冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1 µm。
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摘要
摘要
冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）依赖于对嵌入其天然水相环境中的生物或有机样品进行成像；其中水被快速冷冻形成非晶态的玻璃态冰，而不发生结晶。近年来，该方法已广泛用于在接近原子分辨率水平上解析生物大分子的结构。这一技术已扩展至利用断层扫描技术研究细胞器和细胞，但传统的宽场透射电子显微成像模式在样品厚度方面存在严重限制。为此，通常采用聚焦离子束铣削出薄片状样品（lamellae）；通过子断层图平均法从重建结果中获得高分辨率结构信息，但剩余薄层之外的三维关联信息则会丢失。这一厚度限制可通过扫描探针成像技术加以克服，类似于扫描电子显微镜或共聚焦激光扫描显微镜的工作原理。尽管在材料科学中，扫描透射电子显微镜（STEM）可在单张图像中实现原子级分辨率，但冷冻生物样品对电子辐照高度敏感，因此需要特殊考量。本实验方案介绍了一种基于STEM的冷冻断层成像技术的设置方法。文中描述了配备双聚光镜系统和三聚光镜系统的电子显微镜基本光路配置，并采用非商业软件SerialEM实现自动化操作。同时介绍了批量数据采集以及与先前获得的荧光图谱进行关联定位的增强功能。作为示例，我们展示了线粒体的三维重建结果，清晰分辨出其内膜与外膜、磷酸钙颗粒，以及周围的微管、肌动蛋白丝和核糖体。冷冻STEM断层成像技术在揭示细胞质中细胞器的空间分布方面具有显著优势，在某些情况下甚至可呈现贴壁培养细胞的核周区域结构。
引言
细胞器的三维（3D）可视化是现代细胞生物学中的一项关键任务。由于涉及的尺度范围广泛，从分泌囊泡的几十纳米到细胞核的数微米，因此很难找到一种适用于所有情况的单一显微技术。尽管现代荧光显微镜在分辨率上能够覆盖大部分尺度范围，但仅有被标记的分子可见，而完整的细胞结构仍需依赖电子显微镜来观察。传统的化学固定、塑料包埋以及重金属染色方法具有很强的侵入性，其结果可能受样品制备细节的影响。另一方面，冷冻电镜（cryo-EM）则受限于必须将水性介质玻璃化；形成的冰晶会散射电子照明，导致比目标有机材料本身对比度更高的伪影。
过去十年中，为细胞研究开发或改进的电子显微镜成像技术不断涌现1。对于大尺寸样品，目前首选的方法是高压冷冻结合迭代聚焦离子束（FIB）切削，以及利用扫描电子显微镜对连续表面进行成像（即FIB-SEM）2。冷冻软X射线断层成像（cryo-SXT）适用于数微米大小的样品，其尺寸受限于软X射线在水中的特征吸收长度3,4,5。这一尺度涵盖了许多完整细胞类型，而X射线吸收对比度的定量特性还提供了浓度测量6或光谱分析7的可能性。当与子层析图平均技术结合时，基于相位衬度透射电子显微镜（TEM）的冷冻透射电子断层成像（cryo-ET）可为大分子或复合物提供最高分辨率8,9,10。然而，完整的细胞器极少具有足够规则的结构以实现整体平均。此外，传统宽场TEM模式由于样品中的非弹性散射（伴随能量损失）以及磁性物镜的色差，其适用的样品厚度仅限于几百纳米11,12。较大的能量展宽要求使用能量滤波器以消除由此产生的离焦雾状背景，但敏感样品在成像过程中仍会遭受辐射损伤，同时图像信号强度随样品厚度增加呈指数衰减。
另一种成像模式——扫描透射电子显微镜（STEM）——无需能量过滤，利用非弹性散射电子进行成像，尽管目前其分辨率低于透射电子显微镜断层成像图1）。事实上，并未形成真实的图像。相反，与扫描电镜类似，数据是逐点采集的，图像由计算机逐点拼接而成。放大倍数仅由扫描步长决定，无需改变透镜电流。当配置恰当时，冷冻扫描透射电子显微断层成像（CSTET）可适用的样品厚度范围可达1.5甚至2 µm，但其理想工作范围（即有用信号强度仍能保持为照明强度显著比例的厚度区间）约为600–900 nm。11,13足以观察到大部分细胞质，偶尔可见细胞核的边缘。实践中我们发现，通过标准的浸入冷冻液体方法进行玻璃化处理会施加 比STEM成像对厚度的要求更为严格。本视频文章的目的是促进CSTET在科研实验室和显微镜平台中用于细胞和细胞器成像的应用。
第一个挑战在于，与冷冻透射电子显微镜断层成像（cryo-TEM tomography）相比，CSTET 中的显微镜操作尚未在生命科学应用中实现标准化。STEM 硬件很少（即使有也极为罕见）专门面向冷冻电镜市场设计。然而，随着新一代显微镜的出现，这一状况正在改变，许多现有设备也可进行改造升级。STEM 作为一种技术已在材料科学领域广泛应用并占据主导地位，该领域对低温和低剂量方法也日益产生兴趣14,15。材料科学文献中充斥着各种缩写术语，如 BF-STEM、ADF-STEM、HAADF-STEM、4D-STEM、DPC-STEM 等，进一步加剧了理解上的混乱。在此，我们提供一个推荐的起点，根据我们在中国台湾魏茨曼科学研究所的集体经验，该方法基于明场（BF）STEM 成像，可提供获得有用结果的最通用实验方案16。此方案远未涵盖所有可能性，甚至未深入探索其全部潜力，但可作为进一步优化的基础。尽管我们重点强调冷冻STEM，但本方案的大部分内容同样适用于室温下对塑料包埋切片进行的STEM断层成像。
STEM 的本质是使用聚焦的电子束探针（图1）对样品进行扫描，该电子束形成照明锥角，并逐像素记录透射模式下衍射（散射）平面上的信号，从而生成二维图像17,18。无定形样品（包括大多数细胞材料）在透射中会产生弥散的散射图案。最简单的实用 STEM 配置是放置一个圆形探测器来记录中心圆盘（即无样品时可直接透过的探针照明部分）。样品会将电子散射出该照明锥角范围，导致信号减弱，从而形成明场（BF）图像——样品在明亮背景上呈现为暗区。也可（或替代地）使用环形探测器来检测照明锥角以外区域的样品散射信号。当无样品时，探测器无信号；当有样品存在时，物体在暗场（DF）图像中表现为暗背景上的亮区。STEM 的命名方式（如明场、环形暗场[ADF]、高角环形暗场[HAADF]等）主要指探测器收集信号的角度范围。
