测量胚胎活力与子代数量 秀丽隐杆线虫

摘要

本文介绍了一种利用模式生物 C. elegans 测定胚胎存活率及所产胚胎总数（子代数量）的通用方法。

摘要

Caenorhabditis elegans 是研究减数分裂、受精作用和胚胎发育的优良模式生物。C. elegans 以自体受精的雌雄同体形式存在，可产生大量后代；当存在雄性个体时，还可通过杂交产生数量更多的子代。减数分裂、受精及胚胎发育过程中的错误可迅速表现为不育、生育力下降或胚胎致死等表型。本文介绍一种测定 C. elegans 胚胎存活率和子代数量的方法。我们演示了如何通过将线虫挑至单个改良的仅含酵母提取物和蛋白胨（MYOB）培养板上建立实验，确定统计可存活子代和不可存活胚胎的合适时间窗口，并说明如何准确计数活体线虫样本。该技术可用于测定自体受精雌雄同体以及交配对杂交受精后的胚胎存活情况。这些相对简单的实验易于被新进入该领域的研究人员（如本科学生和一年级研究生）掌握和应用。

引言

真核生物的有性生殖需要产生具有功能的配子，这些配子通过受精过程融合形成胚胎。母本和父本配子，即卵子（卵细胞）和精子，是通过减数分裂和配子发生等特殊细胞分裂与分化过程产生的。¹减数分裂始于一个二倍体细胞，最终形成子细胞，其染色体数目为原始亲代细胞的一半。从倍性的减少到遗传物质的重组 通过 独立分配与交叉重组，减数分裂具有多种重要功能¹减数分裂过程中的错误可能导致非整倍体，即配子中的染色体数目过多或过少。非整倍体的发生对人类健康具有重大影响，因为染色体数目失衡是导致流产以及唐氏综合征、爱德华氏综合征等发育障碍的主要原因。².

受精是指雌雄配子融合以产生新个体的过程³配子-配子识别由配子表面的蛋白质介导³配子兼容性错误会导致不育，因为精子与卵子的融合无法进行。精子与卵母细胞的融合会触发一系列事件，从而形成具有活性的胚胎，使其能够启动从单细胞胚胎发育为完全功能的多细胞生物的发育过程。 通过 有丝分裂⁴在整个胚胎发育过程中，调控发育的分子事件必须受到严格调控并精确控制时间，以确保生物体的正常生长。⁵早期发育过程中适当的细胞分化至关重要，因为生物体将从多能性胚胎转变为完全成型的有机体。由于这些过程极为复杂，任何干扰都可能导致发育异常，进而引发胚胎致死。

秀丽隐杆线虫 是研究减数分裂、受精作用和胚胎发育的优良模式生物。 秀丽隐杆线虫 是一种透明的线虫，具有两种性别：雄性和雌雄同体。 秀丽隐杆线虫 雌雄同体，具有自体受精能力，是主要的性别类型^6,7雌雄同体的性腺在第四幼虫期（L4期）首先产生精子，并将其储存在受精囊中。在L4期向成虫期过渡时，生殖系转为产生卵母细胞，随后卵母细胞被受精。 通过 储存的精子。雄性个体由雌雄同体产生，频率低于0.2%，仅产生精子，可与雌雄同体交配。在异体受精过程中，雄性的精子在卵细胞受精中优于雌雄同体的精子⁸这使得通过自交品系相对容易地维持纯合突变体，并可通过遗传杂交进行遗传操作。 两种性别使得研究人员能够探索雄性和雌性生殖系减数分裂之间的差异。此外，由于其透明的特性 秀丽隐杆线虫 及其卵, 利用荧光成像技术，可在活体完整动物中研究减数分裂、配子发生、受精和胚胎发生过程。

