本文介绍了一种详细的小鼠子宫骶韧带及其他盆底组织（包括子宫颈、直肠和膀胱）的解剖方案，以拓展对雌性生殖组织的研究。
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本文内容
摘要
摘要
盆腔器官脱垂（POP）是一种影响盆底完整性、结构及机械支撑功能的疾病。盆底器官由多种解剖结构提供支持，包括肌肉、韧带和盆筋膜。子宫骶韧带（USL）是关键的承重结构，其损伤会显著增加发生POP的风险。本方案描述了小鼠子宫骶韧带及盆底器官的解剖方法，并结合拉曼光谱技术获取子宫骶韧带的生化组成与功能的独特数据，同时评估其力学行为。小鼠是临床前研究中极为宝贵的模型，但小鼠子宫骶韧带的解剖过程复杂且困难。本操作流程提供了一种系统方法，指导小鼠盆底组织（包括子宫骶韧带）的解剖，以实现多种评估与表征分析。本研究旨在帮助基础科研人员和工程技术人员更有效地进行盆底组织解剖，从而提升对子宫骶韧带及盆底疾病的研究可及性，并推动利用小鼠模型开展女性健康相关的临床前研究。
引言
约50%的女性受到盆腔器官脱垂（POP）的影响1,2。其中约11%的女性符合手术修复的指征，但手术成功率较低（约30%）3,4。POP是由于子宫骶韧带（USL）和盆底肌肉无法提供足够的支撑，导致一个或多个盆腔器官（如膀胱、子宫、宫颈和直肠）从其正常位置下移所致5。该疾病涉及解剖功能障碍、结缔组织破坏以及神经肌肉损伤，并与多种易感因素相关3,6。POP与多种因素相关，包括年龄、体重、产次及分娩方式（如阴道分娩或剖宫产）。这些因素被认为会影响盆底所有组织的机械完整性，其中妊娠和产次被认为是导致POP的主要驱动因素5,7,8。
子宫骶骨韧带（USLs）是子宫、宫颈和阴道的重要支持结构，将宫颈固定于骶骨4。USLs的损伤会增加女性发生盆腔器官脱垂（POP）的....
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方案
所有动物实验和操作均按照科罗拉多大学博尔德分校动物护理与使用委员会批准的方案 #2705 进行。本研究使用六周龄雌性 C57BL/6J 小鼠。实验动物购自商业来源（见材料表）。
1. 动物准备
- 按照机构批准的方法实施动物安乐死。
注意：本研究使用了 CO2 根据美国兽医协会（American Veterinary Medical Association）指南进行吸入麻醉（CO₂置换速率为容器体积的30%至70%）2 每分钟，随后进行颈椎脱位，以确保安乐死成功。- 在通风橱中操作，以尽量减少小鼠过敏原的扩散。待小鼠停止活动和呼吸后，再观察2分钟或更长时间，以确认无任何反应。
注意：如果小鼠处于妊娠期或产后，仔鼠必须单独实施安乐死。对于E15.5及以上阶段的仔鼠，在解剖过程中必须进行断头处理。
- 在通风橱中操作，以尽量减少小鼠过敏原的扩散。待小鼠停止活动和呼吸后，再观察2分钟或更长时间，以确认无任何反应。
- 准备解剖装置，包括解剖板、11号刀片手术刀、弯曲细尖剪刀、两对镊子、弯镊、5-0 聚乙醇酸缝线、解剖显微镜和六枚固定针图1，参见 材料清单).
- 将小鼠置于垫上，并固定前肢图 2A用剪刀在腹部做一....
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结果
野生型小鼠解剖过程的每一步均在与本实验方案相关的视频和图示中有详细说明。本研究使用了6周龄的雌性C57BL/6J小鼠（补充表1）。分析了三组经不同酶处理的子宫骶骨韧带（USL）样本：对照组（无处理）、胶原酶处理组和软骨素酶处理组。USL中的平滑肌、神经和淋巴管被富含纤维胶原蛋白和糖胺聚糖（GAGs）的细胞外基质（ECM）所包绕5，这些成分被认为为组织提供了机械完整性。选择这些酶处理的目的是破坏ECM中的特定组分，以证明利用拉曼光谱和机械（拉伸）测试来解析其生化与力学差异的可行性。
进行消化时，将所有USL样本置于含有1 mL溶液的恒温混匀仪中，在37 °C、300 rpm条件下孵育3小时。对照组USL样本置于1×PBS溶液中，胶原酶处理组USL样本置于含有1.0 U/mL I型胶原酶的溶液中，软骨素酶处理组USL样本置于含有2.0 U/mL ABC型软骨素酶的溶液中（见材料表）。
根据步骤6.1制备用于力学测试的.......