照明的会聚角是扫描透射电子显微镜（STEM）适应细胞断层成像的一项关键调整。当首要目标是高分辨率时，会聚角应尽可能大。（这一点类似于共聚焦激光扫描显微镜；分辨率由探针直径决定，探针直径与波长除以数值孔径成正比。请注意，在电子显微镜中我们指的是半角或半会聚角。）而当优先考虑景深时，适当牺牲分辨率则具有显著优势，因为聚焦后的电子束在一段距离内近似保持平行，该距离等于两倍波长除以半角的平方。理想情况下，整个细胞体积均可保持在焦平面内19。例如，在300 keV条件下，电子的德布罗意波长为0.002 nm，因此1 mrad的会聚角可实现2 nm的分辨率和4微米的景深。在此条件下，断层成像甚至可以在数据采集过程中完全无需重新聚焦，仅需在采集开始时聚焦一次即可。传统的具备断层成像能力的STEM可达到7或8 mrad的半会聚角；因此理论上，分辨率可达约0.25 nm，但此时焦深仅为62 nm。这对于细胞成像而言显然过薄。配备三个聚光镜的更先进显微镜可在较宽范围内连续调节半会聚角；而采用较传统的双聚光镜结构时，会聚角则由聚光镜（C2）光阑离散固定。
对于坚固的塑料包埋样品，可以在每个倾斜角度记录焦平面序列，并将其合并以获得高分辨率图像20；但对于低温样品，辐射剂量的限制过于严格。最后，在权衡明场（BF）与暗场（DF）成像的优势时，对于较厚的样品，应考虑样品中多次弹性散射的影响。明场信号受多次散射的干扰较小，因此在厚样品中可呈现更高的分辨率16,21。
一个实用的经验法则是，设定的收集角度应为会聚角的数倍。样品越厚，所需的收集圆盘应越大。收集圆盘过小会导致信号强度低；而过大则会降低图像对比度，因为只有大角度散射的电子才会被收集。收集角度应根据具体样品进行优化。检测器角度需根据（衍射）相机长度独立校准，显微镜软件通常可方便地显示这些角度。在实际操作中，对于细胞样品的环形暗场扫描透射电子显微术（CSTET），建议以收集半角θ与照明半角α之比在2至5倍之间作为起始参考（图1）。
以下方案描述了使用广泛采用的SerialEM软件进行显微镜控制的STEM断层成像操作22,23。SerialEM不依赖于特定制造商，已被广泛应用于透射电子显微镜（TEM）断层成像中。大多数断层成像的设置操作均可直接沿用自TEM。SerialEM的策略是将扫描系统建模为一台相机，从而实现从TEM到STEM的简便过渡。但需注意的是，放大倍数和像素合并（binning）等参数完全是人为设定的。真正关键的参数包括以微米为单位的视场大小、视场中的像素数量以及曝光时间。像素间距（即采样）等于线性视场除以像素数量，而停留时间（dwell time）则等于像素数量除以曝光时间。
STEM 和 CSTET 的最低配置需要显微镜具备三个功能：扫描发生器、STEM 探测器以及断层扫描控制软件。本方案参考了 FEI/赛默飞世尔科技（Thermo Fisher Scientific，TFS）的命名体系，但所述概念具有通用性。TFS 的专有软件已在 JoVE 中针对透射电子显微镜（TEM）24 进行过描述，其 STEM 操作非常相似。
我们假设显微镜已由服务团队或经验丰富的工作人员预先校准，且可通过加载文件调用镜筒校准。微调称为直接校准，在TFS显微镜中可存储于所谓的FEG寄存器中。直接校准包括旋转中心、倾斜轴心、衍射校准以及对聚光镜像散的补偿。这些调整需迭代进行。请注意，TFS显微镜具有独立的纳米探针（nP）和微米探针（µP）模式；对于给定的聚光镜光阑，这两种模式分别在透射电子显微镜（TEM）中提供具有平行照明的较窄或较宽视野，以及在扫描透射电子显微镜（STEM）中产生不同程度会聚（高度聚焦）的电子束。其他制造商则采用不同的方案来覆盖会聚角的范围。
开始之前，视野 L，采样间距（像素宽度）l 的选择应根据具体研究的样本而定。例如，对于 l = 1 nm/像素，一幅4,000 × 4,000像素的图像将覆盖4 µm的视场2 应选择合适的参数。分辨率在最佳情况下为空间采样间隔的两倍，即2 nm，因此探针直径d应与此相匹配。探针角度的校准不在本实验方案的范围内，因此我们假设已有现成的表格或屏幕读数可供参考。探针直径近似等于电子波长除以半收敛角（以弧度为单位）：d = λ/θ。对于300 keV电子，波长λ为0.002 nm；对于200 keV电子，波长λ为0.0025 nm。因此，当θ为1 mrad时，对应的束斑直径分别为2 nm或2.5 nm。
本方案按照复杂程度逐步递进。首先进行STEM成像，该步骤依赖于显微镜制造商的软件；随后获取倾转系列图像，此过程我们使用SerialEM软件。许多读者无疑已熟悉SerialEM，因此后续更复杂的操作将更容易掌握。无需严格遵循此处所述的步骤顺序。与自动化相关的改进可直接应用于STEM，同样也适用于TEM。经验丰富的用户可能会逆向执行该方案，首先进行荧光图谱的相关定位，然后设置批量断层成像。有关SerialEM的更多详细信息，可参阅其详尽的文档和教程库，其中包括一篇关于自动化最新进展的近期JoVE文章25。
方案
1. 扫描透射电子显微镜（STEM）设置
- 初步比对：加载柱状比对文件，然后打开 柱阀若使用侧入式冷冻载样杆，请打开 冷冻防护罩从透射电子显微镜（TEM）模式开始。电子束应出现在屏幕上。若未出现，降低放大倍数。
- 通过按下控制面板上的按钮，将显微镜调整至齐焦位置。
- 将荧光屏的点大小设置为便于观察的值（例如，6），可通过显微镜直接观察或使用内置相机（取决于显微镜型号）进行观察。
