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方法文章

利用人工授粉、显微观察和S-基因型分析确定柑橘类植物的自交（不）亲和性及种间（不）亲和性关系

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DOI：

10.3791/65056

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2023年6月30日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1National Key Laboratory for Germplasm Innovation & Utilization of Horticultural Crops, Huazhong Agricultural University

本文内容

摘要

本方案提供了一种快速测定柑橘品种花粉亲和性与不亲和性的方法。

摘要

柑橘利用基于S-RNase的自交不亲和性来排斥自花花粉，因此需要邻近的授粉树以实现成功授粉和受精。然而，筛选适合作为授粉树的品种是一个耗时的过程。为解决这一问题，我们开发了一种快速鉴定授粉亲和性柑橘品种的方法，该方法结合琼脂糖凝胶电泳与苯胺蓝染色。通过提取总DNA并使用特异性引物进行基于PCR的基因分型分析，可确定S基因型，从而判断花粉亲和性。此外，在人工授粉后3-4天采集花柱，并进行苯胺蓝染色处理。最后，利用荧光显微镜观察花粉管的生长情况。通过观察花粉管是否正常生长或受到抑制，可分别判断为亲和或不亲和。由于该方法操作简便且成本低廉，是确定不同柑橘品种间花粉亲和性与不亲和性的有效工具，可用于建立不亲和性类群及不同品种间的不亲和关系。该方法为合理选择适宜授粉树提供了关键信息，从而有助于新建果园的规划以及育种项目中亲本的优选。

引言

自交不亲和性（SI）是一种由遗传控制的机制，存在于约40%的被子植物物种中。在此过程中，雌蕊会拒绝与自身具有相同SI基因型的花粉，从而防止自花授粉1,2。马家柚子是中国江苏省的地方品种，具有果实大、果肉粉红、汁多、酸甜适口、果皮厚等优良性状3。尽管自交不亲和性促进了异花授粉，但它会对果实的产量和品质产生负面影响4，因此需要配置具有不同SI基因型的适宜授粉树，以保证坐果率和高产。目前，自交不亲和性主要分为两种类型：孢子体型自交不亲和性（SSI），以Brassicaceae科植物为代表；配子体型自交不亲和性（GSI），以Rosaceae、Papaveraceae、Rutaceae和Solanaceae科植物为代表5,6,7,8。

柑橘是世界上最重要的果树作物之一。基于S-RNase的配子体自交不亲和（GSI）系统存在于许多柑橘种质中，并对坐果率产生负面影响9。在该系统中，自交不亲和性由S位点控制，该位点是一个具有两个复杂等位基因的多态性单一位点，分别携带雌蕊S决定因子和花粉S决定因子7。雌性决定因子是S核糖核酸酶（S-RNase），雄性决定因子是S位点F-box蛋白（SLF）7。雌蕊细胞分泌S-RNase蛋白。非自身S-RNase可被SLF蛋白识别，从而通过26S蛋白酶体途径介导其泛素化并降解。相反，自身S-RNase则能够逃避SLF蛋白的识别，避免被泛素化，因而得以积累并抑制花粉管（PT）的生长10,11,12,13。

本文介绍一种可用于鉴定 S 基因型以及花粉亲和性与不亲和性程度的 体内 技术。该实验方案包括从叶片中提取总DNA，并利用 S 位点特异性引物预测 S 基因型。此外，通过苯胺蓝染色结合荧光显微镜观察，并辅以人工授粉，可提供花粉亲和性与不亲和性程度的证据。半 体内 授粉程序（即在实验室条件下进行人工授粉）14,15, 也已被用于评估自交亲和与不亲和的程度。然而，我们还采用了田间授粉后套袋的方法，以避免外来花粉污染，使花粉管在自然条件下发育。该方案简便直接，可为成功选配适宜授粉树提供必要的信息。

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方案

1. 茌苯蓝染色的准备工作

  1. 准备以下试剂和工具：授粉刷、镊子、铅笔、硫酸纸、授粉袋、自封袋、回形针、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、离心管、镊子、胶头滴管、载玻片、盖玻片、解剖刀和聚乙二醇。
  2. 准备 体外 含0.02% MgSO₄的萌发培养基4，0.01% KNO3，0.03% Ca(NO3)2，0.01% H3BO3，20% PEG-4000 和 15% 蔗糖。用 KOH 调节 pH 至 6.0–6.2。由于 PEG-4,000 难以溶解，需使用磁力搅拌器。
  3. 配制卡诺氏固定液，即无水乙醇与冰醋酸按3:1比例混合。配制FAA固定液，即40%甲醛、80%乙醇与冰醋酸按1:8:1比例混合。配制4 M氢氧化钠（NaOH）溶液和苯胺蓝溶液，后者为0.1%苯胺蓝溶于0.1 M K3PO4. 使用棕色瓶储存苯胺蓝溶液，因其对光敏感。

