本文介绍了一种详细的小鼠子宫骶韧带及其他盆底组织（包括子宫颈、直肠和膀胱）的解剖方案，以拓展对雌性生殖组织的研究。
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本文内容
摘要
摘要
盆腔器官脱垂（POP）是一种影响盆底完整性、结构及机械支撑功能的疾病。盆底器官由多种解剖结构提供支持，包括肌肉、韧带和盆筋膜。子宫骶韧带（USL）是关键的承重结构，其损伤会显著增加发生POP的风险。本方案描述了小鼠子宫骶韧带及盆底器官的解剖方法，并结合拉曼光谱技术获取子宫骶韧带的生化组成与功能的独特数据，同时评估其力学行为。小鼠是临床前研究中极为宝贵的模型，但小鼠子宫骶韧带的解剖过程复杂且困难。本操作流程提供了一种系统方法，指导小鼠盆底组织（包括子宫骶韧带）的解剖，以实现多种评估与表征分析。本研究旨在帮助基础科研人员和工程技术人员更有效地进行盆底组织解剖，从而提升对子宫骶韧带及盆底疾病的研究可及性，并推动利用小鼠模型开展女性健康相关的临床前研究。
引言
约50%的女性受到盆腔器官脱垂（POP）的影响1,2。其中约11%的女性符合手术修复的指征，但手术成功率较低（约30%）3,4。POP是由于子宫骶韧带（USL）和盆底肌肉无法提供足够的支撑，导致一个或多个盆腔器官（如膀胱、子宫、宫颈和直肠）从其正常位置下移所致5。该疾病涉及解剖功能障碍、结缔组织破坏以及神经肌肉损伤，并与多种易感因素相关3,6。POP与多种因素相关，包括年龄、体重、产次及分娩方式（如阴道分娩或剖宫产）。这些因素被认为会影响盆底所有组织的机械完整性，其中妊娠和产次被认为是导致POP的主要驱动因素5,7,8。
子宫骶骨韧带（USLs）是子宫、宫颈和阴道的重要支持结构，将宫颈固定于骶骨4。USLs的损伤会增加女性发生盆腔器官脱垂（POP）的风险。据认为，妊娠和分娩会对USL施加额外的张力，可能导致其损伤，从而增加发生POP的可能性。USL是一种复杂的组织，由平滑肌细胞、血管和淋巴管组成，这些成分沿韧带呈非均匀分布，并可将USL分为三个不同区域：宫颈部、中间部和骶骨部9。USL的机械完整性依赖于细胞外基质（ECM）成分，如胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖5,9,10。I型胶原纤维是韧带组织中主要的抗张力负荷成分，因此可能在USL功能障碍及POP的发生中起重要作用11。
目前对于女性盆腔器官脱垂（POP）的病因、患病率及其影响仍缺乏足够的认识。建立合适的动物模型对于深入理解女性盆底结构至关重要。小鼠与人类在盆腔内的解剖标志具有相似性，例如输尿管、直肠、膀胱、卵巢以及圆韧带9，并且子宫骶韧带（USL）与子宫、宫颈及骶骨的交汇点也类似。此外，小鼠易于进行基因操作，具有成为一种易获取、成本效益高的POP研究模型的潜力9。
本研究建立了一种方法，用于获取并分离未产（即从未怀孕）小鼠的子宫骶韧带（USL）及不同的盆底组织。提取的USL经过酶消化处理（即去除胶原蛋白和糖胺聚糖），并在概念验证研究中进行了拉伸载荷下的力学响应测试以及生化成分分析。成功分离完整组织的能力将有助于进一步对盆底结构进行力学和生化特性表征，这是深入理解与分娩、妊娠及盆腔器官脱垂（POP）相关损伤风险的关键第一步。
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方案
所有动物实验和操作均按照科罗拉多大学博尔德分校动物护理与使用委员会批准的方案 #2705 进行。本研究使用六周龄雌性 C57BL/6J 小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 动物准备
- 按照机构批准的方法实施动物安乐死。
注意：本研究使用了 CO2 根据美国兽医协会（American Veterinary Medical Association）指南进行吸入麻醉（CO₂置换速率为容器体积的30%至70%）2 每分钟，随后进行颈椎脱位，以确保安乐死成功。- 在通风橱中操作，以尽量减少小鼠过敏原的扩散。待小鼠停止活动和呼吸后，再观察2分钟或更长时间，以确认无任何反应。
注意：如果小鼠处于妊娠期或产后，仔鼠必须单独实施安乐死。对于E15.5及以上阶段的仔鼠，在解剖过程中必须进行断头处理。
- 在通风橱中操作，以尽量减少小鼠过敏原的扩散。待小鼠停止活动和呼吸后，再观察2分钟或更长时间，以确认无任何反应。
- 准备解剖装置，包括解剖板、11号刀片手术刀、弯曲细尖剪刀、两对镊子、弯镊、5-0 聚乙醇酸缝线、解剖显微镜和六枚固定针图1，参见 材料清单).