- 将显微镜设置为STEM模式，并确认聚焦使用的是聚光镜（强度）而非物镜。设定齐焦焦点。然后退出衍射模式以进行初始调整。
- 确保电子束未被遮挡。降低放大倍数，直至电子束出现在屏幕上。调节电子束偏移至中心位置，并逐步增加放大倍数至约70kx，同时保持电子束位于中心。
- 插入所需的聚光镜光阑，通常 50 µm检查光圈居中情况。轻微前后转动调焦旋钮时，光斑应均匀地扩大和缩小，但位置保持不变，如同一个平面切割一个假想的垂直沙漏。如果光圈未居中，照明区域将发生侧向偏移，如同沙漏倾斜一般。
- 将光束聚焦并按下 强度列表聚焦 （如果可用）在比对选项卡中进行操作，或返回至如1.2所述的正中焦点。重新调整光束位置至中心。
- 调整旋转中心。将焦点步进轮调至最小值或最小值上方一步，使光束脉冲轻微闪烁，并确保在焦点上下移动时保持静止。
- 选择支点并使用 X 和 Y 调整将两点对齐。
注意：如果 TFS 仪器上安装了相位板，则仅应使用 X 调整。 - 轻微散焦，调节聚光镜消像散器使光斑呈圆形。反复通过焦点上下调节以优化；在穿过焦点时，光斑不应有向某一方向拉长的倾向。
- 归一化透镜。然后，在使用束流偏移保持光斑居中的同时，逐步增加放大倍数至约240kx，并重复旋转中心和支点调整（步骤1.6–1.8）。
- 返回衍射模式。荧光屏上应呈现一个均匀的圆盘状光斑。此时，相机长度（CL）实际上控制着到探测器的光学距离，类似于X射线晶体学中的情况。调节相机长度，观察圆盘随之收缩和扩大，仿佛屏幕位置在向样品靠近或远离。该锥形光束代表明场（BF）照明。
注意：每个CL均需调整衍射对准，以使投射光束对准中心轴。通常无需对所有CL进行精细调节，只需调节用于检测的一个（或少数几个）即可。 - 在高倍镜下启用STEM模式。
- 如果具备明场扫描透射电子显微镜（BF STEM）探测器，应首先使用该模式。将样品台移至无样品的孔区，利用所需的明场条件（CL）调节衍射对中，使电子束居中。
- 许多显微镜仅配备有环形暗场（HAADF）探测器；但有一种技巧可将其用作明场（BF）探测器。首先， retract 探测器，按照上述直接对准方法使电子束居中，插入物镜光阑，通常使用较小的光阑，例如 20 µm, 调整其位置以均匀包围光束。（最简便的方法是插入样品或测试网格，观察照明光周围是否出现光晕）。然后使用衍射对准功能将光束偏移轴线并移至探测器区域。在观察屏幕上的光束时插入并 retract 探测器，以确认光束被探测器遮挡。
- 在显微镜软件中启动扫描，调节亮度和对比度（B/C）设置，使电子束关闭时信号接近于0，而全照明照射到探测器时信号接近饱和。利用显微镜显示界面辅助调节。由于这些参数的调节可能存在意料之外的耦合关系，应多次重复调整过程。
- 在高倍放大模式（SA 模式）下将显微镜调回相对较低的放大倍数，但不进入低倍（LM）模式。
- 记录屏幕电流以供后续参考（见步骤 3.1.1）。与透射电子显微镜（TEM）相同，可通过调节电子枪透镜和束斑尺寸设置来改变电流，数值增大对应电流减小。
- 此时，保存一个 FEG 寄存器，以便恢复至标准值。
注意：该设施可预先配置一组默认的 FEG 寄存器，以便用户从一个可正常工作的配置开始操作。
2. 放置样本
- 在 LM TEM 模式下，确保载网不透明。找到一个网格方格以进行初始调整。选择一些空白区域、孔洞或破损的网格方格较为方便。记录载物台位置，以便能够方便地返回。
- 将样品调整至等心高度。有多种方法可实现此操作。例如，使用载物台摆动功能倾斜载网，同时沿 Z 轴方向调节样品高度，直至图像不再发生横向移动。或者，在观察屏幕上标记某些特征，将载物台倾斜至 30°，此时特征会横向移动。调节样品高度使其回到原始位置。提高放大倍数或倾斜角度以进一步优化。完成后返回至 0° 倾斜角。
- 返回 STEM 模式并插入 STEM 探测器。切换至最低的高倍放大（SA）模式。确保计算机屏幕上可观察到图像。快速扫描以避免不必要的电子束曝光；通常扫描速度为 1 µs/像素或更快。注意，当扫描速度过快时，图像左侧边缘可能出现畸变（见 图 2）。
- 按下 等心聚焦 按钮，提高放大倍数，并在扫描过程中精细调节聚焦。建议使用显微镜软件提供的聚焦放大镜功能以提高精度。
- 调节聚光镜像散。最精确的方法是使用 Ronchigram 法。将电子束置于样品较薄区域，聚焦于透射束在样品两侧阴影图像之间发生发散的点。然后调节聚光镜调谐，使中心圆盘呈圆形。此操作需要一定练习，尤其对于低温样品更为困难。
注意：另一种方法是寻找一些金颗粒（常用于断层成像中作为对齐的标记物）。提高放大倍数并上下调节焦距，调节像散使金颗粒在任意方向均保持圆形而不拉长。 - 进入 LM STEM 模式并继续扫描以寻找感兴趣的区域。如有必要，在此阶段大致重新调整探测器 B/C 设置（参见步骤 1.13.3）。
3. 采集图像
- 估算记录所需的剂量。经验法则是，目标剂量为 100–150 e-/Å2 对于整个断层图像，需检查每个样本的剂量耐受性。以安培（A）为单位的电流除以单个电子所带电荷量，即表示电子数量。-/s，乘以曝光时间 T，以秒为单位，并除以视野面积 Å2为方便起见，将屏幕上读取的电流单位表示为纳安（nA），视野宽度单位为微米（μm），帧曝光时间单位为秒（s），并配以适当的换算因子：
该数值应乘以倾斜次数，以获得系列中的总曝光量。对于 例如， 与 a 电流 I = 0.04 nA，一个电场 L = 4 µm，曝光时间为12秒，我们获得1.9 e-/Å2 每倾角，或约110 e-/Å2 用于一系列 61 个投影。 - 将载物台移回孔位（或缩回网格），通过调节束斑尺寸和/或枪透镜参数来调整束流，直至达到所需的荧光屏电流。若测量值为0，插入更大的C2光阑以增加电流。随后，将测量值除以光阑直径比值的平方进行校正，最后换回较小的光阑。