2. 花粉采集

  1. 提前了解实验树木（本研究为马家柚）的开花期。从开花期开始至盛花期采集成熟的未开放花朵，并放入自封袋中。花朵可在4 °C冰箱中保存24小时。
  2. 将花朵带回实验室。用镊子采集花药，置于含有滤纸的培养皿中。采集20至30朵花的花药。
  3. 将装有花药的培养皿放入28 °C恒温培养箱中干燥24小时，直至花粉粒完全干燥。有关花器官结构的详细信息，请参见Hu等9。
  4. 将干燥后的花粉装入1.5 mL离心管中。将花粉保存在密封的自封袋内，袋中放入变色硅胶（干燥剂）。封好袋子，并在袋上标注花粉品种名称及储存日期。干燥花粉可在−20 °C冰箱中保存96周16。

3. 体外 花粉萌发试验

  1. 将 300 µL 液体培养基加入细胞培养皿或 2 mL 离心管盖中，借助授粉刷将花粉均匀撒播。将花粉置于 28 °C、湿润且避光的环境中孵育 12 小时。
  2. 剪去 1,000 µL 吸头尖端顶部约 1 mm。用移液器吸取少量培养液中的花粉，转移至显微镜载玻片中央，盖上盖玻片。使用倒置显微镜和 10 倍物镜观察样品。
  3. 每组实验进行三次独立重复，每次重复使用大致相同的花粉密度17。通过肉眼控制花粉量，确保每个培养皿表面均被花粉覆盖，且各培养皿之间的花粉量基本相等。
  4. 萌发的花粉会形成花粉管，其长度约为花粉直径的两倍。从 20 个视野中计算花粉萌发率，即所有观察视野中萌发花粉所占的百分比。

4. 授粉

  1. 选择一个无风的晴天进行授粉。选取10个即将开放的充分发育花蕾，小心剥开花瓣，注意不要碰伤。
  2. 使用授粉刷将足量有活力的花粉均匀涂抹在柱头表面，注意不要损伤雌蕊。自花授粉时，使用同一植株或品种的花粉；异花授粉时，使用不同基因型植株的花粉。
  3. 用硫酸纸袋罩住已授粉的花朵，用回形针将纸袋封好，防止其他基因型花粉进入造成授粉。
  4. 在标签上写明物种名称、授粉编号及授粉时间，并将标签悬挂在授粉花朵附近的枝条上。

5. 取样、固定与保存

  1. 授粉后约3-4天取下授粉袋，将授粉后的花朵收集到自封袋中。
  2. 立即从花朵中去除花瓣、花托和子房，并将与花柱相连的柱头浸入含有新鲜配制固定液的离心管中。在4 °C条件下将柱头和花柱于固定液中孵育过夜。
  3. 次日，弃去固定液，用95%乙醇清洗柱头和花柱两到三次。
  4. 将花柱转移至70%乙醇溶液中，确保样品完全浸没于溶液中。此阶段的花柱可在4 °C下保存1-2个月。

6. 苯胺蓝染色

  1. 将保存在70%乙醇中的柱头样品用蒸馏水清洗三到四次。浸入4 M NaOH溶液中，密封后于65 °C水浴中孵育60分钟。在此步骤中，柱头颜色由黄白色变为橙红色。
  2. 将柱头在蒸馏水中浸泡30分钟。弃去蒸馏水，并用蒸馏水清洗柱头三到四次，直至柱头颜色变为黄色。
  3. 将样品放入10 mL离心管中，加入洋红蓝染料至完全浸没样品，并在避光条件下染色12小时。
  4. 使用荧光显微镜观察花粉管生长情况。

7. 荧光显微镜

  1. 观察标本前，将载玻片置于平坦的桌面上，并在载玻片表面滴加两到三滴聚乙二醇。
  2. 用蒸馏水清洗待观察的花柱，使用解剖刀沿其纵轴将其切成两半。取其中一半置于载玻片上，盖上盖玻片。
  3. 将载玻片放置在显微镜载物台上，对准通光孔，使用10倍物镜进行观察。采用DAPI滤光片（激发光波长：325-375 nm；发射光波长：435-485 nm）。每种授粉类型观察五个花柱，观察花粉管的生长情况。

