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方法文章

BS3 化学交联实验：评估慢性应激对啮齿类动物脑内细胞表面 GABAA 受体表达的影响

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DOI：

10.3791/65063

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2023年5月26日

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Addiction and Mental Health (CAMH), Campbell Family Mental Health Research Institute, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 3Department of Psychiatry, University of Toronto

本文内容

摘要

BS3化学交联实验显示，在慢性心理社会应激条件下，小鼠脑组织中细胞表面GABAA受体表达减少。

摘要

焦虑是一种情绪状态，会不同程度地影响动物的行为，包括认知功能。在动物界中均可观察到焦虑的行为表现，这些表现可被视为对多种应激方式的适应性或非适应性反应。啮齿类动物为研究焦虑在分子、细胞和神经环路水平上的整合机制提供了可靠的实验模型。特别是，慢性心理社会应激范式可诱发类似于人类和啮齿类动物中焦虑样/抑郁样行为表型的非适应性反应。尽管先前的研究已表明慢性应激对脑内神经递质含量具有显著影响，但应激对神经递质受体水平的作用仍研究较少。本文介绍一种实验方法，用于定量检测在慢性应激条件下小鼠神经元表面神经递质受体的表达水平，尤其聚焦于γ-氨基丁酸（GABA）受体，该受体参与情绪与认知的调控。利用膜不通透的不可逆化学交联剂——双磺基琥珀酰亚胺基丁二酸酯（BS3），我们发现慢性应激显著下调了前额叶皮层中GABAA受体在细胞表面的可利用性。GABAA受体在神经元表面的表达水平是GABA神经传递的限速环节，因此可作为实验动物模型中焦虑样/抑郁样表型程度的分子标志物或替代指标。该交联方法适用于研究任何脑区中表达的多种神经递质或神经调质受体系统，有望促进对情绪与认知相关机制的深入理解。

引言

神经递质受体定位于神经元质膜表面或细胞内的内膜系统（例如内体、内质网[ER]或高尔基体反面网络）上，并根据神经元内在的生理状态或对外部神经网络活动的响应，在这两个区室之间动态穿梭1,2。由于新分泌的神经递质主要通过定位于细胞表面的受体池来发挥其生理功能，因此特定神经递质的表面受体水平是决定其在神经回路中信号传导能力的关键因素之一3。

有多种方法可用于监测培养神经元中的表面受体水平，包括细胞表面生物素化检测4在非通透条件下使用特异性抗体进行免疫荧光检测5，或使用受体转基因，该转基因与pH敏感型荧光光学指示剂（例如pHluorin）在基因上融合6相比之下，这些方法在评估表面受体水平时存在局限性或不具实用性 体内例如，表面生物素化处理在处理大量样本或高通量样本时可能不具实用性 在体 由于其相对较高的价格以及后续在亲和素偶联磁珠上纯化生物素化蛋白所需的步骤，该方法存在局限性。对于嵌在三维脑组织结构中的神经元，抗体通透性较低或基于显微镜的定量存在困难，可能显著限制对表面受体水平的评估 体内为了可视化完整脑组织中神经递质受体的分布，可采用非侵入性方法（如正电子发射断层扫描）来测量受体占有率并估算细胞表面受体水平。7然而，这种方法严重依赖于特异性放射性配体的可获得性、昂贵的设备以及专业的技术知识，使得大多数研究人员难以在常规实验中使用。

本文介绍一种简单且用途广泛的体外（ex vivo）方法，用于检测实验动物脑组织中细胞表面受体的水平，该方法使用一种水溶性、膜不渗透的化学交联剂——双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（bis(sulfosuccinimidyl)suberate, BS3）8,9。BS3 可靶向赖氨酸残基侧链中的伯胺基团，将彼此靠近的蛋白质共价交联。当从目标脑区新鲜制备脑片并置于含 BS3 的缓冲液中孵育时，细胞表面受体将与邻近蛋白发生交联，从而转变为较高分子量的蛋白复合物；而细胞内膜系统相关的受体则保持未修饰状态。因此，可通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离表面受体与细胞内受体，并利用针对目标受体的特异性抗体进行蛋白质印迹（western blot）分析，实现定量检测。