- 根据步骤1.13.3优化B/C设置，最后将样品台返回至目标区域，在成像条件下重新检查直接对中和像散。
- 获取测试图像。
4. 使用 SerialEM 进行断层扫描
- 在显微镜计算机上启动 SerialEM 服务器（SerialEM 通常安装在另一台计算机上）。然后，打开 SerialEMSTEM 在 SerialEM 中显示为一个相机，具有相同的界面。请确保通信设置与系统配置正确匹配。例如，显微镜选项卡应显示正确的放大倍数。如果无法正常显示，请立即停止操作并进行故障排查。
- 找到相机和脚本标签并打开 设置确保选择STEM相机，并为每种模式选择合适的像素合并（binning）和停留时间。确保相应的探测器（或多个探测器）出现在 "通道以获取" 左下角的框。按下 获取 在底部进行测试。如果无任何反应或光束未解除消隐，请勿继续操作。立即停止并检查通信连接。
注意：这些模式的使用方式与透射电子显微镜（TEM）断层扫描类似。二值化（binning）是为了与TEM兼容而采用的一种技术手段。关键参数是像素数量；不同的显微镜系统采用不同的二值化方式以达到相同的像素数。- 观察和搜索应采用快速扫描，像素相对较少（例如，512 × 512 像素，1 s）。
- 聚焦通常是在小区域内进行快速成像。因此，在低剂量模式下，选择聚焦模式的放大倍数不同于记录模式，有助于提高准确性。保持光斑尺寸不变。
- 在记录模式下，使用上述曝光估计中选择的参数。如果可用，还应选择 动态聚焦，该技术通过逐行校正倾斜图像中的焦平面。
- 为方便后续操作，选择预览时的 binning 设置应与“查看”时的设置相同（参见增强功能 #1，步骤 5.5）。图像尺寸（像素数量）不必相同。
- 使用试用模式可在采集过程中保持记录区域居中。该模式可能与查看模式相似，但需注意确保画面左侧无明显扫描畸变（参见 图2 例如，在低剂量模式下，试拍时的放大倍数可能与记录模式下的放大倍数不同。
- 立即使用拼接模式进行网格扫描。该模式应具备足够的像素密度以发现感兴趣区域；建议设置为 512 × 512 或 1024 × 1024。确保图像质量良好，并具有适当的动态范围（可通过图像显示控件观察），因为此模式用于定位样本区域。
- 保存设置文件，以便这些选项在下次会话中作为默认设置保留（若程序崩溃，下次会话可能很快发生）。
- 测试图像漂移和载物台漂移校准。在微束（或纳束）模式下，单击 查看图像，将鼠标悬停其上，按住按钮，并沿对角线方向拖动约四分之一视野距离，然后获取另一幅图像。这些图像应完全重叠。重复此操作，在保持 Shift 键 按压（以强制阶段移动）。图像应能良好重叠，尽管可能精确度稍低。
- 进入LM模式并测试载物台移动。如果这些测试失败，请停止操作并进行故障排除，否则后续步骤将无法进行。
- 制作整个网格的透射电镜（TEM）拼接图。此操作也可在透射电镜中完成。
- 切换至最低放大倍数的STEM模式，通常约为185倍，以确保图像不被光阑遮挡。
- 点击 导航菜单 > 开放然后，单击 导航菜单 > 导航选项 > 取消选择将地图转换为字节.
- 选择 导航菜单 > 拼接图像 & 载网 > 设置全蒙太奇将打开一个菜单。需要勾选的选项为： 移动载物台而非移动图像，若导航器已打开，则从每个拼接图生成地图 和 使用Montage定位，而非记录参数图像网格应大致为 6 x 6 或 7 x 7。需查看待记录的总面积。如果所需图像过多，则显微镜可能无法正确读取放大倍数（图3。停止并检查。
- 开始 Montage 采集时，按下 开始 在 蒙太奇控制 或 蒙太奇 在……下方 相机 & 脚本. 另一个菜单将打开以供选择 文件参数：mrc，以整数形式存储，然后在另一个对话框中选择存储文件的名称。请确保将数据存储在合适的数据区域，而非SerialEM自身的用户设置目录下。建议不要将大量数据存储在作为系统盘的C盘中。
- 当采集完成后，拼接图像将显示在主窗口中（图4现在可以使用导航器上的标记和点在网格上进行导航，就像在透射电子显微镜（TEM）中一样。
- 重新检查像散校正。通常，快速扫描一个小区域，并结合焦距进行调整，使点状特征（如金纳米颗粒）在高倍率下进出焦点时始终保持完全圆形（类似于扫描电镜中的观察），即可满足要求。较为保守的做法是在固定像散前，重复执行步骤1.5–1.8中的直接对中操作。
- 将高倍成像与LM拼图对齐。
- 转到光学显微镜拼接图像中具有某些易于识别特征的位置。添加一个点，然后单击 导航器窗口 > 添加点，点击该功能。再次按下（停止添加）以停用。
- 在最低的高倍（HM）放大倍数下拍摄一张观察图像或试拍图像，并找到指定的项目。将标记放置在该位置（绿色十字），同时在导航器窗口中高亮显示相应点。 导航菜单 > 转换至标记物…在打开的对话框中，选择 所有地图 和 保存 Shift，如图所示 图5.
- 通过移动载物台至其他位置，并验证HM图像中特征是否与LM拼接图中选定的相同位置对齐来进行测试。如果在HM图像中无法看到该特征，则LM与HM模式之间的偏移可能过大。此时，应在一个更大的区域上创建多边形拼接图。点击 导航器窗口 > 添加多边形，选择若干点，然后单击 添加多边形 再次关闭。点击 导航菜单 > 拼接与网格 > 设置多边形拼接和拼接控制 > 开始然后，如上所述找到对应的点并单击 切换至标记….
- 设置低剂量模式。
- 打开 低剂量对照 标签并检查 低剂量模式 盒子
- 检查 持续更新 并前往 查看选择此模式下的显微镜放大倍数，通常为最低或次低倍数。依次选择后续各模式，并设置相应的放大倍数。记录模式的放大倍数应设定为达到所需的像素尺寸，而聚焦模式的放大倍数应足够高，以清晰分辨定位标记或其他高对比度的聚焦特征。随后立即取消勾选 持续更新.
