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方法文章

一种制备纳米多孔金分级结构的通用技术

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DOI：

10.3791/65065

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2023年2月10日

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1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Missouri-Saint Louis, 2Mallinckrodt Pharmaceuticals Company, 3Department of Chemistry, Saint Louis University

本文内容

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摘要

通过结合电化学和化学去合金化方法，可制备具有分级结构和双峰孔径分布的多孔纳米金。合金成分可被实时监测。 通过 随着去合金化过程的进行，开展EDS-SEM检测。通过研究蛋白质在材料上的吸附行为，可确定该材料的载荷能力。

摘要

由于纳米多孔金（NPG）基纳米材料具备可调控的孔径大小、表面修饰简便，以及在生物传感器、驱动器、药物负载与释放和催化剂开发等领域的广泛应用前景，其在研发中的使用已显著加速。本文介绍了一种通过分步电化学合金化、化学去合金化及退火工艺制备具有分级双峰结构的纳米多孔金（hb-NPG）的方法，旨在形成兼具宏观孔和介观孔的结构，从而提升NPG的实用性，构建双连续固相/孔隙形态。较小的孔可增加可用于表面修饰的有效面积，而较大孔构成的网络则有利于分子传输。这种双峰结构是多步制备工艺的结果，通过扫描电子显微镜（SEM）可观察到其呈现为尺寸小于100 nm的孔隙，通过细小的连接体与尺寸达数百纳米的大孔相连。采用循环伏安法（CV）评估hb-NPG的电化学活性表面积，并重点分析去合金化和退火过程在形成所需结构中的关键作用。通过溶液消耗法测定不同蛋白质的吸附量，结果表明hb-NPG在蛋白质负载方面表现出更优性能。通过调节表面积与体积之比，所制备的hb-NPG电极在生物传感器开发方面展现出巨大潜力。本文论述了一种可放大的hb-NPG表面结构制备方法，因其不仅提供了较大的表面积以固定小分子，还具备更优的传质通道，有助于实现更快的反应动力学。

引言

在自然界中常见的分层多孔结构已被仿制到纳米尺度，以改变材料的物理特性，从而提升其性能1。多孔材料的分层结构特征在于具有多种尺度的相互连通的结构单元2。去合金化的纳米多孔金属通常具有单峰孔径分布；因此，研究人员已开发出多种技术，以制备具有两种不同孔径范围的分层次双峰多孔结构3。功能材料通过具备结构分层性，可同时实现材料设计方法的两个基本目标：较大的比表面积以利于功能化，以及快速的传质通道，这两个目标彼此独立且本质上相互矛盾4,5。

电化学传感器的性能取决于电极的形貌，因为纳米基质的孔径对分子的传输和捕获至关重要。研究发现，较小的孔隙有助于在复杂样品中实现目标物的识别，而较大的孔隙则可增强目标分子的可及性，从而提高传感器的检测范围6。基于模板的制备、电镀、自下而上的合成化学法、薄膜溅射沉积7、以聚二甲基硅氧烷为支撑的复杂柔性基质8、多种金属合金化后选择性蚀刻掉较不贵金属，以及电沉积等方法，是常用于在电极中引入纳米结构的一些技术。其中，去合金化工艺是构建多孔结构的最佳方法之一。由于不同金属溶解速率的差异，牺牲性金属（即较不贵金属）显著影响电极最终的形貌。在制备纳米多孔金（NPG）结构的有效过程中，起始合金中的较不贵金属组分被选择性溶解，剩余原子重新排列并聚集，从而形成相互连通的孔隙与韧带网络9。

Ding 和 Erlebacher 用于制备这些纳米结构的去合金化/电镀/再去合金化方法，首先将由金和银组成的前驱体合金用硝酸进行化学去合金化处理，随后在较高温度下加热，形成具有单一孔径分布的上层分级结构，再通过第二次去合金化去除残余的银，从而生成下层分级结构。该方法适用于薄膜材料。10建议采用由两种相对更活泼的贵金属组成的三元合金，这些贵金属可依次被蚀刻去除；Biener 等人指出，从 Cu-Ag-Au 材料中先后去除 Cu 和 Ag，可留下具有双峰结构的低密度 NPG 样品11长程有序结构无法通过使用三元合金所概述的工艺获得。Zhang 等人采用 Al-Au 母合金，通过去除其中一相获得了更大的孔洞，从而形成有序度较低的双峰结构。12据报道，通过控制多个长度尺度并采用包括将块体材料解离以及将基本组分重新组装成更大结构的加工路径，已成功构建出有序的层级结构。在此情况下，制备出了一种层级化的NPG结构。 通过 直接墨水书写（DIW）、合金化、去合金化13.