不可预测的慢性轻度应激（UCMS）是一种已确立的实验范式，用于在啮齿类动物中诱导慢性心理社会应激10UCMS 诱发类似焦虑/抑郁的行为表型及认知缺陷 通过 GABA及其受体等多种神经递质系统的调节10,11特别是含有 α5 亚基的 GABAA 受体（α5-GABAAR）参与记忆和认知功能的调控12,13，提示该亚基功能改变可能参与了UCMS诱导的认知缺陷。在本方案中，我们采用BS3交联实验对表面表达的α5-GABA受体水平进行定量。A与未受应激的对照小鼠相比，暴露于UCMS的小鼠前额叶皮层中的R。

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方案

本方案中的所有动物实验均按照安大略省《研究用动物法案》（RSO 1990，第A.22章）和加拿大动物护理委员会（CCAC）的规定进行，并已获得机构动物护理委员会的批准。

1. 动物准备

  1. 确定实验中使用的动物数量，并将其分为适当的组别或实验队列。有关组大小、性别和统计功效的讨论，请参见讨论部分。
    注意：本方案针对小鼠（C57BL6/J品系；2-4月龄；通常体重为20-30 g；雄性和雌性数量应相等）进行定制。
  2. 将动物置于慢性不可预知轻度应激（UCMS）或对照非应激条件下饲养5-8周，具体操作按照先前描述的方案进行14。
  3. 在最后一次UCMS处理后，让动物在饲养笼中静置1天，再用于交联实验，以避免急性应激对受体表达的影响。

2. 储备液的配制

  1. 按照以下说明在实验前配制并储存下列溶液：
    1. 通过将 14.6 g NaCl 溶解于 40 mL 去离子水中配制 5 M NaCl 溶液，室温（RT）保存。
    2. 通过将 3.22 g KCl 溶解于 40 mL 去离子水中配制 1.08 M KCl 溶液，室温（RT）保存。
    3. 通过将 3.25 g MgCl2·6H2O 溶解于 40 mL 去离子水中配制 400 mM MgCl2 溶液，室温（RT）保存。
    4. 通过将 3 g 甘氨酸溶解于 40 mL 去离子水中配制 1 M 甘氨酸溶液，4 °C 保存。
    5. 通过将 1.54 g 二硫苏糖醇（DTT）溶解于 10 mL 去离子水中配制 1 M DTT 溶液，使用孔径为 0.2 µm 的滤器过滤除菌，并分装至 2 mL 离心管中。−20 °C 保存。
    6. 通过将 Nonidet-P40（NP-40）按 1:10（v/v）比例用去离子水稀释配制 10% NP-40 溶液，室温（RT）保存。
    7. 配制 0.5 M EDTA 溶液（pH = 8.0），室温（RT）保存。
    8. 配制 1 M HEPES 缓冲液（pH = 7.2–7.5），4 °C 保存。
    9. 配制 2.5 M 或 45%（w/v）葡萄糖溶液，4 °C 保存。

3. 工作站的准备

  1. 进行 BS3 交联实验当天，在动物解剖室准备以下材料（图1），其中若干物品需预先在冰上预冷：冰桶、金属温控块（预先在冰上预冷）、50 mL 锥形管中的冰上预冷 PBS、培养皿中的冷冻 PBS、用 PBS 润湿并放置在预冷平面或蓝色冰袋上的滤纸、脑组织切片模具（剃刀片插入间隔为 1 mm，预先在冰上预冷）、约 10 片预先在冰上预冷的剃刀片、解剖工具（剪刀、镊子、弯头探针）、组织打孔器、70% 乙醇喷雾擦拭纸和纸巾、移液器吸头（200 µL）、移液器（P200）、秒表、便签本、笔，以及微量离心管（1.5 mL）。
    1. 实验前，用样品信息标记微量离心管（例如动物编号、处理类型 [UCMS 与无应激（NS）]、脑区、是否添加 BS3 等）。
      注意：进行 BS3 交联实验时，每个脑区需采集两个样品；一个用于交联反应（含 BS3），另一个作为对照用于非交联反应（不含 BS3）。因此，若需从 12 只小鼠的两个脑区（即前额叶皮层 [PFC] 和海马 [HPC]）取样，则需标记 48 个管子用于初始取样（= 2 个样品 × 2 个脑区 × 12 只小鼠）（将在第 6 节中使用）。另需额外准备两套各 48 个管子用于后续储存（分别储存每个样品的两种不同体积 [100 µL、300 µL]）（将在第 7 节中使用）。因此，该样本量共需标记 144 个管子。
  2. 此外，确保实验室配备以下设备：台式制冷微量离心机、超声破碎仪、试管旋转混合仪（用于冷室或冰箱 [4 °C] 内）、用于样品储存的超低温冰箱（−80 °C），以及用于样品临时储存的干冰桶（将在第 7 节中使用）

