从植物组织中纯化具有活性的光系统I-捕光复合物I

摘要

本方案描述了从植物组织中分离光系统I（PSI）- 捕光复合体I（LHCI）的方法。PSI与PSII共同负责在产氧光合自养生物中将光能转化为化学能，其量子效率约为1，因此成为研究光驱动能量传递的理想对象。

摘要

该方法用于从植物中分离光系统I（PSI）及其天然捕光天线——光捕获复合物I（LHCI）。PSI-LHCI是一种大型膜蛋白复合物，协调数百个捕光和电子传递因子，是自然界中效率最高的光捕获系统。由构成LHCI的四个LHCA天线蛋白吸收的光子，通过激子相互作用传递至PSI核心反应中心，驱动类囊体膜上的光诱导电荷分离，从而为光合自养生物的碳固定提供还原力和能量。PSI的高量子效率使其成为研究光驱动能量传递的理想模型。在本实验方案中，首先对植物组织进行机械匀浆，通过过滤和离心将叶绿体与大部分细胞碎片分离。随后通过渗透裂解法裂解分离得到的叶绿体，并通过离心收集类囊体膜，再使用去垢剂正十二烷基-β-麦芽糖苷（n-dodecyl-beta-maltoside）进行溶解。将溶解后的样品加载到阴离子交换柱上，以收集大多数含叶绿素的复合物。将较大的复合物从溶液中沉淀出来，重悬于少量缓冲液中，然后加载到蔗糖梯度中，以分离主要的含叶绿素复合物。对所得蔗糖梯度组分进行表征，以鉴定含有PSI-LHCI的目标条带。该方案与植物PSI-LHCI晶体结构解析所用方案高度相似，但进行了若干简化，其基础是Nathan Nelson实验室多年来发展的方法。

引言

放氧光合作用是地球上最重要的化学反应之一。光能转化为化学能的过程发生在两个光系统的反应中心内，即光系统I（PSI）和光系统II（PSII）¹（图1A）。PSI是一种大型、高度保守的多亚基色素-蛋白质复合物，早在35亿年前就已进化形成^2,3。该复合物包含约100个叶绿素分子和约20个类胡萝卜素分子，能够介导电子从质体蓝素向铁氧还蛋白的跨类囊体膜传递，其中铁氧还蛋白作为光合电子传递链的最终电子受体^1,4,5（图1B、C）。在植物中，这种光驱动的电荷分离是由光能从PSI核心天线色素以及光捕获复合物I（LHCI）的外围天线色素共同传递至PSI反应中心而实现的（图1D）。LHCI是类囊体膜内一种PSI特异性的天线复合物，由四种结合叶绿素a/b的LHCA天线蛋白组成^6,7

方案

1. 菠菜叶片类囊体膜的制备

1. 在制备过程中尽量在冰上操作，并避免光照。如果叶绿素浓度较高，且样品尽可能保持遮盖状态，则低光照环境已足够。除非另有说明，所有离心步骤均在 4 °C 下进行。
2. 用剪刀去除菠菜叶片（500 g）的茎部，将叶片轻轻压入搅拌机中，并用预冷的蔗糖-三（羟甲基）氨基甲烷-氯化钠（STN）缓冲液（表 1）完全覆盖。使用脉冲模式将植物组织在 STN 缓冲液中匀浆两次，每次 10 秒（共 20 秒），两次脉冲之间间隔 10 秒，以防止过热。
   注意：缓冲液与叶片的典型比例为每 500 g 菠菜叶片使用 1 L STN 缓冲液。
3. 将八层纱布固定在一个大型预冷烧杯或其他容器上，将匀浆混合物倒入纱布中以过滤细胞碎片。使用玻璃棒或勺子搅拌滤布中的残渣，促进裂解液通过。
4. 在 1000 × g 条件下离心 9 分钟，沉淀叶绿体。将叶绿体重悬于 1 L 低渗缓冲液（表 1）中。重悬时可使用移液器或将叶绿体沉淀在缓冲液中轻轻涡旋，随后转移至适当尺寸的组织研磨器或类似均质器中。
   注意：低渗溶液处理及在组织研磨器中重悬可导致叶绿体破裂。
5. 在 500 × g 条件下离心 2 分钟，以去除淀粉（形成白色沉淀）。使用移液器或小号毛笔小心地将沉淀中的绿色物质重新悬浮至上清液中，同时尽....