本文介绍了一种通过使用不同Au-Ag合金成分来制备具有分级双模态纳米多孔金（hb-NPG）结构的两步去合金化方法。理论上，去合金化停止时活性元素所剩余的含量即为脱合金极限（parting limit）。表面扩散动力学受脱合金极限或去合金化阈值的影响较小，该阈值通常在原子百分比50%至60%之间，适用于从二元合金中通过电解溶解去除较活泼组分的过程。为了成功合成hb-NPG，Au:Ag合金中必须含有较高的银原子分数，因为当银浓度接近脱合金极限时，电化学和化学去合金化过程均无法顺利完成14。

该方法的优点在于可以严格控制结构和孔径大小。方案中的每一步对于精确调控典型的孔隙长度尺度以及骨架之间的典型距离都至关重要15。为了调节离子在界面处的扩散和溶解速率，所施加的电压经过精确校准。为了防止去合金化过程中产生裂纹，需控制银的溶解速率。

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方案

1. 在金丝上构建具有分级双峰结构的纳米多孔金涂层——合金化

  1. 在5 mL烧杯中组装一个电化学池。使用带有三个孔的聚四氟乙烯（Teflon）材质盖子，以容纳三电极体系。
    注意：聚四氟乙烯是制作盖子的常用材料，因为它不与其他化学物质发生反应。
  2. 将铂丝对电极、Ag/AgCl（饱和KCl）参比电极，以及一根直径为0.2 mm、长度为5.0 mm的金丝作为工作电极（见材料表），分别方便地插入盖子的各个孔中。保持工作电极与对电极之间的距离为0.7 cm。
    注意：金丝总长度为1 cm，在夹上鳄鱼夹后，浸入溶液中的裸露部分为0.5 cm，其余部分用聚四氟乙烯胶带包裹（见材料表）。每次实验时均需使用刻度尺精确测量该长度。金丝在用于实验前需经过多步清洗：首先浸入浓硝酸中，然后冲洗并浸入piranha溶液，最后再浸入硼氢化钠溶液中。这些强试剂有助于去除附着在金丝表面的任何杂质。
  3. 分别配制50 mM的K[Ag(CN)2]和K[Au(CN)2]水溶液（见材料表）。向5 mL烧杯中加入0.5 mL K[Au(CN)2]溶液和4.5 mL K[Ag(CN)2]盐溶液。
    警告：操作和处置氰化物盐类时需格外小心。操作时应佩戴防护手套、适当防护服、呼吸防护设备和眼部保护装置，并在通风橱中进行。实验结束后，必须收集氰化物盐溶液，并置于单独且明确标识的废液容器中。氰化物盐溶液接触酸时会释放有毒气体。为保持离子迁移能力，向两种盐的40 mM储备液中各加入0.25 M Na2CO3。
  4. 将磁力搅拌子放入电化学池中，以300 rpm的恒定速度充分搅拌溶液。
    注意：确保搅拌子清洁。若存在污染物，可用王水清洗。
  5. 使用内径1/32英寸（in）、外径5/32 in、壁厚1/16 in的硅胶管（见材料表），将氩气通入电化学池内的溶液中，以除去电解液中溶解的氧气。
    注意：通过确保装置密封良好，避免漏气。
  6. 电化学池完全组装后，使用鳄鱼夹将恒电位仪连接至相应的电极。
    注意：最好在鳄鱼夹上标注其连接的电极名称，以避免混淆。
  7. 开启恒电位仪后，使用软件（PowerSuite；见材料表）通过计时电流法进行电沉积。根据所需参数设置软件。设定电位在-1.0 V15下恒定，持续600 s。
    注意：应在系统启动过程自然完成后，再设定参数。补充文件1提供了该软件操作的截图示例。
  8. 点击运行，并选择外接电池，以完成在工作电极上的合金沉积。过程结束后，可在电极表面观察到一层厚实的白色涂层。
    ​注意：确保所有连接牢固，且溶液稳定搅拌。若一切正常，电流将在300至400 µA之间振荡。