8. 基于PCR的S基因型鉴定

  1. 采用CTAB法从柱头样品中提取基因组DNA18。
    1. 将采集的叶片放入2 mL离心管中，液氮中速冻。配制HCl:EDTA:NaCl:H2O缓冲液，比例为1:1:3:5，并配制氯仿:异戊醇混合液，比例为24:1
    2. 向50 mL离心管中加入10 mL已配制的缓冲液、0.2 g CTAB和200 µL巯基乙醇，置于65 °C水浴中5 min，直至溶液变得澄清透明
    3. 将叶片放入研钵中，加入已冻结的样品，加入液氮并研磨。将研磨后的样品转移至2 mL离心管中，加入600 µL CTAB混合液，65 °C水浴中孵育60 min，每30 min颠倒混匀一次
    4. 加入700 µL氯仿:异戊醇混合液（24:1），颠倒混匀10 min。在24 °C、12,000 x g条件下离心10 min，用移液器吸取上清液，转移至1.5 mL离心管中
    5. 加入60 µL 5 M NaCl溶液和1 mL无水乙醇，颠倒混匀。在−20 °C下冷冻30 min，然后在24 °C、9,000 x g条件下离心5 min
    6. 弃去上清液，加入1 mL 70%乙醇溶液，室温下静置1–2 h。在24 °C、9,000 x g条件下离心5 min，弃去上清液，吸除多余乙醇溶液，室温下晾干5 min
    7. 加入100 µL无菌水溶解DNA，用分光光度计测定DNA浓度，并于-4 °C冰箱中长期保存
    8. 配置RT-PCR反应体系。为10 µL反应体系准备以下混合液：5 µL 2x PCRMix，上下游引物各0.25 µL，1 µL DNA（100 ng/µL），以及3.5 µL H2O
  2. 按照表1设置PCR程序。所有异构体的PCR程序均为：95 °C预变性5 min；32个循环（95 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 1 min）；最后72 °C延伸5 min。使用1.5% TAE琼脂糖凝胶分离扩增产物并拍照记录9。利用基因组DNA验证特定的S基因型

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结果

本实验选用成熟花朵，收集花药并在烘箱中干燥，随后将花粉在28°C条件下培养12小时以诱导萌发。花粉活力及萌发率的测定结果如图1所示。

柑橘进行了人工授粉，并通过苯胺蓝染色和荧光显微镜观察评估花粉的亲和性与不亲和性。亲和的花粉能够在柱头表面萌发，并形成正常的花粉管，花粉管能够正常生长并最终进入子房完成受精。相比之下，不亲和的花粉管仅能伸长至花柱的大约三分之二处，随后停止生长（图2）。

为了鉴定 S 基因型，从植物中提取总DNA。根据序列设计特异性引物 S 可用于扩增部分片段的位点 S PCR反应中的位点。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。检测到扩增条带（大小在500-1,000 bp之间）。相应的 S 基因型被鉴定（图3）。通过该方法，我们已鉴定出 S 63 份...

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讨论

在果树作物中，单性结实和自交不亲和性（SI）都是重要性状，因为它们为生产无籽果实铺平了道路——这一性状深受消费者青睐。自交不亲和性可促进植株排斥自花花粉，从而防止近交20。在柑橘类作物中，柚为自交不亲和品种7。约40%的被子植物物种表现出自交不亲和性21。该性状会阻碍果实发育，降低产量，并给种植者带来巨大的经济损失。为解决这一问题，果农通常在果园中种植授粉树。然而，选择合适的授粉树是一项具有挑战性的任务，需要耗时的实验室实验。为解决这些问题，我们开发了一种快速鉴定SI基因型的方法，并确定不同柑橘品种间花粉亲和性与不亲和性，以促进授粉树的精准选配。此外，还可利用本实验方案中所述的体外（in vitro）方法测定花粉活力和萌发率。

已有部分研究报告采用多种方法相结合的方式对日本李和杏的SI基因型以及自交（不）亲和性与种间（不）亲和性进行鉴定22,

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本项目受到国家自然科学基金（32122075，32072523）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009218
苯胺蓝Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd
硼酸，H3BO3Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10004818
棕色瓶Labgic Technology Co., Ltd
硝酸钙四水合物，Ca(NO3)2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80029062
离心管Labgic Technology Co., Ltd
离心管Labgic Technology Co., Ltd
CTABGEN-VIEW SCIENTIFIC INC57-09-0(CAS)
滴管Jiangsu Songchang Medical Equipment Co., Ltd
乙二胺四乙酸，EDTASinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009617
镊子LUXIANZI Biotechnology Co., Ltd
甲醛Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10010018
全自动样品快速研磨仪上海净信工业发展有限公司Tissuelyser-96
冰乙酸Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10000218
研磨管上海净信工业发展有限公司
异戊醇Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10003218
异丙醇Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80109218
标签M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
Leica DMi8上海徕卡有限公司21903797
七水合硫酸镁，MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013018
显微镜盖玻片浙江世泰工业有限公司
NaClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019318
回形针M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
铅笔M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
授粉刷上海艺美塑料有限公司
聚乙二醇，PEG 6000北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司DH229-1
聚乙二醇，PEG-4000广州赛国生物科技有限公司1521GR500
氢氧化钾，KOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017008
硝酸钾，KNO3Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10017218
手术刀江苏松畅医疗器械有限公司
载玻片浙江世泰工业有限公司
氢氧化钠，NaOHSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10019718
蔗糖Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10021418
防油纸泰州金农网业厂
恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司L-909193
三氯甲烷Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10006818
三水合三碱式磷酸三钾，K3PO4上海凌峰化学试剂有限公司20032318
Tris-HClGEN-VIEW SCIENTIFIC INC1185-53-1
自封袋M&G Chenguang Stationery Co., Ltd.
β-巯基乙醇GEN-VIEW SCIENTIFIC INC60-24-2(CAS)

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