在分析可能参与C. elegans减数分裂、受精和/或胚胎发育的新基因突变时，一个关键的初步步骤是确定胚胎存活性和子代数量，因为这些过程中的错误通常会导致可存活后代的产生失败或减少。本文描述了一种用于评估自体受精雌雄同体或雌雄同体与雄虫杂交后代的生育力、胚胎存活性以及子代数量的实验方案。尽管这一经典检测方法已在许多C. elegans研究中被广泛应用，但我们提供了一个标准化的实验设置与精确量化流程。在本方案中，将单个线虫或雌雄同体/雄虫配对隔离，以允许交配并产生后代。通过连续数天观察后代的产生情况及其存活性，以确定可存活后代的数量和不可存活胚胎的数量。实验结束时，对每个个体的子代进行分析，以计算胚胎存活性百分比和总子代数量。

方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表。

1. 准备实验用培养板

1. 用改良Youngren's仅含Bacto-蛋白胨（MYOB）培养基制备直径35 mm的培养皿。配制MYOB平板时，将20 g Bacto琼脂、2 g NaCl、0.55 g Trizma-HCl、0.24 g Trizma-OH、3.1 g Bacto蛋白胨和1.6 mL胆固醇加入1 L ddH₂O中，于121 °C高压灭菌40分钟。冷却至55 °C后，采用无菌操作，将4 mL熔融培养基倒入每个35 mm培养皿中。
   注意：1 L MYOB培养基可制备约250个平板，可在4 °C保存最多6个月。建议每组重复实验至少包含10个个体，每种品系设置三组重复。
2. 采用无菌操作，在培养皿中央接种少量OP50细菌（约50 µL）。
   注意：小面积菌斑对于评估异体受精尤为重要，因为较小的菌斑可增加雄性与雌雄同体个体之间的相遇频率，从而提高交配概率。

2. 胚胎存活力检测（雌雄同体自体受精）

1. 第1天
   1. 标记每块培养皿的背面。在实验过程中务必记录每块培养皿及其对应的线虫。
      注：推荐的标记方法——第1天：线虫1，第1天：线虫2，……等。
   2. 将单个L4期雌雄同体线虫转移至每块平板上，确保未将胚胎或其他线虫带入平板。在标准培养温度下培养24小时，使其发育为成虫并自交产卵。 20 °C第3天对这些平板进行评分。
      注意：对于温度敏感型突变，实验温度可根据情况调整。针对温度敏感型突变，胚胎存活性检测应在允许温度（15-16 °C）和非许可温度（24-26 °C).
2. 第2天
   1. 标记一组新培养皿——第2天：线虫1，第2天：线虫2，……等。
   2. 将第1天的单个线虫转移到新培养板上。
      注意：这些线虫应已达到成虫阶段，且野生型线虫应已开始产下胚胎。
   3. 让线虫在24小时内产下胚胎 20 °C 或适当的温度。在第4天对这些平板进行评分。
3. 第3天
   1. 标记一组新培养皿。第3天：线虫1，第3天：线虫2，……以此类推。
   2. 将第2天的单条线虫转移到新培养板上。在24 h内让其产下后代 20 °C 或适当的温度。在第5天对这些平板进行评分。
      注意：在较低温度下，孵化时间将延长。请相应调整。
   3. 使用细头记号笔在35 mm培养皿盖上绘制网格图案。将带有网格的皿盖置于测试平板下方用于计数，以便追踪已计数的线虫图1A-B).
      1. 使用血细胞计数板对第1天的培养板进行计数，判断是否存在子代。统计活体幼虫和未孵化胚胎的数量。
         注意：此时已过去足够时间，所有存活的胚胎应已完成孵化。任何未孵化的胚胎均被视为已死亡。
      2. 在单个方格内，计数位于方格内部且未孵化的胚胎和存活的幼虫图1C- F).
      3. 对于位于方格边界的线虫，根据线虫头部的位置进行计数。仅计数头部接触方格上边和左边的线虫（不计数接触下边或右边的线虫）； 图1D）。本实验中不要计入未受精的卵母细胞（图1F).
   4. 记录活体幼虫和未孵化胚胎的数量于实验记录本中。
4. 第4天
   1. 按照步骤2.3.3.1所述方法，对第2天的培养板进行评分，计数活体幼虫和未孵化胚胎。将活体幼虫和未孵化胚胎的数量记录在实验记录本中。
5. 第5天
   1. 按照步骤2.3.3.1所述方法，对第3天的培养板进行评分，计数活体幼虫和未孵化胚胎。将活体幼虫和未孵化胚胎的数量记录于实验记录本中。采用数据分析部分所述方法对获得的数据进行分析。
      注意：某些遗传突变体的生殖周期可能延迟或延长。需监测各个品系在第3天之后是否持续产下胚胎。若至第4天仍持续产卵，应继续将成虫转移至新的培养板。