2. 在金丝上构建具有分级双峰结构的纳米多孔金涂层——去合金化

注意：本方案的这一阶段基于合金丝的部分脱合金化。

  1. 再次按照先前的步骤（步骤 1.2）配置电化学池，使三个电极在电解液中相互间距保持 0.7 cm。使用 4 mL 的 1 N 硝酸作为电解液，用于部分去合金化。
    注意：由于电解液被稀释，因此不会完全去除较不贵重的元素，此处为银。
  2. 保持搅拌子持续运转，以 300 rpm 的恒定速度均匀搅拌溶液。
  3. 电化学池组装完成后，使用鳄鱼夹将恒电位仪连接至相应的电极。
  4. 再次使用计时电流法软件，但此次选择 0.6 V 的电位，持续 600 s。
  5. 按下 运行，然后选择 外接池，以完成对工作电极上沉积合金的去合金化过程。
    注意：此步骤后，导线颜色变为灰黑色。

3. 在金丝上构建具有分级双峰结构的纳米多孔金涂层——退火

  1. 将去合金化的金属丝置于玻璃小瓶中，并放入炉内。
  2. 将炉温维持在 600 °C，持续 3 小时。
    注意：该温度和时间的选择基于优化实验研究，结果表明，较低温度无法使孔隙粗化，而较高温度或更长时间则会导致结构产生裂纹。
  3. 程序结束后关闭炉子，取出小瓶。等待小瓶冷却至室温。
    ​注意：使用镊子从炉中取出高温的小瓶。

4. 在金丝上构建具有分级双峰结构的纳米多孔金涂层——去合金化

  1. 将部分去合金化-退火处理的金属丝浸入4 mL浓硝酸中。
    注意：将浓酸转移至含有金属丝的玻璃小瓶时，务必使用玻璃移液管。
  2. 将部分去合金化-退火处理的金属丝置于含有浓硝酸的玻璃小瓶中，在通风橱内静置过夜。
    注意：去合金化时间保持24小时，以确保完全去合金化。
  3. 次日制备具有双峰结构的多孔金（hb-NPG）涂层金属丝（图1）。使用前需用去离子水充分冲洗，再用乙醇冲洗，随后用于后续研究。干燥后即可用于实验。每次制备hb-NPG时均使用一批新的洁净金丝。
    ​注意：合成过程中的每一步均至关重要，以获得双峰孔结构。若跳过任何步骤，将仅形成单峰孔结构。

5. hb-NPG 的表征

  1. 扫描电镜（SEM）样品制备
    1. 确保使用洁净的铝制样品台作为SEM成像样品制备的基底。
      注意：样品台使用稀硝酸清洗，经乙醇冲洗后干燥，并在再次使用前保存在覆盖石蜡膜的容器中。
    2. 将一段新剪裁的导电碳胶带贴在铝制样品台的平坦表面上。
    3. 借助镊子，剪取一小段涂有hb-NPG的金属丝，并将其粘附在碳胶带上。
      注意：使用镊子夹持金属丝时应轻柔，以防涂层脱落。
    4. 将剪下的样品段水平排列，以便在扫描电镜下观察其形貌（见材料表）；若垂直排列，则可显示沉积在金丝表面材料的厚度（图2）。
      注意：若电极含有水分，会导致腔室污染，从而产生模糊图像。因此，在进行SEM成像前，应将样品置于真空中过夜。
  2. SEM腔室设置
    1. 在软件"XT microscope"中选择"vent"选项，以释放腔室压力，便于打开腔室门。
      注意："XT microscope"软件随SEM系统提供。腔室必须完全放气后才能顺利打开，通常需要3–5分钟。此外，氮气钢瓶的压力必须低于5 psi。补充文件1展示了该特定软件操作的截图。
    2. 使用特制镊子的弯曲前端牢固夹住圆形铝制样品台，将先前置于其上的洁净样品放入腔室，并放置在样品台上。
      注意：确保样品台清洁；如有残留物，需用丙酮和无尘擦拭布清除（见材料表）。
    3. 将样品放入腔室后，选择"pump"选项，以建立真空环境。
      注意：抽真空过程约需3分钟。在开启电子束前，用户需等待抽真空完成。
    4. 利用导航相机，点击实时图像以观察样品的精确位置。
  3. 样品成像
    1. 首先开启电子束，以获取样品的初始图像。
      注意：开启电子束前，必须确认系统已达到真空状态。
    2. 为将导航相机所捕获的样品图像移至屏幕中央并优化聚焦，可双击该图像。
    3. 确保图像通过配套软件及Everhart-Thornley探测器（ETD）进行成像。需优化束斑大小、扫描速率和加速电压。
      注意：通常建议从较低的加速电压和束斑大小开始，再逐步提高。
    4. 调节样品台与电子束源之间的距离至10 mm。
      注意：为精确测量样品台与电子源之间的距离，系统必须聚焦并连接Z轴。
    5. 在低倍率下获得清晰聚焦图像后，进一步提高放大倍数以观察更精细的结构（图3）。
      注意：每次提高放大倍数后均需重新聚焦。
  4. 利用扫描电镜与能量色散X射线光谱（EDS）分析样品的元素组成
    1. 在软件中选择彩色SEM模式，以确定材料的元素组成（图4）。系统会自动为样品中不同元素分配不同颜色，但也可手动选择颜色与对应元素。
      注意：必须仔细检查元素组成分析图谱及各元素的原子百分比，排除原子百分比为0的元素选项。
    2. 插入EDS探测器，对样品进行能量色散X射线光谱分析。采集EDS数据时使用15 kV加速电压和12的束斑大小。
      注意：按下插入按钮后，屏幕将实时显示探测器已插入的状态。
    3. 确认程序允许在样品图像界面上创建小方框，以选择特定区域进行元素组成信息采集。
      ​注意：为获得准确的统计结果，总计数应在50,000至100,000之间。面板显示所采集数据的整体状态，分析结束后将生成报告。