结果

本方案用于从植物组织中分离和表征具有活性的光系统I-捕光复合物I（PSI-LHCI），整个过程耗时三天。首先分离植物类囊体膜，然后用β-DDM对其进行溶解，从而纯化PSI-LHCI。从500克叶片中提取类囊体膜阶段的典型产率为200毫克叶绿素。具体产量可能因起始材料的不同而有所差异。

实验的第二天和第三天采用阴离子交换层析和蔗糖梯度离心法，以分离类囊体膜内的不同蛋白质复合物。在溶解和超速离心后，出现少量深色不溶性沉淀是正常现象，通常有80%或更多的叶绿素仍保留在溶液中。

含叶绿素的复合物与DEAE柱的结合几乎完全，通常在完成柱洗涤步骤后，约有50%–70%的柱体呈现明显的绿色。由于类胡萝卜素的存在，流穿液及NaCl梯度洗脱的早期组分呈无色至橙黄色（图2）。该柱的洗脱曲线显示一个主要的叶绿素峰。为获得高纯度的PSI-LHCI，应弃去早期的绿色组分，仅使用叶绿素浓度最高的组分。将深绿色组分合并后，经聚乙二醇（PEG）沉淀，再进行蔗糖梯度离心过夜。

讨论

通过本方案，可从植物组织中纯化处于活性状态的光系统I-捕光复合体I（PSI-LHCI）复合物。本实验以菠菜叶片为例，但这些方法也可适用于多种植物的样品制备^23,40。在操作过程中，必须始终注意保护该复合物免受损伤。整个操作应在黑暗或绿光下进行，样品需置于冰上，并使用预冷的缓冲液；所有重悬步骤均应轻柔操作。

在类囊体分离过程中，高效且谨慎的离心和重悬步骤对于获得高浓度的膜组分和保持完整复合物至关重要。在去除淀粉的过程中，常会伴随少量绿色物质一同沉淀，且淀粉颗粒在后续步骤中可能反复沉淀。可使用柔软的画笔并配合匀浆器轻柔操作，将绿色膜成分从不溶性淀粉中轻轻悬浮起来。在整个操作过程中，应注意避免破坏淀粉沉淀，以最大限度地去除淀粉。在制备的不同阶段监测叶绿素浓度，是评估各步骤效率以及比较多次制备结果的有效方法。

聚乙二醇（PEG）沉淀法效率很高，但需要一定的判断。每一步所用的PEG（和NaCl）浓度可根据样品的外观进行调.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL Falcon 离心管	VWR	62406-200	用于储存类囊体
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cm	biorad	7374153
50 号 cheesecloth，100% 棉	Arkwright LLC	B07D1FZZMB	来自 Amazon
玻璃棒	Millipore Sigma	BR135825	任何类似的玻璃棒均可使用
低型 64 盎司 Vitamix 搅拌机	Vitamix
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
开口聚烯烃离心管	Seton Scientific	5030
Optima XE 超速离心机	beckman coulter	A94471
聚乙二醇 6,000	Hampton Research	HR2-533
Potter-Elvehjen 组织研磨器，30 ml	WHEATON	358049
蔗糖	Sigma-Aldrich	S7903
SW 40 Ti	beckman coulter	331301
TOYOPEARL DEAE-650C	Tosoh Bioscience	7988
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
β-DDM	Glycon - Biochemicals GmbH	D97002	以 10% 储存液形式保存于 -20 °C