本方案介绍了对来自野生型及患有儿茶酚胺能多形性室性心动过速的基因敲入型小鼠心脏进行的双染料光学标测，包括以高时间和空间分辨率记录跨膜电压和细胞内Ca2+瞬变的电生理学测量。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
儿茶酚胺能多形性室性心动过速 RyR2R2474S 基因敲入小鼠心脏的双染料光学标测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
具有致心律失常风险的心脏疾病儿茶酚胺能性多形性室性心动过速（CPVT）在体力活动、应激或儿茶酚胺刺激后表现为多形性室性心动过速发作，可能恶化为潜在致命的心室颤动。小鼠心脏是模拟包括CPVT在内的遗传性心脏心律失常疾病的常用动物模型。同步光学标测跨膜电位（Vm)以及来自离体灌流小鼠心脏的钙瞬变（CaT）有望揭示心律失常发生的机制。与细胞水平的研究相比，光学标测技术能够检测多种电生理参数，例如激活时间、传导速度、动作电位时程以及CaT时程。本文介绍了用于高通量光学标测CaT和 Vm 在小鼠野生型和杂合子中 RyR2-R2474S/+ 心脏，结合在异丙肾上腺素刺激前后进行程序性电刺激。该方法已证明是机制性研究儿茶酚胺能多形性室性心动过速（CPVT）疾病的一种可行且可靠的手段 离体 小鼠心脏制备
引言
遗传性心脏疾病儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）在体力活动、应激或儿茶酚胺刺激后表现为多形性室性心动过速（PVT）发作，可能恶化为潜在致命的心室颤动1,2,3,4。自1995年首次报道该临床综合征以来，近期证据表明有七种基因突变与此病相关，这些基因均参与肌浆网（SR）钙库Ca2+释放的调控：其中最常见的是RYR2基因突变，编码Ca2+释放通道的兰诺碱受体2（RyR2）5,6；此外还有FKBP12.67、编码心肌钙调集蛋白的CASQ28、编码连接部肌浆网蛋白三联蛋白的TRDN9，以及均编码钙调蛋白的CALM19、CALM210和CALM3
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
使用10 至14周龄、体重为20–25 g的雄性野生型小鼠或RyR2-R2474S/+小鼠（C57BL/6背景）进行实验。所有实验程序均已由中国四川西南医科大学动物护理与使用委员会批准（批准号：20160930），并符合该机构所遵循的国家指导原则。
1. 准备
- 储备溶液
- 比比斯汀储备液：向含有 2.924 mg (-) 比比斯汀粉末的原装小瓶中加入 1 mL 100% 二甲基亚砜（DMSO），配制成 10 mM 的溶液。
- 电压指示剂 RH237 储备液：向含有 1 mg RH237 粉末的原装小瓶中加入 1 mL 100% DMSO，配制成 2.01 mM 的溶液。
- 钙指示剂 Rhod-2 AM 储备液：向 1 mg Rhod-2 AM 粉末中加入 1 mL 100% DMSO，配制成 0.89 mM 的溶液。
- 普鲁尼克 F127 储备液：向 200 mg 普鲁尼克 F127 中加入 1 mL 100% DMSO，配制成 20% w/v（0.66 mM）的溶液。
- 将储备液分装至 200 µL PCR 管中，每管体积分别为 21–51 µL（RH237 为 21 µL，Rhod-2 AM 为 31 µL，比比斯汀为 51 µL），以供单次或双次使用，避免....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在过去十年中，光学标测已成为研究复杂心脏心律失常的常用方法。光学标测系统包含一台EMCCD相机，其采样率可达1,000 Hz，每个像素的空间分辨率为74 × 74 µm，可在信号采样期间实现较高的信噪比（图1）。当Langendorff灌注心脏达到稳定状态且染料加载完成后，将心脏置于恒温灌流腔内，并用两个530 nm的LED光源照射，以激发电压指示剂RH237和Ca2+指示剂Rhod-2 AM。发射光被分光为600 nm（用于Ca2+）和670 nm（用于Vm）两个波长，由EMCCD相机同时检测。在用阿佛丁（avertin）和肝素灌注15分钟后，使用手术器械（图2A）打开胸腔并迅速取出心脏，随后将其转移至冷的Krebs溶液（4 °C，95% O2，5% CO2）中（图2B）。仔细清除周围组织，用4-0缝线固定主动脉，并将一根0.7 mm的塑料管插入左心.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