4. 工作溶液与缓冲液的配制

注意：在检测当天早晨，配制以下溶液。此计算基于处理12只小鼠的两个脑区（即PFC和HPC）所需的溶液量。

  1. 按照表1所述配制人工脑脊液（aCSF，pH = 7.4）。将750 µL aCSF分装至每个采样管中（即步骤3.1.1中标记的48个管），并将其置于冰上的金属温控块中，预冷缓冲液。
  2. 按照表2所述配制裂解缓冲液。置于冰上保存（每份样品使用400 µL）。
  3. 用5 mM柠檬酸钠缓冲液（pH = 5.0）配制52 mM BS3储存液（26倍浓度）。
    1. 首先，配制100 mM柠檬酸（储存液A）和100 mM柠檬酸钠（储存液B）。
    2. 将储存液A和储存液B按1:20的比例用去离子水稀释。分别取100 µL加入1.9 mL水中，配制5 mM柠檬酸（储存液C）和5 mM柠檬酸钠（储存液D）。
    3. 取410 µL储存液C与590 µL储存液D混合，配制5 mM柠檬酸钠缓冲液（pH = 5.0）（溶液E，共1 mL）。
    4. 使用pH指示试纸确认溶液E的pH值。
    5. 将24 mg BS3溶于806.4 µL溶液E中，涡旋振荡30秒，配制BS3储存液（26倍浓度）。
    6. 另配制1 mL溶液E，作为非交联样品的溶剂对照。
      ​注意：BS3储存液应在所有其他准备工作完成、实验即将开始时配制。BS3在使用前应于4 °C干燥保存。一旦重悬，BS3的活性仅维持约≤3小时。由于5 mM柠檬酸钠缓冲液（溶液E）的pH值会随时间升高，导致BS3水解加速，建议每次使用前由储存液A和B新鲜配制溶液E9。由于BS3在低温下溶解度有限，重悬后的BS3应置于室温保存。重悬后的BS3应在3小时内使用完毕，不得冻融或重复使用。

5. 脑组织的解剖

注意：从这一步开始，至少需要两人协同操作。一人专注于动物解剖（步骤 5.2–5.10 和步骤 6.3），另一人应担任计时员，并协助协调实验流程（步骤 5.1、步骤 6.1、步骤 6.2、步骤 6.4 和步骤 6.5）

  1. 将第一只用于解剖的动物从饲养区转移到解剖室。
    注意：由于急性应激因素（例如新环境、血液气味）可能影响脑内蛋白质动态，动物应保留在远离解剖区域的原笼具中，并在解剖时逐只带入解剖室立即进行断头处理。
  2. 通过颈椎脱位后断头的方式处死小鼠。迅速将脑组织从颅骨中取出，并浸入盛有冰冻 PBS 的培养皿中 10–15 秒（图 2）。
    注意：在进行 BS3 实验时，动物不使用麻醉，因为任何麻醉剂都可能影响神经递质受体在细胞表面的表达水平9。
  3. 将冷却后的脑组织置于冰上的脑切片模具中，使脑腹面朝上（图 3）。
  4. 将第一把剃刀刀片插入嗅球与嗅束交界处，以进行冠状面切割（图 4）。使用另外三到四把剃刀刀片，以 1 mm 间隔连续对脑前部进行冠状面切片。
  5. 通过同时提起所有插入的剃刀刀片，将冠状切片从脑切片模具上整体取下，将脑后部留在模具中。用镊子将各刀片彼此分开，并将刀片放置于平坦的冷藏表面上，使脑切片朝上（图 5）。
  6. 识别包含目标区域的切片。若取材前额叶皮层（PFC），应选择包含嗅束的第一片之后的第二和第三片。
  7. 使用组织打孔器取出目标区域（视频 1），将其暂置于冷藏的剃刀刀片上，并将组织均分为两份（例如，分别来自左右半球的组织；若目标蛋白在两侧半球表达水平相当，则其中一半用于 BS3 交联反应，另一半作为无交联对照）。
  8. 用镊子尖端在剃刀刀片上多次垂直剪切组织，将其剪碎成小块（视频 2），避免压碎或研磨组织。此操作可在不严重破坏细胞膜完整性的前提下，最大化 BS3 可接触的组织表面积。剪碎后应立即转移至相应离心管中（见步骤 6.3）。
  9. 若取材海马（HPC），则将脑后部从模具中取出，置于冷藏平坦表面上湿润的滤纸上，使脑背侧朝上（图 6）。
  10. 使用弯头探针和镊子，从背侧入路（视频 3）分离双侧半球的海马组织（可取背侧半部、腹侧半部或全部），并将其中一半用于 BS3 交联，另一半作为对照。按照步骤 5.8 的方法剪碎组织，并转移至相应离心管中（见步骤 6.3）。
    ​注意：每只动物的整个解剖过程应控制在约 5 分钟内，以确保实验条件和结果的一致性。

