八层纱布固定在一个大型预冷烧杯或其他容器上，将匀浆混合物倒入纱布中以过滤细胞碎片。使用玻璃棒或勺子搅拌滤布中的残渣，促进裂解液通过。
  4. 在 1000 × g 条件下离心 9 分钟，沉淀叶绿体。将叶绿体重悬于 1 L 低渗缓冲液（表 1）中。重悬时可使用移液器或将叶绿体沉淀在缓冲液中轻轻涡旋，随后转移至适当尺寸的组织研磨器或类似均质器中。
    注意：低渗溶液处理及在组织研磨器中重悬可导致叶绿体破裂。
  5. 在 500 × g 条件下离心 2 分钟，以去除淀粉（形成白色沉淀）。使用移液器或小号毛笔小心地将沉淀中的绿色物质重新悬浮至上清液中，同时尽可能避免淀粉的重新悬浮。随后在 12,000 × g 条件下离心 10 分钟，沉淀类囊体膜。
  6. 用最小体积的高盐重悬缓冲液（表 1）重悬沉淀的膜，仅需足够覆盖并重悬膜即可，使用移液器或小号毛笔操作，并参照步骤 1.4 使用均质器进行均质。在 8000 × g 条件下离心 10 分钟。
  7. 如前所述，用最小体积的 STN2 缓冲液（表 1）重悬膜，仅需足够重悬即可，并使用紫外-可见分光光度计测定叶绿素含量。通过将样品用 80% 丙酮溶液稀释 1/1000，并采用 Porra 等人31 的方法测定叶绿素浓度。
  8. 通过添加 STN2 缓冲液将叶绿素浓度调整至所需值，通常为 3 mg/mL，并均匀分装至两到三个离心管中。从 500 g 叶片中预期可获得约 200 mg 叶绿素，但具体产量会因起始材料状态而有所差异。将样品在 -80 °C 冻存，直至进行膜蛋白增溶。此阶段冻存的膜在至少 6 个月内保持稳定。

2. 膜的溶解

  1. 用 β-DDM 溶解类囊体膜。从 10% β-DDM 储液中加入足量去垢剂，使 β-DDM 与叶绿素的比例达到 6:1。冰上孵育 30 分钟，每 5–10 分钟轻轻混匀一次，通过缓慢倒置离心管数次进行操作。
  2. 使用超速离心机在 120,000 × g 条件下离心 30 分钟，以去除不溶性物质。弃去沉淀，保留上清液用于后续步骤。

3. 使用二乙氨基乙基（DEAE）柱进行洗脱

  1. 根据溶解样品中每1 mg总叶绿素使用1.5 mL柱床体积来准备阴离子交换柱。柱层析过程在4 °C下进行。将树脂倒入固定在铁架台上的层析柱中。在加入水或低盐缓冲液以防止柱子干涸的同时，让树脂自然沉降。确保柱内无气泡，且树脂顶部平整水平。
  2. 用两倍柱体积（CV）的低盐缓冲液（表1）洗涤柱子，然后将步骤2.2中的上清液上样至柱中。待上清液完全进入柱内后，再进行后续操作。
  3. 用一倍柱体积（CV）的低盐缓冲液洗涤柱子。
  4. 使用线性NaCl梯度洗脱，低盐与高盐缓冲液（5–250 mM NaCl；表1）总体积为六倍柱体积（例如，若柱床体积为30 mL，则使用90 mL低盐缓冲液和90 mL高盐缓冲液）。
    1. 将低盐和高盐缓冲液分别倒入两个烧杯中。在将低盐缓冲液滴入柱子的同时，用一根充满水的管子在高盐与低盐缓冲液之间建立盐桥，使其逐渐混合。使用搅拌子确保高盐缓冲液进入低盐缓冲液时充分混匀后再滴入柱中。此操作可保证NaCl梯度呈线性。开始收集洗脱组分。
  5. 收集4 mL的组分（适用于起始叶绿素量约为35 mg的典型实验），合并洗脱峰位于梯度最后三分之一阶段左右的深绿色组分（图2A）。

4. 聚乙二醇（PEG）沉淀

  1. 向合并的叶绿素组分中缓慢加入 PEG6000，使其终浓度达到 8%。PEG 浓度可略有调整；若达到 8% 后仍未见沉淀，以 2% 的增量逐步提高 PEG 浓度，直至出现沉淀（溶液将变浑浊）。
  2. 在 3,214 × g 条件下离心 5 分钟。彻底弃去上清液；为确保下一步获得良好的溶解效果，必须完全去除所有残留的 PEG。将绿色沉淀物重悬于 2–5 mL 柱后重悬缓冲液中（表 1）。
  3. 为验证类囊体是否已完全去除 PEG，取少量重悬样品在台式离心机中于 4 °C、18,407 × g 离心 5 分钟，以确认样品的可溶性。此阶段允许存在少量绿色沉淀，但大部分或全部叶绿素应保留在溶液中。保留可溶性组分。

5. 蔗糖梯度的制备

  1. 用蔗糖梯度缓冲液（表1）配制10%-30%的不连续蔗糖梯度，共五层（10%、15%、20%、25%和30%层）。将蔗糖组分小心地逐层加入聚丙烯离心管中，从30%层开始，至10%层结束，形成蔗糖梯度。调整每一层的体积，使管顶部留有足够的空间，以便加入所需体积的样品。
  2. 将步骤4.2中获得的可溶性材料样品加入蔗糖梯度中。将相当于170 µg叶绿素的样品加入一根离心管，另一管中加入相当于420 µg叶绿素的样品，以获得不同浓度的梯度，用于评估各条带的均一性（图3A）。
    注意：加入的样品量可任意选择，但通常150至500 µg叶绿素的范围较为合适。
  3. 在100,000 x g 条件下离心16小时，以分离样品中的不同复合物。