- 将小鼠置于垫上，并固定前肢图 2A用剪刀在腹部做一个约1-1.5 cm的切口（图 2B）。用剪刀轻轻分离切口的颅侧、尾侧和两侧的皮肤（图2C，D).
- 将小鼠翻转至背侧，轻轻向后肢方向剥离皮肤，使皮肤远离解剖部位（图2E- H).
- 将小鼠四肢固定图2I），从胸腔至骨盆沿腹部做约1 cm的切口（图 2J).
注意：确保不要损伤下方的器官。 - 轻轻地将器官推向胸腔，以清除视野图 2K).
注意：用1x PBS冲洗组织以保持其湿润。 - 清除盆底的所有脂肪组织（图 2L-).
注意：使用镊子轻轻牵拉并清除目标器官和组织上的脂肪。
图1：进行解剖所需所有工具的整洁工作台。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：小鼠皮肤的去除及盆腔和胸腔的打开。（A）固定所有四肢。（B）初始切口。（C）使用剪刀将皮肤与下方筋膜分离。（D）剪开皮肤并准备去除。（E–G）环绕小鼠将皮肤剥离。（H）完全去除背部皮肤。（I）从躯干完全去除皮肤，并重新固定小鼠四肢。（J）打开腹腔。（K）打开后的腹腔视图。（L）将器官移出视野范围。（M）去除脂肪组织。（N）清理后的盆底视图。请点击此处查看该图的放大版本。
2. USL 的获取
- 从卵巢处切断子宫角（图3B），将其拉离视野，并在宫颈连接处切断（图3C）。
注意：可根据 图3A 中的示意图识别子宫骶韧带（USL）。用1×PBS冲洗组织以保持其湿润。 - 从膀胱连接处分开并切断输尿管（图3D）。
注意：此举可避免与子宫骶韧带（USL）混淆。 - 尽可能靠近宫颈处切断结肠（图3E、F）。
注意：用1×PBS冲洗组织以保持其湿润。 - 将小鼠连同解剖垫一起置于解剖显微镜下，以观察子宫骶韧带（USL）（图3G）。
- 用镊子轻轻清除子宫骶韧带（USL）周围的脂肪组织。
注意：可使用另一把镊子将宫颈轻轻抬起，形成一个小角度，以增强子宫骶韧带（USL）与宫颈交界处的可视性。用1×PBS冲洗组织以保持其湿润。 - 在两侧子宫骶韧带（USL）的宫颈端分别结扎一根5-0聚乳酸羟基乙酸缝合线（图4B、C）。
注意：可通过示意图及放大图像（图4I–K）识别子宫骶韧带（USL）。 - 在本研究中，一侧子宫骶韧带（USL）用于形态学或生物化学分析（如拉曼显微镜、免疫组织化学、组织学）。切断该侧USL的宫颈端，保留一小段宫颈组织相连，并从USL底部切下一小段肌肉组织（图4D）。将分离的组织置于含1×PBS的容器中，以保持组织湿润（图4G、H）。
- 使用另一侧剩余的子宫骶韧带（USL）进行力学测试和成像。切断该侧USL的宫颈端，保留一小段宫颈组织相连，以便于力学测试装置的固定（图4D）。
注意：宫颈组织将作为锚定点，在力学测试过程中固定子宫骶韧带（USL）。 - 在完成所有目标组织的采集后（步骤3–5），将股骨从骨盆中脱位（图4E）。
注意：当股骨头从髋臼窝中脱出时，应可听到轻微的“咔哒”声。 - 从骨盆骨的远端和近端切断骨盆骨，保留约10 mm的总组织长度（图4F）。将分离的组织置于1×PBS中。
图3：子宫骶韧带（USL）解剖的盆底清除。（A）解剖结构示意图。（B）在卵巢连接处切断子宫角。（C）切除子宫角。（D）切断输尿管。（E）切断结肠。（F）直肠和子宫骶韧带（USLs）的清晰视野。（G）将小鼠和解剖垫置于解剖显微镜下。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：子宫骶韧带（USL）及其周围组织的视图与USL的解剖过程。（A）USL周围解剖标志的示意图。（B）在宫颈端周围打结缝合线。（C）切除USL的宫颈端。（D）在骶骨连接处切下用于生化分析的USL。（E）从骨盆骨上切断股骨。（F）切除骨盆近端部分。（G）在35 mm培养皿中解剖USL。（H）附着骨盆的USL置于35 mm培养皿中。（I）在0.75倍放大倍数下观察USL和直肠。（J）去除USL上的脂肪组织。（K）在1.0倍放大倍数下清理USL。比例尺 = 2 mm。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 膀胱采集
- 清除脂肪后，用镊子夹住膀胱，并以大约 40° 的角度轻轻提起（图 5A）。