注意：试验模式可设置为与记录模式相似，此时必须将追踪区域从记录区域移开，以尽量减少曝光；或者设置为低倍放大，涵盖周围大部分区域。 - 拍摄视野图像，并使用“定义区域位置：试验”来设置试验位置。
注意：建议 #1：由于采样区域和时间的变化，低倍率试验中增加的曝光量可能极小。只要网格条不进入视野，这种追踪方法通常更为可靠。建议 #2：也可通过调整光斑尺寸来调节不同模式（如聚焦模式）下的剂量。为了保持显微镜光学设置的稳定性，我们建议不要更改光斑尺寸，而应保持其适用于“记录”模式的设定，必要时仅通过调整曝光时间来适应更快的扫描模式。 - 点击 低剂量对照选项卡 > 前往：Rec.，然后点击 导航菜单 > 开放成像状态 > 添加当前状态。为其命名，以便于快速调用（例如， µP STEM 用于微探针 STEM）。可为不同任务定义各种状态。
- 将载物台移动至适合断层扫描的感兴趣区域（关于 Navigator 使用的更多说明见下文）。
- 在导航器中单击以添加一个点 导航器窗口 > 添加点.
- 通过选择优化欧中心高度 任务 > 居中性 > 粗糙。导航窗口 > 更新 Z.
- 设置聚焦区域和试验区域。首先获取一张视野图像，然后在其中 低剂量对照 标签，位于下方 定义区域位置，选择 聚焦或试验沿倾斜轴调整两个区域的位置。应聚焦于 不重叠 记录区域。
注意：需注意存在一定程度的过冲现象，尤其在左侧边缘较为明显，因此切勿将两者紧邻设置于记录区域。可通过在测试区域以记录倍率反复扫描，然后降低放大倍数以获得更宽视野的方式，评估过冲的范围。
- 作为额外保险措施（有经验者可选），将载物台倾斜至+60° 然后 -60°每次拍摄视图或预览图像，以确保栅格条不会进入绿色显示的记录区域视野。
- 设置倾斜系列。
- 单击以打开一个新文件来保存数据 文件 > 打开新建 并选择一个文件名。选择 倾斜系列菜单 > 倾斜系列设置 (图6）。故障排除：如果 打开新建 按钮为灰色时，请检查上一个倾斜系列是否已终止。若未终止，请点击以终止 倾斜系列 > 终止.
- 设置倾角的极限值 倾斜至 和 结束 盒子，通常-60° 和 +60°以及增量，通常 2°.
- 对于剂量对称模式（推荐使用——确保低剂量模式仍处于激活状态），请检查 从 ___ 向两个方向运行序列空白值通常为0，但可用于补偿预先倾斜的FIB薄片（例如，在 20°).
- 为简便起见，检查 保持曝光时间恒定更改此参数需要重新调整曝光量计算，还可能干扰代数重建（如 ART/SART/SIRT），因为这些方法会将投影强度与原始数据进行比较（见步骤 7.1）。
- 检查 跳过自动对焦较小的半收敛角（例如 1 mrad）意味着景深很长，可能无需进行聚焦。作为测试，可在 0°，倾斜至 60° 或 -60°，并推动 记录保持聚焦主要取决于精确的等中心高度。对于较大的会聚角度，可能需要在序列采集过程中进行调焦。此时，先获取一个视图，并在该过程中 低剂量对照 标签，定义区域位置和焦点，并调整焦点区域。
- 初始和最终操作：如果已准确完成对中高度调整，则无需重复此步骤。取消勾选 系列结束时关闭柱阀门 除非有充分理由不这样做。
- 为追踪控制参数，有多种选择。对于无人值守的数据采集，首要任务是避免程序因等待用户输入而停止。请使用推荐设置：当丢失视野百分比超过5时，重复记录。随后进行追踪并检查 与预览对齐后再获取新的轨迹参考 和 获取新的轨迹参考 如果记录的对齐偏差超过2%，则对于有人值守的数据采集，应采用更严格参数，以避免损失数小时的仪器使用时间。
- 准备就绪后，按下 GO 窗口底部。最后，选择 倾斜系列 > 终止.
5. 使用导航器进行多点批量采集（增强功能 #1）
注意：该方案较为基础，原因如下：a）其步骤与透射电子显微镜（TEM）完全相同；b）新型工具正在不断出现，可能导致完整的描述很快过时。
- 将完整的网格蒙太奇加载到主窗口中。
- 选择若干有前景的区域。点击 添加点 并将样品加入选定网格方格的中心。点击 添加点 再次按以停用该模式。
- 在低剂量成像模式激活后，选择 导航器窗口 > 检查采集 和 新建文件 在 项目 对于每个选定的方块，将打开一个文件属性对话框（图7）然后选择文件名。选择 拼接图像，然后在 蒙太奇设置 对话图8），检查 在低剂量模式下使用视图参数 并制作一个足够大的网格以覆盖该正方形（约 100 x 100 µm).
- 点击 导航菜单 > 获取项目 并选择用于比对的参数。最重要的是，在 主要操作，检查 制作导航图，然后 粗略齐焦性 和 精细同轴度，然后按压 开始 (图9）。对于200目网格，这将生成覆盖整个方格区域的大致图谱（图10)
- 准备进行断层图位置选择。通过点击打开一个新文件 文件 > 打开新建. 为其指定一个文件名（例如，AnchorMaps.mrc）。
- 低剂量模式启用后，输入 相机 & 脚本 > 设置 并确保“视图”和“预览”的二分之一像素合并设置相同（否则无法保存在同一文件中）。
- 通过点击方形地图中的点进行访问 导航器窗口 > 前往 XYZ.