3. 胚胎活力检测（雄性/雌雄同体杂交受精）

1. 第1天
   1. 在每块培养皿背面做好标记。实验过程中务必记录每块培养皿及其对应的线虫。
   2. 将单个L4期雌雄同体线虫转移至每块培养皿中。确保未将胚胎或其他线虫一同转移至培养皿中。
      注意：可使用不产生精子的雌性化品系（如fog-2功能缺失突变体）替代雌雄同体线虫。
   3. 将单个L4期雄性线虫转移至含有L4期雌雄同体线虫的已标记培养皿中。确保未将胚胎或其他线虫一同转移至培养皿中。
      注意：可使用如plg-1变异型雄性品系来判断是否发生交配，因为这些雄性在线虫交配后会在雌雄同体的阴门处留下交配栓。
   4. 将线虫在20 °C或其他适宜温度下培养24小时以进行交配并产下后代。在第3天统计这些培养皿中存活幼虫与未孵化胚胎的数量。
2. 第2天
   1. 标记一组新的培养皿，并按第2天所述方法转移线虫。此次需确保将雌雄同体和雄性线虫均转移至新培养皿中。注意雌雄同体应已发育至成虫阶段。
   2. 将雌雄同体线虫在20 °C或其他适宜温度下培养24小时以产下后代。在第4天统计这些培养皿中存活幼虫与未孵化胚胎的数量。
3. 第3天
   1. 标记一组新的培养皿，并按第3天所述方法转移线虫。确保将雌雄同体和雄性线虫均转移至新培养皿中。
   2. 将线虫在20 °C或其他适宜温度下培养24小时以产下后代。在第5天统计这些培养皿中存活幼虫与未孵化胚胎的数量。
   3. 使用差分细胞计数器，按照步骤2.3.3.1所述方法，统计第1天培养皿中的存活幼虫和未孵化胚胎数量。
      注意：请勿丢弃这些培养皿，因其在第4天仍需使用。
   4. 在实验记录本中记录存活幼虫和未孵化胚胎的数量。
4. 第4天
   1. 按照步骤2.3.3.1所述方法，统计第2天培养皿中的存活后代和未孵化胚胎数量，并在实验记录本中记录存活幼虫和未孵化胚胎的数量。
   2. 检查第1天的培养皿中是否存在雄性后代。若发生交配，预期的雌雄同体与雄性后代的遗传比例应为50:50。若第1天的培养皿中未出现任何雄性后代，则表明雄性与雌雄同体之间未发生交配。此时应丢弃该交配组合，并在实验记录本中记录此观察结果。
5. 第5天
   1. 按照步骤2.3.3.1所述方法，统计第3天培养皿中的存活幼虫和未孵化胚胎数量，并在实验记录本中记录其数量。使用数据分析部分所述方法对获得的数据进行分析。

4. 数据分析

1. 使用公式（1）计算某一菌株特定生物学重复的胚胎存活率百分比。
   注意：存活后代数和未孵化胚胎数通过汇总实验期间每日计数获得。
         （1）
2. 通过汇总单条成虫雌雄同体产生的后代数量（包括未孵化胚胎和幼虫），计算特定菌株每条线虫的产仔数。使用公式（2）计算平均产仔数。
         （2）
3. 报告各生物学重复之间的胚胎存活率百分比和平均产仔数，以平均值±标准差表示。采用Student's t-检验对对照组与实验组数据进行比较。