6. 电化学活性表面积的循环伏安法（CV）

  1. 进行氧化金剥离法，该方法包括手动搭建一个电化学池，将参比电极、对电极和工作电极浸入电解液中。
    注意：在本研究中，铂丝作为对电极，hb-NPG 作为工作电极，Ag/AgCl 作为参比电极，0.5 N 硫酸作为电解液。建议在使用前用稀硝酸清洗参比电极和对电极。此外，避免重复使用电解液。
  2. 将电极连接至恒电位仪后，在程序中选择循环伏安（CV）选项并设置参数。设定电位范围从 -0.2 V 至 1.6 V（图5），再返回至 -0.2 V（相对于 Ag/AgCl），扫描速率为 100 mV/s。
    注意：无需搅拌。
  3. 点击 运行 按钮以执行循环扫描。确保反向扫描中出现明显的还原峰。利用文献报道的转换因子 400 µC cm-2，对金氧化物单层还原所产生的峰下电荷进行积分，以确定 hb-NPG 丝的电化学活性表面积。
    注意：必须正确绘制切线，以准确积分峰下的电荷量。
  4. 在化学去合金化后的丝材上，以及在 Au:Ag (10:90) 合金丝经过化学与电化学双重去合金化处理后，进行完全相同的实验，以理解双重去合金化工艺的关键意义。

7. 研究蛋白质加载的溶液耗尽技术

  1. 为研究蛋白质分子在hb-NPG表面的实时吸附过程，使用紫外-可见（UV-vis）分光光度计（参见材料表）。
    注意：本研究中，分别将胎球蛋白（fetuin）、牛血清白蛋白（BSA）和辣根过氧化物酶（HRP）（参见材料表）溶于0.01 M（pH = 7.4）磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成浓度分别为1 mg/mL、0.5 mg/mL和1 mg/mL的蛋白溶液。选择能够维持蛋白质稳定性的缓冲液和pH值至关重要。
  2. 仅使用缓冲液进行基线校正。校正完成后，设置软件参数，包括波长、时间和速率。然后，将500 µL蛋白溶液加入比色皿中。
  3. 将hb-NPG加入溶液后，确保实时蛋白质监测立即开始。按下开始按钮后，在280 nm波长下每分钟监测一次吸光度变化，持续120分钟（图6）。

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结果

韧带尺寸和韧带间间隙的调整对于制备的电极至关重要。通过优化金/银比例构建具有双尺寸孔隙的结构是本研究的第一步，同时结合表面形貌、粗糙度因子和负载能力的表征进行分析。与传统的纳米多孔金（NPG）相比，双峰孔隙结构表现出更高的电化学比表面积、粗糙度因子和蛋白质负载能力15。

经过化学去合金化后，hb-NPG呈现出开放且相互连通的配体与孔隙网络结构。其中，较大的孔洞属于较高层级，而较小的孔隙则属于较低层级。图3展示了具有分级双峰结构的电极的扫描电镜（SEM）图像。图4展示了hb-NPG制备过程中各步骤的颜色编码元素分布图，其中红色和黄色分别代表银和金。SEM能够为不同区域分配特定颜色，这是该仪器的一项有用功能。

电化学活性表面积（ECSA）与几何表面积的比例可得出各电极的粗糙度因子。通过利用金氧化物还原峰下方的电荷，采用循环伏安法（CV）评估ECSA，发现hb-NPG...

