使用手动授粉、显微镜和 S 基因型分析测定柑橘中的自（内）相容性和相互（内）相容关系

Summary

该协议提供了一种快速确定柑橘品种中花粉相容性和不相容性的方法。

Abstract

柑橘使用基于S-RNase的自不相容性来拒绝自花粉，因此需要附近的传粉树才能成功授粉和施肥。然而，确定合适的品种作为授粉媒介是一个耗时的过程。为了解决这个问题，我们开发了一种利用琼脂糖凝胶电泳和苯胺蓝染色来鉴定授粉相容柑橘品种的快速方法。花粉相容性是通过提取总DNA并使用特定引物进行基于PCR的基因分型测定来确定的 S基因型 。此外，在手动授粉后3-4天收集样式，并进行苯胺蓝染色。最后，用荧光显微镜观察花粉管的生长状态。花粉相容性和不相容性可以通过分别观察花粉管生长是正常还是抑制来确定。该方法具有简便性和成本效益，是确定不同柑橘品种花粉相容性和不相容性以建立不同品种间不相容性群和不相容关系的有效工具。这种方法为成功选择合适的授粉者树木提供了必要的信息，从而有助于建立新的果园和为育种计划选择合适的亲本。

Introduction

自不相容性（SI）是一种遗传控制机制，存在于大约40%的被子植物物种中。在这个过程中，雌蕊排斥具有相同SI基因型的植物的花粉，从而防止自施肥^1，2。马家柚子是中国金那水省的地方品种，具有大而粉红色的果实、丰富的果汁含量、酸甜的味道和厚皮的优良品质^3.虽然SI促进异交，但它对果实的产量和质量产生负面影响4，并且需要具有不同SI基因型的合适授粉树，以获得可靠的^坐果率和高产量。目前SI主要有两种类型，以芸苔科为代表的孢子体自不相容性（SSI）和以蔷薇科、木瓜科、芸香科和茄科⁵，⁶，^7，8为代表的配子体自不相容性（GSI）。

柑橘是世界上最重要的水果作物之一。基于S-RNase的GSI系统存在于许多柑橘种质中，并对坐^果率产生负面影响9。在该系统中，SI 由 S 位点控制，

Protocol

1.苯胺蓝染色的制备

1. 为实验准备以下试剂和工具:传粉刷、镊子、铅笔、硫酸盐纸、授粉袋、拉链袋、回形针、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、离心管、镊子、滴胶器、载玻片、盖玻片、手术刀和聚乙二醇。
2. 制备含有0.02%MgSO₄，0.01%KNO 3，0.03%Ca（NO 3）₂，0.01%H 3 BO ₃，20%PEG-4000和15%蔗糖的体外发芽培养基。用KOH将pH调节至6.0-6.2。使用磁力搅拌器，因为PEG-4，000难以溶解。
3. 准备Carnoy固定溶液，它是无水乙醇和冰醋酸以3:1的比例混合。制备FAA固定溶液，其为40%甲醛，80%乙醇和冰醋酸（1:8:1）。制备4M氢氧化钠（NaOH）和苯胺蓝溶液，其在0.1M K₃PO 4中为0.1%苯胺蓝_。 使用琥珀色瓶子储存苯胺蓝溶液，因为它对光敏感。

2. 花粉采集

1. 提前了解实验树（本研究中的马家柚树）的开花期。从开花期开始到开花高峰期收集成熟的未开封的花朵，并将它们放入拉链袋中。花朵可以在4°C的冰箱中储存24小时。
2. 把花带到实验室。使用镊子收集花药，并将它们放....

Results

对于这里进行的实验，选择成熟的花朵，收集花药，在烤箱中干燥，花粉在28°C下发芽12小时。花粉活力和发芽率如图 1所示进行量化。

人工授粉柑橘，采用苯胺蓝染色和荧光显微镜评估花粉相容性和不相容性。相容的花粉可以在柱头表面发芽并产生正常的花粉管，该花粉管可以生长并最终导致卵巢受精。相比之下，不相容的花粉管通过大约三分之二的样式生长，然后停止生长（图2）。

为了鉴定S基因型，从植物中提取了总DNA。根据S位点的序列设计特异性引物，可用于扩增PCR反应中的部分S位点。使用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。检测到扩增的条带（在500-1，000 bp之间）。鉴定出相应的S基因型（图3）。通过该方法鉴定了63种柚子种^质资源7的S基.......