- 使用标记选择第一个断层图的位置。拍摄预览图像，并通过右键拖动来优化位置。然后，选择 导航器窗口 > 新地图，然后单击 是 保存到对话框中。接下来，获取同一区域的视图图像，并再次保存为新地图。确保视图地图处于高亮状态，并进行检查 锚定状态 在右上角的导航器窗口中。
- 选择第二个位置，再次进行预览并如上所述调整位置，然后此次进行推注 锚定图 在导航器窗口中。这将把预览图和视图作为新地图保存在导航器中。
- 对所有目标位置重复步骤 5.5.4。通过选择点并按下按键，在不同网格方格之间移动 前往 XYZ 在导航器窗口中。
- 作为参考焦点，选择网格中清晰的区域，手动或使用自动对焦仔细调焦。按下 重置离焦 在显微镜控制面板上，通过点击创建 SerialEM 脚本 脚本 > 编辑 > 编辑 15 （或其他空闲编号），并输入两行：ScriptName SetDefocus，以及 SetDefocus 0。
- 在导航器窗口中，选中第一个位置（预览或查看）。按下 Shift-T 然后高亮最后一个位置，再次按下 Shift-T文件属性对话框将打开。选择要保存的单帧图像和参数，包括文件名。可编辑文件名，但需保留末尾的项目标签。
注意：文件名以数字结尾时，将自动更新以用于后续的倾转系列。建议使用该选项 导航菜单 > 导航选项 > 在文件名中使用项目标签. - 接下来，倾斜系列设置菜单将自动打开。按之前的方式填写（图6），但不要选择优化离轴聚焦（Refine eucentricity）。此时，Navigator 中的预览点将标记为 TS。可使用 Navigator 窗口项目列表上方的按钮返回此菜单。
- 选择 导航菜单 > 获取项目这一次，选择最终数据的参数。选择 主要操作：获取倾斜系列图像 并选择 管理杜瓦瓶/真空装置, 重新对准至样品，精细调整同心度，以及 在执行操作前运行脚本，其中S运行脚本：SetDefocus. 选择常规选项： 发生错误时无消息框 和 结束时关闭柱阀门，然后点击 GO (图11）。SerialEM 现在将依次访问所有锚点图，并在每个位置记录倾斜系列图像（图12).
6. CLEM 图谱配准（增强 #2）
- 如果尚未完成，请将完整的网格拼接图载入主窗口，然后通过点击 窗口 > 新建窗口 创建一个新窗口，并为其命名。请注意，完整的网格拼接图显示在配准 1 中。
- 通过点击 导航器菜单 > 导入地图 导入 CLEM 图像。该图像应进入配准 2。也可以如上所述为其分配一个新的窗口。
- 检查 CLEM 地图，以确定其相对于完整网格拼接图的相对旋转角度。在网格条清晰可见的地图上进行此操作最为方便。请注意，地图可能还发生了翻转。如有需要，可使用 导航器菜单 > 旋转地图 并结合“翻转”功能进行粗略对齐。
注意：下一步操作也可校正翻转，但提前完成翻转会使后续步骤更加简便。此步骤可重复进行，直至对齐效果满意为止，但无需达到精确对齐。 - 添加配准点以实现精确对齐。在其中一个窗口中放置若干对应点，然后在另一个窗口中放置相应的点。对于每个这样的点，请在导航器窗口最上方勾选 配准点。对应的点将按升序编号，并分别以 R1 或 R2 标注，表示网格拼接图或导入的地图。
注意：使用定位网格可使此步骤变得非常简单。否则，请选择稳定的特征点，例如中心标记或网格方格的角点。原则上，三个点足以实现粗略对齐，但更多点有助于补偿拼接图构建过程中的微小差异。 - 如果需要 CLEM 地图的多个通道，例如不同的荧光颜色，或无明场背景的荧光图像，请按照上述第 6.2 步导入这些图像，并将它们的配准设置为 2。这样，它们将继承第一幅地图的配准点。
- 通过 导航器菜单 > 变换项目 应用配准。现在所有地图上都将显示对应的配准点，这些地图将列在配准 1 中。为了进行视觉对齐，请点击 导航器菜单 > 旋转地图。请注意，当从导航器窗口加载地图时，除非勾选了 加载时旋转 选项，否则地图不会自动旋转。但始终可以通过导航器窗口手动旋转。
- 现在应能够在荧光图上放置标记或点，并将载物台移动至网格上的对应位置（图 13）。
7. 三维重建
- 其基本步骤与透射电子显微镜（TEM）断层扫描相同：首先对倾斜系列图像进行对齐，然后通常采用反投影法进行重建。目前有多种软件平台可供选择，数据处理方式与TEM数据类似，但无需进行CTF校正。
- 可应用强度归一化方法，以增强高倾斜角度投影图像的贡献，或平衡采集过程中照明条件的变化，但需注意这会影响定量信息的准确性。例如，IMOD26 效果良好，而 AreTomo27 在无标记物对齐方面非常有用；当存在标记颗粒时，ClusterAlign28 可以将它们作为颗粒簇而非单个斑点进行追踪，这对于扫描透射电子显微镜（STEM）数据尤为有用，因为在高对比度特征下，单个斑点可能丢失或被遮蔽。
- 重建后可进行三维去卷积29，以增强对比度并降低噪声。重建完成后，可通过标准方法（如正交切片或等值面分割）展示STEM体积数据。值得注意的是，STEM图像的强度分布为单极性，不存在传统相位衬度TEM中常见的反差反转或傅里叶条纹 。一种有趣且通用的STEM断层图表示方法是反转明场 （图14），其效果类似于“X射线视觉”，能够透过透明化的细胞观察到目标致密结构30。
结果
在STEM中制备的完整网格拼图显示了含有目标细胞的区域（图4）。请注意，该图像为暗场成像，因此无细胞的孔洞呈暗色。细胞部分区域较亮，这是由于电子被散射至HAADF探测器所致。在最厚的区域（通常位于中心或靠近网格条处），对比度再次变暗，这是由于多重散射导致电子散射角度超出了探测器的接收范围。在实际操作中，这些区域对于断层成像而言过厚。
下一步涉及中等放大倍数的图像（图10）。这类图像通常被称为中倍拼接图或方格图，其中“方格”指的是网格划分而非图像形状。即使在最低倍的微探针STEM模式下，这些图像也以拼接方式获取。在导航窗口中点击相应项目，可将该图像加载至主窗口。在此区域内选择用于断层扫描成像的特定位置。使用预览模式在记录放大倍数下定位目标区域。需要注意的是，预览与记录模式之间可能存在横向位移，具体取决于扫描速度。在此区域可记录单个倾转系列。例如，线粒体通常可在预览和记录图像中被识别（图12）。
对于批量断层扫描，载物台将围绕载网移动，可能无法精确返回到相同位置。锚定图通过将预览图像与较低放大倍数的视图进行匹配，确保所需记录区域能够被可靠地重新识别，即使载物台发生了位移。PyEM23,24 提供了一种更快的替代方案，虽然目前尚未纳入标准安装，但强烈推荐使用。