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讨论

通过涉及合金化、部分去合金化、热处理和酸蚀刻的多步工艺，制备出具有双尺寸孔隙和更高活性电化学表面积的层次化多孔金（NPG）。

在合金化过程中，金属前驱体的标准电位会影响它们在电沉积过程中的反应活性。液相溶液中的 Au 和 Ag 离子在电沉积过程中被还原16,17。

以下半反应17描述了金和银氰化物盐溶液的电化学溶解过程：

Au(CN)2- + 1e-

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助（项目编号：GM111835）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
压缩氩气Fisher Scientific Compay
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)A9418> 98% 纯度
对电极（铂丝）Alfa Aesar43288-BU直径 0.5 mm
数字实验室炉Barnstead Thermolyne 47,900F47915用于高温退火
数字恒电位仪/恒电流仪EG&G Princeton Applied Research273APowerPULSE 软件
乙醇Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)CAS-64-17-5高效液相色谱/分光光度级
胎牛血清来源的胎球蛋白（Fetuin）Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)F2379冻干粉末
金丝卷Electron Microscopy Sciences (Fort Washington, PA)73100直径 0.2 mm，长度 10 英尺，纯度 99.9%
盐酸Fisher ChemicalA144C-21236.5–38%
过氧化氢Fisher Scientific (Pittsburg, PA)CAS-7732-18-530%
Kimwipes 擦拭纸KIMTECH Science 品牌，Kimberly-Clark Professional341204.4 × 8.2 英寸
硝酸Fisher Scientific (Pittsburg, PA)A2008-212痕量金属级
Parafilm 封口膜Bemis PM99613-374-104 英寸 × 125 英尺
辣根过氧化物酶（HRP）Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)9003-99-0
PharMed 硅胶管NortonAY242606 内径 1/32"，外径 5/32"，壁厚 1/16"，长度 25 英尺
二氰合银酸钾Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)37916699.96%，10 克
二氰合金酸钾Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)38986799.98%，1 克
PowerSuite 软件EG&G Princeton Applied Research随仪器提供
聚四氟乙烯（PTFE）胶带Fisherbrand15-078-261宽 1"，长 600"
参比电极（Ag/AgCl）Princeton Applied Research K0265
扫描电子显微镜（SEM）Apreo 2CThermoFisher ScientificAPREO 2 SEM配备 Color SEM 技术
Simplicity UV 系统Millipore Corporation, Boston, MA, USASIMSV00WW用于制备 Milli-Q 水（25 °C 时电阻率为 18.2 MΩ·cm） 
硼氢化钠Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)213462100 克
碳酸钠Sigma-Aldrich (St.Louis, MO)452882酶级，>99%，100 克
搅拌子Fisherbrand14-512-1535 × 2 mm
硫酸Fisher Scientific (Pittsburg, PA)A300C-212符合 ACS Plus 认证标准
Supracil 石英比色皿Fisher Scientific (Pittsburg, PA)14-385-902C光程 10 mm，容积 1 mL
紫外-可见分光光度计Varian Cary 50

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Versatile Technique to Produce a Hierarchical Design in Nanoporous Gold
Posted by JoVE Editors on 3/10/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Versatile Technique to Produce a Hierarchical Design in Nanoporous Gold. The Authors section was updated from:

Palak Sondhi1
Dharmendra Neupane2
Jay K. Bhattarai3
Hafsah Ali1
Alexei V. Demchenko4
Keith J. Stine1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Missouri-Saint Louis
2Food and Drug Administration
3Mallinckrodt Pharmaceuticals Company
4Department of Chemistry, Saint Louis University

to:

Palak Sondhi1
Dharmendra Neupane1
Jay K. Bhattarai2
Hafsah Ali1
Alexei V. Demchenko3
Keith J. Stine1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Missouri-Saint Louis
2Mallinckrodt Pharmaceuticals Company
3Department of Chemistry, Saint Louis University

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