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讨论
结构损伤对女性生殖组织的影响研究尚不充分，盆腔器官脱垂（POP）研究亟需一种易于获取的动物模型。小鼠是一种经济高效的模型，可模拟人类生殖系统的研究16。由于人们对女性生殖系统的研究兴趣日益增加，亟需有助于这些组织研究的方法。为满足这一需求，本研究建立了一种用于分离和制备小鼠盆底组织以进行结构与功能分析的方法。
为了确保解剖成功，需要充足的时间和细致的操作。小鼠生殖组织体积小且脆弱，在清除子宫骶韧带（USL）及盆腔器官周围脂肪时，必须格外注意细节，以避免在去除脂肪时损伤USL或其他组织。使用解剖显微镜有助于区分USL与脂肪组织，因为未经训练的肉眼很容易将二者混淆。去除输尿管有助于避免与USL混淆，因为输尿管和USL在膀胱及宫颈处的插入点彼此靠近。在对USL进行缝合打结时，应使用镊子轻轻提起USL，为缝合针留出空间，操作过程中需小心避免穿刺任何组织。在提取USL时，正确识别目标组织结构和关键解剖标志可能较为困难，但通过本方法并加以练习，可实现可重复的解剖结果。
该方法提出了一种从单个.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了科罗拉多大学博尔德分校暑期地下研究机会计划（UROP）资助（C.B.）、美国国家科学基金会研究生研究奖学金（L.S.）、施密特科学奖学金（C.L.）以及科罗拉多大学研究基金的资助 & 创新种子基金项目（2020年授予V.F.、S.C.和K.C.），以及科罗拉多大学Anschutz Boulder Nexus种子基金（授予V.F.和K.C.）。特别感谢Tyler Tuttle博士在加载室设计方面的帮助，以及Calve实验室成员在讨论中提供的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 11 号刀片 | Fisher | 3120030 | 可拆卸刀片 |
| 1× PBS | Fisher | BP399-1 | 由 10× 浓缩液稀释而成 |
| 硫酸软骨素酶 ABC | Sigma | C3667-10UN | 酶 |
| I 型胶原酶 | Worthington Biochemical | LS004194 | 酶 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | STELLARIS 5 | 直立式配置 |
| 解剖显微镜 | Leica | S9E | 带相机 |
| Dumont #5 镊子 | Fisher | NC9626652 | 细尖头 |
| 雌性 C57BL/6J 小鼠 | Jackson Laboratory | 品系编号: 000664 | |
| FemtoTools 微操作器 | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN 负载传感器 |
| FST 弯头镊 | Fisher | NC9639443 | 弯头尖端 |
| FST 锐利 9 mm 剪刀 | Fisher | NC9639443 | 解剖剪刀 |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | 游离胺染料 |
| Kimwipes 擦拭纸 | Fisher | 06-666 | 每盒 50 张 |
| OCT 包埋剂 | Tissue Tek | 4583 | 用于组织保存 |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | 按照制造商说明操作 |
| 35 mm 培养皿 | Fisher | FB0875711A | 用于盛放解剖组织 |
| 5-0 聚乳酸羟基乙酸缝合线 | Veter.Sut | VS385VL | 带针 |
| Renishaw InVia 拉曼显微镜 | Renishaw | PN192(EN)-02-A | 配备共焦物镜 |
| 摇床平台 | VWR | 10127-876 | 双层平台 |
| 外科手套 | Fisher | 52818 | 用于解剖 |
| Sytox 核染料 | Thermo Fisher | S11381 | 细胞核染色剂 |
| T 形针 | Fisher | S99385 | 用于解剖 |
| 移液管 | Fisher | 13-711-7M | 用于解剖 |
| 吸水垫 | Fisher | 22037950 | 覆盖解剖垫使用 |
参考文献
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y. Pelvic organ prolapse. Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 43 (1), 15-26 (2016).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-in....
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重印与许可
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