BS3 化学交联实验：评估慢性应激对啮齿类动物脑内细胞表面 GABAA 受体表达的影响

摘要

BS3化学交联实验显示，在慢性心理社会应激条件下，小鼠脑组织中细胞表面GABA_A受体表达减少。

摘要

焦虑是一种情绪状态，会不同程度地影响动物的行为，包括认知功能。在动物界中均可观察到焦虑的行为表现，这些表现可被视为对多种应激方式的适应性或非适应性反应。啮齿类动物为研究焦虑在分子、细胞和神经环路水平上的整合机制提供了可靠的实验模型。特别是，慢性心理社会应激范式可诱发类似于人类和啮齿类动物中焦虑样/抑郁样行为表型的非适应性反应。尽管先前的研究已表明慢性应激对脑内神经递质含量具有显著影响，但应激对神经递质受体水平的作用仍研究较少。本文介绍一种实验方法，用于定量检测在慢性应激条件下小鼠神经元表面神经递质受体的表达水平，尤其聚焦于γ-氨基丁酸（GABA）受体，该受体参与情绪与认知的调控。利用膜不通透的不可逆化学交联剂——双磺基琥珀酰亚胺基丁二酸酯（BS3），我们发现慢性应激显著下调了前额叶皮层中GABA_A受体在细胞表面的可利用性。GABA_A受体在神经元表面的表达水平是GABA神经传递的限速环节，因此可作为实验动物模型中焦虑样/抑郁样表型程度的分子标志物或替代指标。该交联方法适用于研究任何脑区中表达的多种神经递质或神经调质受体系统，有望促进对情绪与认知相关机制的深入理解。

引言

神经递质受体定位于神经元质膜表面或细胞内的内膜系统（例如内体、内质网[ER]或高尔基体反面网络）上，并根据神经元内在的生理状态或对外部神经网络活动的响应，在这两个区室之间动态穿梭^1,2。由于新分泌的神经递质主要通过定位于细胞表面的受体池来发挥其生理功能，因此特定神经递质的表面受体水平是决定其在神经回路中信号传导能力的关键因素之一³。

有多种方法可用于监测培养神经元中的表面受体水平，包括细胞表面生物素化检测⁴在非通透条件下使用特异性抗体进行免疫荧光检测⁵，或使用受体转基因，该转基因与pH敏感型荧光光学指示剂（例如pHluorin）在基因上融合⁶相比之下，这些方法在评估表面受体水平时存在局限性或不具实用性 体内例如，表面生物素化处理在处理大量样本或高通量样本时可能不具实用性 在体 由于其相对较高的价格以及后续在亲和素偶联磁珠上纯化生物素化蛋白所需的步骤，该方法存在局限性。对于嵌在三维脑组织结构中的神经元，抗体通透性较低或基于显微镜的定量存在困难，可能显著限制对表面受体水平的评估 体内为了可视化完整脑组织中神经递质受体的分布....

方案

本方案中的所有动物实验均按照安大略省《研究用动物法案》（RSO 1990，第A.22章）和加拿大动物护理委员会（CCAC）的规定进行，并已获得机构动物护理委员会的批准。

1. 动物准备

1. 确定实验中使用的动物数量，并将其分为适当的组别或实验队列。有关组大小、性别和统计功效的讨论，请参见讨论部分。
   注意：本方案针对小鼠（C57BL6/J品系；2-4月龄；通常体重为20-30 g；雄性和雌性数量应相等）进行定制。
2. 将动物置于慢性不可预知轻度应激（UCMS）或对照非应激条件下饲养5-8周，具体操作按照先前描述的方案进行¹⁴。
3. 在最后一次UCMS处理后，让动物在饲养笼中静置1天，再用于交联实验，以避免急性应激对受体表达的影响。

2. 储备液的配制

1. 按照以下说明在实验前配制并储存下列溶液：
   1. 通过将 14.6 g NaCl 溶解于 40 mL 去离子水中配制 5 M NaCl 溶液，室温（RT）保存。
   2. 通过将 3.22 g KCl 溶解于 40 mL 去离子水中配制 1.08 M KCl 溶液，室温（RT）保存。
   3. 通过将 3.25 g Mg....