- 用剪刀从远端开始，在宫颈正上方将膀胱剪下（图 5B）。
- 将组织置于含有 1× PBS 的容器中，以保持组织湿润（图 5H）。
4. 直肠组织的采集
- 当子宫骶韧带（USLs）与宫颈分离且膀胱被解剖后，用镊子以大约40°的角度抬起宫颈。此处存在连接直肠与宫颈的直肠阴道筋膜。使用手术刀轻轻切断此连接（图5C，D）。
- 使用剪刀在耻骨联合处切断耻骨。轻柔地扩大操作空间，以增加对组织附着点的视野。
- 用镊子轻轻将直肠向胸侧牵拉，并使用剪刀沿直肠后侧直至肛门处进行分离。在肛门处切断直肠（图5E）。
- 将组织置于1×PBS中以保持其湿润状态（图5I）。
5. 宫颈-阴道复合体的采集
- 取出子宫韧带（USL）后，用镊子夹住宫颈，并用剪刀尽可能靠近外阴处剪断宫颈（图 5F、G）。
注意：需剪断耻骨联合，以便直观观察到阴道远端。 - 将组织置于 1× PBS 中以保持组织湿润（图 5J）。
图 5：膀胱、直肠及宫颈/阴道解剖示意图。（A）以一定角度夹持膀胱。（B）切除膀胱。（C）切断连接宫颈与直肠的肌腱。（D）肌腱在1.0倍放大下的图像。（E）切割直肠。（F）用镊子夹住宫颈。（G）在阴道远端进行切割。（H）置于35 mm培养皿中的膀胱。（I）置于35 mm培养皿中的直肠。（J）置于35 mm培养皿中的宫颈-阴道组织复合体。请点击此处查看该图的高清版本。
6. 组织表征的样品制备
- 子宫骶韧带（USL）的机械与视觉分析
- 将带有盆腔附着端的 USL 置于定制染色孔中一个 T 形墙结构上，以确保其完全浸入染色液中（该染色孔的 CAD 设计图见补充代码文件 1和补充代码文件 2）。
注意：使用缝线和镊子辅助放置。 - 将一种市售的可标记游离胺基团的染料（5 µL，参见材料表）用 2.5 mL 的 1x PBS 稀释，加入定制染色孔中，在 4 °C 条件下于摇床上染色 2 小时。
注意：在加入染色孔前需涡旋混匀溶液。 - 在染色过程的最后 15 分钟，向溶液中加入 2.5 µL 的市售死细胞核染料（参见材料表）。
注意：在加入染色孔前需先涡旋混匀溶液。
- 将带有盆腔附着端的 USL 置于定制染色孔中一个 T 形墙结构上，以确保其完全浸入染色液中（该染色孔的 CAD 设计图见补充代码文件 1和补充代码文件 2）。
- USL 的拉曼光谱分析
- 将 USL 以直线形态固定在置于定制孔中的聚二甲基硅氧烷（PDMS）块上。
注意：PDMS 作为柔软基底，便于将样本固定成所需构型。可通过按制造商说明混合两种组分（参见材料表），在培养皿中浇铸，并在聚合后使用手术刀片切割成所需几何形状，从而制备不同尺寸的 PDMS 块。 - 在缝线环和盆腔肌肉处使用昆虫针固定，并用 1x PBS 润湿组织。
- 将 USL 以直线形态固定在置于定制孔中的聚二甲基硅氧烷（PDMS）块上。
- 剩余组织处理
- 根据后续分析需求，使用液氮或适当的包埋介质对剩余组织进行速冻处理。
- 将组织保存于 −80 °C，以备后续分析（如免疫组织化学或生化检测）。
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结果
野生型小鼠解剖过程的每一步均在与本实验方案相关的视频和图示中有详细说明。本研究使用了6周龄的雌性C57BL/6J小鼠（补充表1）。分析了三组经不同酶处理的子宫骶骨韧带（USL）样本：对照组（无处理）、胶原酶处理组和软骨素酶处理组。USL中的平滑肌、神经和淋巴管被富含纤维胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）的细胞外基质（ECM）所包绕5，这些成分被认为为组织提供了机械完整性。选择这些酶处理的目的是破坏ECM中的特定组分，以证明利用拉曼光谱和机械（拉伸）测试来解析其生化与力学差异的可行性。
进行消化时，将所有USL样本置于含有1 mL溶液的恒温混匀仪中，在37 °C、300 rpm条件下孵育3小时。对照组USL样本置于1×PBS溶液中，胶原酶处理组USL样本置于含有1.0 U/mL I型胶原酶的溶液中，软骨素酶处理组USL样本置于含有2.0 U/mL ABC型软骨素酶的溶液中（见材料表）。
根据步骤6.1制备用于力学测试的...