6. 交联反应

  1. 当上一只小鼠的脑组织解剖即将完成时（步骤 5.10），将下一只待解剖的动物从饲养区转移至解剖室。
  2. 在剪碎的组织即将转移至相应离心管前，立即向预先在冰上预冷的离心管（来自步骤 4.1）中加入 30 µL BS3 溶液（26 倍浓度）或溶剂对照溶液 E。每处理一个管子后均需更换移液器吸头，以确保无 BS3 污染非交联对照管。
  3. 将剪碎的组织（来自步骤 5.8 和步骤 5.10）转移至相应的离心管中，随后开始解剖下一只动物（步骤 5.2）。
  4. 颠倒并轻轻混匀离心管，使组织块进一步分散成更小的碎片（视频 4），然后将样品置于冷室中的管式旋转仪上，孵育 30 分钟至 2 小时。记录每管 BS3 孵育的起始时间。最佳孵育时间请参见讨论部分。
  5. 通过向管中加入 78 µL 1 M 甘氨酸终止反应，并在 4 °C 下持续旋转孵育 10 分钟。记录每管淬灭反应的起始和结束时间。在此期间继续协助负责动物解剖的人员，包括运送下一只动物（步骤 6.1）以及协助完成交联步骤（步骤 6.2）。
    ​注意：所有样品的处理必须保持完全一致的时间控制。若解剖室与冷室相距较远，强烈建议安排第三位人员专门负责在冷室中进行样品的孵育与淬灭操作。

7. 组织裂解、蛋白质制备与蛋白质印迹

  1. 淬灭10分钟后（步骤6.5），在4 °C下以20,000 × g离心2分钟，弃去上清液。若有第三位人员可用，则继续进行步骤7.2；否则，将样品在干冰上速冻，并在此暂停实验，直至所有动物的脑组织解剖（第5节）和交联（第6节）完成。
  2. 每管加入400 µL预冷的裂解缓冲液。
  3. 将样品置于冰上，每次超声1秒，重复5次，每次间隔5秒。
  4. 在20,000 × g离心2分钟，以沉淀不溶性组织碎片（沉淀），保留上清液。
  5. 取5 µL上清液，使用二辛可宁酸（BCA）法测定蛋白浓度。
  6. 将剩余上清液分装至两个离心管中：一管含100 µL上清液用于后续Western blot分析，另一管含剩余部分（约300 µL）于−80 °C长期保存。向样品中加入适量4× SDS上样缓冲液（含β2-巯基乙醇），70 °C孵育10分钟。
  7. 每孔上样10–20 µg蛋白，在丙烯酰胺凝胶上进行电泳（SDS-PAGE），随后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用于Western blot分析。
  8. 用含0.1% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）配制的5%（w/v）脱脂奶粉溶液室温封闭PVDF膜1小时。
  9. 用TBS-T短暂漂洗膜两次，随后在4 °C下用TBS-T稀释的一抗溶液孵育过夜。
  10. 室温下用TBS-T漂洗三次，每次10分钟，去除未结合的一抗。
  11. 室温下用TBS-T稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育膜1小时。
  12. 室温下用TBS-T漂洗三次，每次10分钟，去除未结合的二抗。
  13. 将膜与增强型化学发光试剂孵育，使用凝胶成像系统检测信号。

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结果

为了验证 BS3 交联实验用于评估小鼠前额叶皮层（PFC）表面 α5-GABAAR 水平的可行性，我们将各 10 µg 的 BS3 交联与非交联蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，并使用抗 α5-GABAAR 抗体（兔多克隆抗体）通过蛋白质印迹法分析蛋白表达（图 7）。非交联蛋白样品显示出总量的 α5-GABAAR 条带位于约 55 kDa 处，而 BS3 交联蛋白样品则在约 55 kDa 处显示一定量的内膜系统相关 α5-GABAAR，同时出现代表与 α5-GABAAR 共价交联形成的蛋白复合物的高分子量蛋白条带。为定量表面 α5-GABAAR 水平，可通过交联后 ~55 kDa 处 α5-GABAAR 从总蛋白池中的减少程度来评估，因为该亚基在交联后会迁移至更高分子量位置。实际操作中，表面 α5-GABAAR 水平可通过从非交联样品泳道中 ~55 kDa 处的总 α5-GABAA