结果

为了验证 BS3 交联实验用于评估小鼠前额叶皮层（PFC）表面 α5-GABA_AR 水平的可行性，我们将各 10 µg 的 BS3 交联与非交联蛋白样品进行 SDS-PAGE 电泳，并使用抗 α5-GABA_AR 抗体（兔多克隆抗体）通过蛋白质印迹法分析蛋白表达（图 7）。非交联蛋白样品显示出总量的 α5-GABA_AR 条带位于约 55 kDa 处，而 BS3 交联蛋白样品则在约 55 kDa 处显示一定量的内膜系统相关 α5-GABA_AR，同时出现代表与 α5-GABA_AR 共价交联形成的蛋白复合物的高分子量蛋白条带。为定量表面 α5-GABA_AR 水平，可通过交联后 ~55 kDa 处 α5-GABA_AR 从总蛋白池中的减少程度来评估，因为该亚基在交联后会迁移至更高分子量位置。实际操作中，表面 α5-GABA_AR 水平可通过从非交联样品泳道中 ~55 kDa 处的总 α5-GABA_A

讨论

尽管慢性心理社会应激对行为（如情绪变化和认知缺陷）以及分子水平改变（如GABA能基因表达降低及伴随的GABA能神经传递功能缺陷）的影响已有充分记录¹⁰，但这些缺陷背后的机制仍需进一步研究。特别是，鉴于最近一项研究表明，慢性应激通过加重内质网功能负担，显著影响神经元蛋白质组，从而导致内质网应激升高¹⁵，因此仍有一个问题尚待阐明：慢性应激是否会影响GABA_AR通过内质网膜的转运，以及GABA_AR转运或细胞膜表面水平的改变如何与精神病理学变化存在因果关联。

本方案中展示的BS3交联实验将为回答上述部分问题提供一种强有力的方法。例如，已知不可预测的慢性轻度应激（UCMS）会引发一系列行为学改变，具体表现包括认知功能障碍、类焦虑行为以及快感缺失表型，且这些表现与UCMS的持续时间有关¹⁰。因此，可通过在UCMS开始后不同时间点（例如1周、3周、5周）采集小鼠脑组织，研究UCMS诱导的细胞膜表面α5-GABA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
1 M HEPES	Gibco	15630080
10x TBS	Bio-Rad	1706435
2.5 M（45%，w/v）葡萄糖	Sigma	G8769
2-巯基乙醇	Sigma	M3148
4x SDS 样品缓冲液（Laemmli）	Bio-Rad	1610747
双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS3）	Pierce	A39266	免称量形式；10 × 2 mg
脑组织切片模具	Ted Pella	15003	适用于小鼠，成年30 g，冠状面，1 mm
氯化钙（CaCl2）	Sigma	C4901
弯头探针	Fine Science Tools	10088-15	大体解剖探针；45° 角
去离子水	milli-Q	EQ 7000	超纯水［电阻率 18.2 MΩ·cm @ 25 °C；总有机碳（TOC）≤ 5 ppb］
二硫苏糖醇（DTT）	Sigma	10197777001
滤纸（3MM）	Whatman	3030-917
镊子（大号）	Fine Science Tools	11152-10	超细 Graefe 镊
镊子（小号）	Fine Science Tools	11251-10	Dumont #5 镊子
GABA-A 受体 α5 抗体	Invitrogen	PA5-31163	多克隆兔 IgG；化学交联后可检测到错误信号
GABA-A 受体 α5 C 末端抗体	R&D Systems	PPS027	多克隆兔 IgG；与小鼠和大鼠发生交叉反应
甘氨酸	Sigma	W328707
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG（H+L）	Bio-Rad	1721019
氯化镁（MgCl2·6H2O）	Sigma	M2670
Nonidet-P40 替代物（NP-40）	SantaCruz	68412-54-4
氯化钾（KCl）	Sigma	P9541
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma	P8340
PVDF 膜	Bio-Rad	1620177
剪刀（大号）	Fine Science Tools	14007-14	手术剪刀——带锯齿
剪刀（小号）	Fine Science Tools	14060-09	精细剪刀——锋利刃
氯化钠（NaCl）	Sigma	S9888
超声波破碎仪（Qsonica Sonicator Q55）	Qsonica	15338284
台式制冷离心机	Eppendorf	5425R
组织打孔器（内径 1 mm）	Ted Pella	15110-10	Miltex 活检打孔器带推杆，内径 1.0 mm，外径 1.27 mm
Trans-Blot Turbo 5x 转膜缓冲液	Bio-Rad	10026938
管式旋转混合仪（LabRoller）	Labnet	H5000