在CLEM方法中，可利用荧光图谱来确定用于断层成像的目标区域。荧光图像需在外部获取，并必须与完整的载网拼接图进行配准。为便于识别，最好使载网的栅条和孔洞可见，因此可在导入前预先制备荧光图像与明场图像的合并图，例如使用GIMP（https://www.gimp.org）或ImageJ31软件完成（需注意ImageJ会反转垂直轴）。当荧光信号的动态范围较大时，可能难以在不发生饱和的情况下生成此类合并图像。此时，可分别导入两幅图像，然后按照所述方法进行配准（图13）。通过该方式，在Navigator窗口中的荧光图上选定某一点后执行“转至XY”操作，即可将透射电镜中所安装载网的载物台移动至对应位置。需注意，拼接图（或荧光图，若其本身也为拼接图）制作过程中的微小不一致会导致位置的轻微偏移；因此，为获得最佳精度，应将荧光图像专门针对方格图重新进行配准。通常可根据支持膜上的孔洞或与明场光学图像共有的特征，通过肉眼观察完成该配准过程。
倾转系列的重构结果生成一个三维体数据（图14）。本示例的像素尺寸为2.042 nm，对应的视场范围约为4 µm。由于磷酸钙沉积物（橙色箭头）的原子序数高于周围区域，因此特征明显。微管（红色箭头）可在整个视场中被追踪。线粒体的内膜和外膜（绿色箭头）也清晰可见。肌动蛋白可表现为束状结构或单根细丝。为了获得更接近各向同性的分辨率，可对重构结果进行去卷积处理。
图1：透射电子显微镜（TEM）与扫描透射电子显微镜（STEM）的比较。 在透射电子显微镜（TEM）中，样品视场由近似平行的电子束照射，物镜在相机上形成放大的图像。对于冷冻电镜（cryo-TEM），物镜光阑被打开以允许散射的电子波（红色虚线）通过，这些散射波与未散射的电子波（绿色）在离焦条件下发生干涉，从而产生相位衬度。而扫描透射电子显微镜（STEM）则通过聚焦电子束在样品上逐点扫描，并以像素为单位收集散射电子。多个探测器可收集不同散射角度的电子。本图改编自30。请点击此处查看此图的放大版本。
图2： 由于扫描速率过高导致左侧图像失真的示例。请注意由黄色箭头标记的失真区域，以及Quantifoil上变形的椭圆形孔洞。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：全网格拼接的拼接设置对话框。 选择X和Y方向的放大倍数和拼接图像数量，使总面积达到约2,000 µm，以获得覆盖大部分网格的图像地图。同时选择“移动载物台”而非“移动图像”，并选择“使用拼接图谱”而非“记录参数”。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：STEM模式下采集的完整低倍GridMap图像。 在暗场图像中，破损区域呈现为完全黑色。深灰色区域可能过厚且玻璃化效果不佳。适合进行断层扫描的区域在此扫描图像中呈白色或浅灰色。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：移至标记操作。 在低分辨率图中使用“添加点”功能标记一个可识别的物体（本图中标记了38个点）。注意低分辨率图（绿色圆圈）与中等分辨率图（橙色圆圈）之间的偏移。随后，使用标记工具对该物体进行标记（绿色十字，红色圆圈），并启动“移至标记”对话框。所选选项将以相同偏移量移动所有245倍放大的图。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：STEM倾转系列的倾转系列设置对话框。 采用剂量对称模式，从-60°到+60°，步长为2°。由于使用低汇聚角时景深较大，因此跳过自动聚焦。无需优化同心度，因为此前已完成该步骤。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：中等分辨率图谱的文件属性对话框。 保存为 MRC 堆栈文件，选择整数格式，并将附加信息保存在 .mdoc 元数据文件中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：保存中等分辨率图谱的拼接设置对话框。 对于200目网格上的一个边长为90 µm的正方形区域，建议总面积至少为90 µm × 90 µm。选择“移动载物台”而非“移动图像”，并在低剂量模式下使用“视图参数”。请点击此处查看该图的放大版本。
图9： 记录中等分辨率图谱。 在“项目”对话框中获取用于记录中等分辨率图谱的设置。选择“Mapping”（成像）、“Acquire and save image or montage”（采集并保存图像或拼图），并勾选“Make Navigator map”（生成导航图）。在“主任务之前或之后的任务”中，选择“Rough and Fine Eucentricity”（粗调和精调同心度）。若无需辅助，可选择“当出现错误时不显示消息框”和“结束时关闭镜筒阀门”。 请点击此处查看此图的放大版本。
图10: 中等分辨率图谱图像 中等分辨率图像（方形图），通过3 × 3拼接在STEM模式下采集。用于数据采集的两张中等分辨率锚定图以蓝色方框标出。比例尺 = 10 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图11： 批量倾转系列数据。 在“采集项目”对话框中设置批量倾转系列数据的采集。对于倾转系列数据采集，选择“最终数据”并点击“采集倾转系列”。在“主任务前后任务”中，勾选“管理杜瓦瓶/真空”（在“设置”菜单中选择适当参数）、“对项目重新对齐”、“精细同心度”以及“操作前运行脚本”。在“常规选项”中，勾选“发生错误时无消息框”和“结束时关闭柱阀”（见5.14节）。请点击此处查看该图的放大版本。
图12：线粒体STEM倾转系列在0°倾角下的图像。 橙色箭头指示磷酸钙沉积物（基质颗粒），绿色箭头指示嵴，红色箭头指示15 nm金标记物。比例尺 = 500 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图13：配准的冷冻关联显微图谱。 （A）中等分辨率的STEM图（方形图，26 Å）已与（B）低分辨率STEM图、（C）明场通道冷冻荧光显微图和（D）GFP通道冷冻荧光显微图进行配准。九个配准点（标签4-21）显示在（E）导航图中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图14：体渲染。 对SIRT样（30个循环）滤波后的断层图像在不同深度进行的体渲染，分别为（A）60 nm和（B）40 nm厚的切片。像素尺寸为2.048 nm，对应的视场约为4 µm。请注意，与图12相比密度呈反转状态，即高强度结构显示为亮色。橙色、白色、红色、绿色和浅蓝色箭头分别指示磷酸钙沉积物、核糖体、微管、线粒体内膜和外膜以及肌动蛋白丝。比例尺 = 500 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本方案旨在帮助生命科学领域的显微成像研究人员，获得细胞中常规透射电子显微镜断层成像难以触及区域的细胞器三维结构信息。相同的方案也可用于塑料切片的扫描透射电子显微镜（STEM）断层成像，且对曝光条件的要求更为宽松。本方案应被视为一个起点，而非不可更改的硬性规定。事实上，STEM 的优势在于其灵活性；操作该技术并不存在唯一正确的方式。