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讨论
结构损伤对女性生殖组织的影响研究尚不充分，盆腔器官脱垂（POP）研究亟需一种易于获取的动物模型。小鼠是一种经济高效的模型，可模拟人类生殖系统的研究16。由于人们对女性生殖系统的研究兴趣日益增加，亟需有助于这些组织研究的方法。为满足这一需求，本研究建立了一种用于分离和制备小鼠盆底组织以进行结构与功能分析的方法。
为了确保解剖成功，需要充足的时间和细致的操作。小鼠生殖组织体积小且脆弱，在清除子宫骶韧带（USL）及盆腔器官周围脂肪时，必须格外注意细节，以避免在去除脂肪时损伤USL或其他组织。使用解剖显微镜有助于区分USL与脂肪组织，因为未经训练的肉眼很容易将二者混淆。去除输尿管有助于避免与USL混淆，因为输尿管和USL在膀胱及宫颈处的插入点彼此靠近。在对USL进行缝合打结时，应使用镊子轻轻提起USL，为缝合针留出空间，操作过程中需小心避免穿刺任何组织。在提取USL时，正确识别目标组织结构和关键解剖标志可能较为困难，但通过本方法并加以练习，可实现可重复的解剖结果。
该方法提出了一种从单个...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了科罗拉多大学博尔德分校暑期地下研究机会计划（UROP）资助（C.B.）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金（L.S.）、施密特科学奖学金（C.L.）以及科罗拉多大学研究基金的资助 & 创新种子基金项目（2020年授予V.F.、S.C.和K.C.），以及科罗拉多大学Anschutz Boulder Nexus种子基金（授予V.F.和K.C.）。特别感谢Tyler Tuttle博士在加载室设计方面的帮助，以及Calve实验室成员在讨论中提供的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 11 号刀片 | Fisher | 3120030 | 可拆卸刀片 |
| 1× PBS | Fisher | BP399-1 | 由 10× 浓缩液稀释而成 |
| 硫酸软骨素酶 ABC | Sigma | C3667-10UN | 酶 |
| I 型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004194 | 酶 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | STELLARIS 5 | 直立式配置 |
| 解剖显微镜 | Leica | S9E | 带相机 |
| Dumont #5 镊子 | Fisher | NC9626652 | 细尖头 |
| 雌性 C57BL/6J 小鼠 | Jackson Laboratory | 品系编号: 000664 | |
| FemtoTools 微操作器 | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN 负载传感器 |
| FST 弯头镊 | Fisher | NC9639443 | 弯头尖端 |
| FST 锐利 9 mm 剪刀 | Fisher | NC9639443 | 解剖剪刀 |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | 游离胺染料 |
| Kimwipes 擦拭纸 | Fisher | 06-666 | 每盒 50 张 |
| OCT 包埋剂 | Tissue Tek | 4583 | 用于组织保存 |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | 按照制造商说明操作 |
| 35 mm 培养皿 | Fisher | FB0875711A | 用于盛放解剖组织 |
| 5-0 聚乳酸羟基乙酸缝合线 | Veter.Sut | VS385VL | 带针 |
| Renishaw InVia 拉曼显微镜 | Renishaw | PN192(EN)-02-A | 配备共焦物镜 |
| 摇床平台 | VWR | 10127-876 | 双层平台 |
| 外科手套 | Fisher | 52818 | 用于解剖 |
| Sytox 核染料 | Thermo Fisher | S11381 | 细胞核染色剂 |
| T 形针 | Fisher | S99385 | 用于解剖 |
| 移液管 | Fisher | 13-711-7M | 用于解剖 |
| 吸水垫 | Fisher | 22037950 | 覆盖解剖垫使用 |
参考文献
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