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讨论

尽管慢性心理社会应激对行为（如情绪变化和认知缺陷）以及分子水平改变（如GABA能基因表达降低及伴随的GABA能神经传递功能缺陷）的影响已有充分记录10，但这些缺陷背后的机制仍需进一步研究。特别是，鉴于最近一项研究表明，慢性应激通过加重内质网功能负担，显著影响神经元蛋白质组，从而导致内质网应激升高15，因此仍有一个问题尚待阐明：慢性应激是否会影响GABAAR通过内质网膜的转运，以及GABAAR转运或细胞膜表面水平的改变如何与精神病理学变化存在因果关联。

本方案中展示的BS3交联实验将为回答上述部分问题提供一种强有力的方法。例如，已知不可预测的慢性轻度应激（UCMS）会引发一系列行为学改变，具体表现包括认知功能障碍、类焦虑行为以及快感缺失表型，且这些表现与UCMS的持续时间有关10。因此，可通过在UCMS开始后不同时间点（例如1周、3周、5周）采集小鼠脑组织，研究UCMS诱导的细胞膜表面α5-GABA...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢CAMH动物设施工作人员在研究期间对实验动物的悉心照料。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR项目资助#470458，授予T.T.）、CAMH发现基金（授予T.P.）、国家精神分裂症与抑郁症研究联盟（NARSAD奖项#25637，授予E.S.）以及坎贝尔家庭心理健康研究所（授予E.S.）提供资助。E.S.是Damona Pharmaceuticals的创始人，该公司是一家致力于将新型GABA能化合物推进至临床应用的生物制药企业。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575020
1 M HEPESGibco15630080
10x TBSBio-Rad1706435
2.5 M（45%，w/v）葡萄糖SigmaG8769
2-巯基乙醇SigmaM3148
4x SDS 样品缓冲液（Laemmli）Bio-Rad1610747
双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS3）PierceA39266免称量形式；10 × 2 mg
脑组织切片模具Ted Pella15003适用于小鼠，成年30 g，冠状面，1 mm
氯化钙（CaCl2）SigmaC4901
弯头探针Fine Science Tools10088-15大体解剖探针；45° 角
去离子水milli-QEQ 7000超纯水［电阻率 18.2 MΩ·cm @ 25 °C；总有机碳（TOC）≤ 5 ppb］ 
二硫苏糖醇（DTT）Sigma10197777001
滤纸（3MM）Whatman3030-917
镊子（大号）Fine Science Tools11152-10超细 Graefe 镊
镊子（小号）Fine Science Tools11251-10Dumont #5 镊子
GABA-A 受体 α5 抗体InvitrogenPA5-31163多克隆兔 IgG；化学交联后可检测到错误信号
GABA-A 受体 α5 C 末端抗体R&D SystemsPPS027多克隆兔 IgG；与小鼠和大鼠发生交叉反应
甘氨酸SigmaW328707
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（H+L）Bio-Rad1721019
氯化镁（MgCl2·6H2O）SigmaM2670
Nonidet-P40 替代物（NP-40）SantaCruz68412-54-4
氯化钾（KCl）SigmaP9541
蛋白酶抑制剂混合物SigmaP8340
PVDF 膜Bio-Rad1620177
剪刀（大号）Fine Science Tools14007-14手术剪刀——带锯齿
剪刀（小号）Fine Science Tools14060-09精细剪刀——锋利刃
氯化钠（NaCl）SigmaS9888
超声波破碎仪（Qsonica Sonicator Q55） Qsonica15338284
台式制冷离心机Eppendorf5425R
组织打孔器（内径 1 mm）Ted Pella15110-10Miltex 活检打孔器带推杆，内径 1.0 mm，外径 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x 转膜缓冲液Bio-Rad10026938
管式旋转混合仪（LabRoller）LabnetH5000

参考文献

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BS3 GABA
BS3 化学交联实验：评估慢性应激对啮齿类动物脑内细胞表面 GABAA 受体表达的影响
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