需要强调的是，STEM 本身仅指扫描探针，并不定义成像方式。对比度主要取决于探测器的配置。较为简单的方法采用具有轴对称结构的探测器，例如位于光轴中心的圆盘形探测器或环绕光轴的环形探测器。通常情况下，当入射照明直接到达探测器时，我们记录到的是明场（BF）图像，其中（电子散射的）样品呈现为暗色；相反，当探测器仅收集散射电子时，我们记录到的是暗场（DF）图像，其中致密的样品呈现为亮色。当具备合适的硬件条件时，SerialEM 可同时采集并记录这两种信号。此外还存在更为复杂的探测器配置，范围从多段式探测器到全像素化相机。例如，通过分析离轴探测器单元之间的差异，可实现相位衬度成像32,33。对每个像素采集完整的二维散射（衍射）图样，构成了所谓的 4D STEM 技术34，该技术能够从同一原始数据中重建出多种图像对比度。四维 STEM 可实现电子叠层成像（electron ptychography），从而提供另一种获取相位衬度的途径35。
我们重点关注了我们认为对细胞器、完整细胞或微米级厚细胞切片研究最有用的STEM成像模式。这具体涉及使用较小的照明会聚半角进行明场成像，并在探测器端采用相对较大的收集角。较小的会聚角可提供较大的景深，使得在整个倾斜系列过程中整个样品始终保持聚焦19。在实际操作中，配合性能良好的显微镜载物台，这种方法甚至可以消除采集过程中调焦的需要。代价是分辨率有所妥协，如本方案第3节所述。我们建议使用4k图像，探针尺寸约为2 nm，当像素间距为1 nm时，可实现4 µm的视场。然而，强烈建议读者根据实际情况进行优化尝试。第二个考虑因素来自探测器方面。当照明光斑未完全充满同轴明场探测器时，相位衬度被抑制，而散射（振幅）衬度占主导地位；这一条件被称为非相干明场衬度36。问题在于应以多大比例使光斑小于探测器面积，答案取决于样品本身。非常薄的样品在探测器被完全充满时（即收集角与照明角匹配）可获得最佳衬度，但较厚的样品会将全部强度散射掉，导致信号噪声大且衬度差。一个实用的经验法则是：样品越厚，明场探测器的外截止角应越大21。探测器的尺寸和位置当然是固定的，因此需通过调节相机长度来调整衍射光斑的大小，如第1节所述。如果探测器放大器设置使得在直射照明下信号填满动态范围但不饱和（1.12.3），则可逐步增加相机长度，直至获得合理的信号强度和衬度。同样，鼓励读者进行实验探索。可以说，其中的关键在于角度的调控艺术。
另一个在方案中未讨论的参数是显微镜的加速电压。照明电子与样品的相互作用在较低电压下会更强。在其他条件相同的情况下，我们预期较低电压下可获得更高的对比度。另一方面，样品内多重散射的出现限制了可用样品的厚度，因此较高的电压允许使用更厚的样品。然而，这些效应相对较为细微。迄今为止，我们在使用200 kV和300 kV加速电压下的经验结果相似。
关于STEM在分辨率方面能达到的水平，这再次取决于样品和探测器的配置。采用单颗粒分析方法，通过环形暗场STEM可将铁蛋白上的金属离子定位到几埃的精度37。最近，利用积分微分相位衬度（iDPC）STEM32以及叠层成像术（ptychography）35获得的图像，已实现对病毒和蛋白质样品的亚纳米级分辨率。然而，对于厚细胞样品中的独特结构，结合本文所述方法，实现如此高的分辨率并不现实。最佳分辨率等于探针直径，而探针直径与半收敛角相关。其他因素会降低分辨率，特别是为了获得大视场而采用较粗的像素采样、倾斜系列中的未对准，以及透射过程中探针束的扩散。所得图像与塑料切片断层成像结果相当吻合。例如，在本文所述的实验条件下，应能够清晰观察到微管的中空核心结构，但无法分辨单个原纤维。
总之，STEM 方法和硬件目前均处于发展阶段。我们可以预期，成像技术的创新也将影响断层扫描技术，从而将 STEM 推入以往其他技术无法触及的研究领域。我们预计，基于现代光学超分辨率方法的关联冷冻荧光成像技术与 STEM 的融合将尤其富有成果。细胞器的尺度（100–1,000 nm）正是这些新兴方法的理想研究目标。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们非常感谢 SerialEM 软件包的作者和维护者 David Mastronade 与 Günther Resch 提供的持续而坚定的支持。P.K. 的研究由奥地利科学基金（FWF）通过 Schrödinger 奖学金 J4449-B 资助。为实现开放获取，作者已对本投稿所产生的任何作者接受稿版本应用了 CC-BY 公共版权许可。M.E. 和 S.G.W. 感谢以色列科学基金会（项目编号 1696/18）以及欧盟 Horizon 2020 伙伴合作项目 ImpaCT（项目编号 857203）提供的资助。M.E. 感谢欧洲研究委员会（ERC）在 CryoSTEM 项目中提供的资助（项目编号 101055413）。M.E. 担任萨姆与阿亚拉·扎克斯讲席教授，并领导欧文与切尔纳·莫斯科维茨纳米与生物纳米成像中心。M.E. 的实验室受益于哈罗德·佩尔曼家族长期以来的慷慨支持。我们同时感谢欧盟提供的资助。然而，文中所表达的观点和意见仅为作者（们）的观点，不一定反映欧盟或欧洲研究委员会执行机构的意见。欧盟或资助机构均不对这些观点承担责任。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SerialEM | 科罗拉多大学 | 版本 4.0 | SerialEM 是一个用于显微镜控制和数据采集的免费软件平台。 |
| 具备扫描透射功能的透射电子显微镜 | 本实验方案基于使用多台赛默飞世尔科技公司显微镜的经验编写：Titan Krios、Talos Arctica 和 Tecnai T20-F。原则上，该方案也适用于其他厂商的设备。 |
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