6. 蔗糖组分的去除及聚乙二醇沉淀

  1. 离心后，从转子中取出梯度管，并使用数码相机或手机拍摄试管照片。用针头从试管底部穿刺，缓慢排出内容物，从而分离各组分。将不同含叶绿素的组分分别收集到离心管中。
    注意：如需要，样品可分装后冷冻保存，以备后续分析。
  2. 某些应用中需要去除蔗糖。为去除蔗糖，可采用第二步聚乙二醇（PEG）沉淀法（或凝胶过滤法）。将PSI-LHCI组分中的NaCl浓度调节至120 mM，并加入PEG6000至终浓度为10%。
  3. 在台式离心机中，以18,407 × g、4 °C 离心5分钟。将绿色沉淀重悬于30 mM Tricine-NaOH（pH 8.0）、50 mM NaCl 和 0.05% β-DDM 溶液中。
  4. 在台式离心机中，以18,407 × g、4 °C 再次离心5分钟，以确保所有物质保持在溶液中。

7. 测定PSI的P700含量

注意：该方法可用于快速检测 PSI。

  1. 将样品稀释至OD680为1-1.5，加入10 mM抗坏血酸，在黑暗中孵育1小时，以完全还原P700。
  2. 使用紫外-可见分光光度计测定样品的吸收光谱。为测定P700含量，仅测量650 nm至750 nm范围内的吸光度，数据间隔为0.50 nm，扫描速率为60 nm/min。
  3. 将样品暴露于强光（350 µmol光子/m2/s）下，并在光照过程中再次测量光谱。
  4. 将光照状态下的光谱减去黑暗状态下的光谱，以观察植物中约702 nm处P700的漂白现象。
  5. 根据700 nm处的吸光度及消光系数64/mM/cm计算P700含量，方法见Hiyama和Ke32,33,34。
  6. 采用Porra等31所述方法测定总叶绿素含量（叶绿素A和叶绿素B）。利用这些浓度计算叶绿素与P700的比值。

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结果

本方案用于从植物组织中分离和表征具有活性的光系统I-捕光复合物I（PSI-LHCI），整个过程耗时三天。首先分离植物类囊体膜，然后用β-DDM对其进行溶解，从而纯化PSI-LHCI。从500克叶片中提取类囊体膜阶段的典型产率为200毫克叶绿素。具体产量可能因起始材料的不同而有所差异。

实验的第二天和第三天采用阴离子交换层析和蔗糖梯度离心法，以分离类囊体膜内的不同蛋白质复合物。在溶解和超速离心后，出现少量深色不溶性沉淀是正常现象，通常有80%或更多的叶绿素仍保留在溶液中。

含叶绿素的复合物与DEAE柱的结合几乎完全，通常在完成柱洗涤步骤后，约有50%–70%的柱体呈现明显的绿色。由于类胡萝卜素的存在，流穿液及NaCl梯度洗脱的早期组分呈无色至橙黄色（图2）。该柱的洗脱曲线显示一个主要的叶绿素峰。为获得高纯度的PSI-LHCI，应弃去早期的绿色组分，仅使用叶绿素浓度最高的组分。将深绿色组分合并后，经聚乙二醇（PEG）沉淀，再进行蔗糖梯度离心过夜。

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讨论

通过本方案，可从植物组织中纯化处于活性状态的光系统I-捕光复合体I（PSI-LHCI）复合物。本实验以菠菜叶片为例，但这些方法也可适用于多种植物的样品制备23,40。在操作过程中，必须始终注意保护该复合物免受损伤。整个操作应在黑暗或绿光下进行，样品需置于冰上，并使用预冷的缓冲液；所有重悬步骤均应轻柔操作。

在类囊体分离过程中，高效且谨慎的离心和重悬步骤对于获得高浓度的膜组分和保持完整复合物至关重要。在去除淀粉的过程中，常会伴随少量绿色物质一同沉淀，且淀粉颗粒在后续步骤中可能反复沉淀。可使用柔软的画笔并配合匀浆器轻柔操作，将绿色膜成分从不溶性淀粉中轻轻悬浮起来。在整个操作过程中，应注意避免破坏淀粉沉淀，以最大限度地去除淀粉。在制备的不同阶段监测叶绿素浓度，是评估各步骤效率以及比较多次制备结果的有效方法。

聚乙二醇（PEG）沉淀法效率很高，但需要一定的判断。每一步所用的PEG（和NaCl）浓度可根据样品的外观进行调...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

Y.M. 感谢美国国家科学基金会（资助号 2034021）以及美国能源部科学办公室、基础能源科学办公室、化学科学、地球科学和生物科学部（资助号 DE-SC0022956）的支持。C.G. 感谢美国国家科学基金会（资助号 00036806）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL Falcon 离心管VWR62406-200用于储存类囊体
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cmbiorad7374153
50 号 cheesecloth，100% 棉Arkwright LLCB07D1FZZMB来自 Amazon
玻璃棒Millipore SigmaBR135825任何类似的玻璃棒均可使用
低型 64 盎司 Vitamix 搅拌机Vitamix
NaClSigma-AldrichS7653
开口聚烯烃离心管Seton Scientific5030
Optima XE 超速离心机beckman coulterA94471
聚乙二醇 6,000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen 组织研磨器，30 mlWHEATON358049
蔗糖Sigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman coulter331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
β-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002以 10% 储存液形式保存于 -20 °C

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