Discussion

在水果作物中，单性生殖和SI都是重要的性状，因为它们为无籽水果铺平了道路 - 这一性状受到消费者的高度赞赏。自不相容性促进了对自花粉的排斥，从而防止了近亲繁殖²⁰。在柑橘中，柚子是一种自我不相容的品种⁷。几乎40%的被子植物物种表现出SI²¹。这种性状阻碍了坐果，降低了产量，给种植者带来了巨大的经济损失。为了解决这个问题，农民在整个果园中种植传粉树。然而，选择合适的传粉媒介树木是一项具有挑战性的任务，需要耗时的实验室实验。为了解决这些问题，我们开发了一种快速识别SI基因型的方法，并确定不同柑橘品种的花粉相容性和不相容性，以促进传粉树的准确选择。此外，花粉活力和发芽率也可以使用本协议中描述的 体外 方法确定。

有一些关于在日本李子和杏中使用不同方法的组合确定SI基因型和自（in）相容性和相互（in）相容性的报道^{22，23.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218
苯胺蓝	国药集团化学试剂有限公司
硼酸 H3BO3	国药集团 化学试剂有限公司	10004818
棕瓶	Labgic Technology Co.， Ltd
硝酸钙四水合物，Ca（NO3 ）2	国药集团化学试剂有限公司	80029062
离心管	Labgic Technology Co.， Ltd
离心管	Labgic Technology Co.， Ltd
CTAB	GEN-VIEW SCIENTIFIC INC	57-09-0（CAS）
滴	江苏松昌医疗设备有限公司
乙二胺四乙酸 EDTA	国药集团化学试剂有限公司	10009617
镊子	LUXIANZI Biotechnology Co.， Ltd
甲醛	国药集团化学试剂有限公司	10010018
全自动样品快速研磨机	上海景信实业发展有限公司	Tissuelyser-96
冰醋酸	国药集团化学试剂有限公司	10000218
研磨管	上海精信实业发展有限公司
异戊醇	化学试剂有限公司	10003218
异丙醇	国药集团化学试剂有限公司	80109218
标签	M&LtdG Chenguang Stationery Co.， Ltd. 吉晨光文具有限公司
徕卡 DMi8	上海徕卡有限公司	21903797
七水硫酸镁 MgSO4	国药集团 化学试剂有限公司	10013018
显微镜 盖玻片	浙江世泰实业有限公司
NaCl	国药集团化学试剂有限公司	10019318
回形针	并购G Chenguang Stationery Co.， Ltd. 吉晨光文具有限公司
铅笔	M&G Chenguang Stationery Co.， Ltd. 吉晨光文具有限公司
授粉者刷	上海亿美塑料有限公司
聚乙二醇，PEG 6000	北京定国昌盛生物科技有限公司	DH229-1
聚乙二醇，PEG-4000	广州赛果生物科技有限公司	1521GR500
氢氧化钾，KOH	国药化学试剂有限公司	10017008
硝酸钾 国	试剂有限公司	10017218
手术刀	江苏松昌医疗器械有限公司
幻灯片	浙江世泰实业有限公司
氢氧化钠 NAOH	国药集团化学试剂有限公司 10019718
蔗糖	国药集团化学试剂有限公司
硫酸盐纸	台州市金农网厂
恒温器水浴	上海景宏实验设备有限公司	L-909193
三氯甲烷	国药集团 化学试剂有限公司	10006818
磷酸三钾三氢三水合物，K3PO4	上海灵峰Chemical Reagent Co.，Ltd	20032318
Tris-HCl	GEN-VIEW SCIENTIFIC INC	1185-53-1
拉链袋	M&G Chenguang Stationery Co.， Ltd. 吉晨光文具有限公司
&β;-巯基乙醇	GEN-VIEW SCIENTIFIC INC	60-24-2（CAS）