结果

我们对N2（野生型）以及两个在减数分裂相关基因中携带突变的品系him-5(e1490)和spo-11(ok79)进行了胚胎存活率和产仔量测定。由于him-5和spo-11均参与减数分裂中交叉事件的形成，这两个基因的突变会导致非整倍体配子的产生。N2的胚胎存活率测定结果显示其存活率为98.9%，而him-5(e1490)和spo-11(ok79)的后代存活率分别下降至74.9%和0.8%（图2A；p < 0.0005）。这些结果与先前发表的研究结果一致^7,9。N2、him-5(e1490)和spo-11(ok79)的平均产仔量分别为217、105和219（图2B）。与以往报道一致，him-5(e1490)的产仔量显著低于野生型，而spo-11(ok79)则无明显差异^7,9。

图 1：计数装置及培养板上胚胎形态的示意图。（A）使用细头记号笔绘制了交叉网格图案的皿盖图像。（B）一个35 mm的MYOB培养板，其下放置带有网格图案的皿盖用于计数。（C）显示低倍镜（10×）下视野的图像，可见网格的多个方格。白色箭头指示该视野中的若干幼虫。计数应在更高倍镜下进行（视野中仅含一个方格），以便同时观察幼虫和胚胎。比例尺 = 1,000 µm。（D）将带网格的皿盖置于35 mm培养板下方的示意图。插图说明了确定某一特定方格内应计数幼虫的正确方法：从上到下、从左到右计数；完全位于方格内的线虫应被计数；接触边界的线虫应根据其头部位置而非尾部位置决定是否计数；仅计数头部朝向当前网格或已计数网格（即上方和左方边缘）的线虫；不计数头部接触下方或右方边缘的线虫。根据插图，蓝色线虫将被计数，而红色线虫则不计数。（E）健康的N2 L1孵化幼虫的代表性图像（白色箭头）。（F）未受精卵母细胞（黑色箭头）和未孵化胚胎（红色箭头）的代表性图像。在本实验中，未受精卵母细胞不应计入。比例尺（E, F）= 100 µm。注意：C、E 和 F 中的图像使用配备相机的蔡司AxioZoom显微镜拍摄，旨在展示线虫培养板上幼虫、胚胎和卵母细胞的外观。在胚胎存活率检测中，计数时应直接通过体视显微镜观察培养板（无需相机）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：代表性的图表，显示胚胎存活率检测和产卵量的结果。 (AN2 胚胎存活率百分比 him-5(e1490)， 和 spo-11(ok79) 在 20 °C. (BN2的子代数量， him-5(e1490)， 和 spo-11(ok79) 在 20 °C. 每种品系至少统计了28只雌雄同体的子代。所统计的未孵化胚胎和幼虫总数为：N2 = 6302， him-5(e1490) = 2,945，和 spo-11(ok79) = 7,230。误差线表示三次独立重复实验的标准差。统计学分析采用 Student's t检验，n.s. = 无显著性，*p < 0.0005. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

有性繁殖物种的繁衍需要通过减数分裂形成单倍体配子（即卵子和精子），随后在受精过程中结合，恢复二倍体染色体数目，并启动胚胎发育。这些过程中的任何错误都可能导致不育、胚胎致死和/或出生缺陷。C. elegans 是研究有性生殖的有力模型系统。利用上述的胚胎存活率和子代数量测定实验，可以相对快速且简便地评估基因突变或基因表达敲低（例如RNA干扰）的影响。我们已将这些方法用于参与减数分裂染色体分离以及受精/卵子激活相关基因的初步表征^10,11,12。若观察到胚胎存活率降低或子代数量减少，则表明减数分裂、配子发生、受精或胚胎发育过程受到干扰。

由于胚胎存活力和子代数量可通过计数后代并进行简单的数学计算相对容易地评估，因此这些实验非常适合作为实验室或课堂中科研新手的入门实验。秀丽隐杆线虫（C. elegans）易于饲养且成本低廉，使其特别适用于实验生物学课程。学生通过饲养 C. elegans 获得宝贵的研究经验，学会使用解剖显微镜，并可在发育系统中提出生物学问题，且这些问题能在相对较短的时间内得到解答（按照本文所述方案，大约需要5天）。

子代计数的时间对于胚胎存活率检测至关重要。在20 °C条件下，胚胎发育大约需要16小时，而具有生殖能力的成虫在L1幼虫孵化后约60小时开始产卵。由于生命周期较短，必须在适当的时间窗口内完成子代计数，以确保胚胎有足够时间孵化，但又不至于让子代自身开始产卵。还需注意的是，生长周期随温度变化而有所不同。在24–25 °C时的生长速度约为15–16 °C时的2.1倍，在20 °C时的生长速度约为15–16 °C时的1.3倍¹³。在本方案中，我们建议在将成虫转移至新鲜培养板后48小时进行计数。这一时间范围可确保所有具有野生型发育能力的胚胎均有足够时间孵化（>16 h），但不会发育至具备生殖能力的阶段。在低于20 °C温度下进行的实验可能需要延长检测时间（转移动物后4天），以便胚胎完成孵化，且孵化后的子代发育至更容易在MYOB平板的细菌中观察到的幼虫阶段（L3-L4阶段）。

胚胎存活力检测和产卵量分析的一个局限性在于，难以明确识别受干扰的具体发育过程。然而，可在这些初步检测之后，采用细胞学技术来确定受影响的过程。例如，通过解剖成虫线虫以释放其生殖腺，随后进行4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色，并仔细分析生殖系中的DNA形态，可判断减数分裂过程是否受到干扰。此外，对胚胎进行DAPI染色可揭示胚胎发育在哪个阶段发生停滞。

综上所述，我们描述了一种用于检测不同 C. elegans 突变体所产生的胚胎数量（子代数）以及可存活胚胎百分比的实验方案。该检测方法既适用于自体受精的雌雄同体个体，也适用于雄性与雌雄同体的杂交实验。由于 C. elegans 生命周期较短，该实验可在不到一周的时间内完成。胚胎存活率检测和子代数量统计可作为分析参与减数分裂、受精或胚胎发育相关基因的初步实验手段，适用于高级研究人员以及科研新手（包括本科生和一年级研究生）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
35 mm 培养皿	Tritech Research	T3501	半可叠放，无通风孔。
Bacto 琼脂	Becton, Dickinson and Company	214010	用于 MYOB 培养基
Bacto-蛋白胨	Gibco	211677	用于 MYOB 培养基
胆固醇	Sigma	C8503	用于 MYOB 培养基
氯化钠	J.T. Baker	FW 58.440	用于 MYOB 培养基
Trizma 碱	Sigma	T1503	用于 MYOB 培养基
Trizma 盐酸盐	Sigma	T3253	用于 MYOB 培养基
菌株
C. elegans野生型菌株	秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）	N2
Escherichia coli	秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）	OP50
him-5(e1490)	秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）	DR466
spo-11(ok79)	秀丽隐杆线虫遗传中心（Caenorhabditis Genetics Center）	AV106
仪器/软件
细胞差分计数仪	Fisher Scientific	02-670-12
Microsoft Excel 或 Prism	Microsoft 或 GraphPad		用于记录数据并生成图表。
铂丝	Tritech Research	PT9901	用于制作线虫挑取工具。含 99.5% 铂和 0.5% 铱。每包 3 英尺，足够制作 36 根线虫挑针（每根挑针使用约 1 英寸铂丝）。
体视显微镜	Nikon	SMZ-745	透射光底座配调焦支架，集成 LED 模块，电源线，6.7× 至 50× 变倍范围 [工作距离 115 mm]，广角目镜 C-15×/17（注：其他厂商也提供性能相当的体视显微镜）。
线虫挑针手柄	Tritech Research	TWPH1	用于制作线虫挑针。将约 1 英寸长的铂丝装入线虫挑针手柄中。也可将铂丝装入玻璃巴斯德吸管中自制挑针。