根据我们的经验，成功进行小鼠心脏双染料光学标测的关键包括制备良好的溶液和心脏、染料负载、获得最佳的信噪比以及减少运动伪影。
溶液的配制
克雷布斯（Krebs）溶液对于成功的心脏实验至关重要。由于氯化镁（MgCl2）和氯化钙（CaCl2）易吸水，需预先配制成1 mol/L的储备液，并在其他所有成分溶解于纯水之后再加入克雷布斯溶液中，因为Mg2+和Ca2+容易与CO32-形成沉淀。克雷布斯溶液需用95% O2/5% CO2混合气体至少通气30分钟，以确保充分氧合。由于小鼠心脏对pH值特别敏感，氧合后溶液的pH值应维持在7.4左右。即使溶液中存在微小颗粒，也可能堵塞毛细血管并影响灌注效果，从而干扰实验结果。因此，使用前需用0.22 µm无菌针头滤器过滤溶液。
心脏制备
.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有作者均无任何利益冲突需要声明。
致谢
本研究由国家自然科学基金（81700308 资助 XO，31871181 资助 ML，82270334 资助 XT）、四川省科技计划项目（CN）（2021YJ0206 资助 XO，23ZYZYTS0433，2022YFS0607 资助 XT，2022NSFSC1602 资助 TC）以及药用资源化学与分子工程国家重点实验室（广西师范大学）（CMEMR2017-B08 资助 XO）、英国医学研究理事会（MRC）（G10031871181 资助 ML02647，G1002082，ML）、英国心脏基金会（BHF）（PG/14/80/31106，PG/16/67/32340，PG/12/21/29473，PG/11/59/29004 ML）和牛津大学英国心脏基金会卓越研究中心（BHF CRE at Oxford）（ML）项目资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm 注射器滤器 | 上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，中国上海 | N/A | 用于过滤溶液 |
| 15 mL 离心管 | 广州洁斐 filtration 有限公司，中国 | CFT011150 | |
| 1 mL 巴斯德移液管 | 北京莱伯格科技有限公司，中国 | 00900026 | |
| 1 mL 注射器 | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μL PCR 管 | 生工生物工程（上海）股份有限公司，中国上海 | F611541-0010 | 分装储备液 以避免反复冻融 |
| 50 mL 离心管 | 广州洁斐 filtration 有限公司，中国 | CFT011500 | 将台氏液在 4 °C 下保存，用于后续心脏分离 |
| 585/40 nm 滤光片 | Chroma Technology | N/A | 用于钙信号滤光 |
| 630 nm 长通滤光片 | Chroma Technology | G15604AJ | 用于电压信号滤光 |
| Avertin (2,2,2-三溴乙醇) | Sigma-Aldrich，普尔，多塞特，英国 | T48402-100G | 用于减轻痛苦和疼痛反射 |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国 | SLBV5564 | 兴奋-收缩解偶联剂，用于 在映射过程中消除运动伪影 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国 | SLBK1794V | 用于配制台氏液 |
| 定制恒温浴槽 | MappingLab，英国 | TBC-2.1 | 用于维持灌注液温度 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | 染料溶剂 |
| Dumont 镊子 | 上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，上海，中国 | YAF030 | |
| ElectroMap 软件 | 伯明翰大学 | N/A | 电生理参数的量化分析 |
| EMCCD 相机 | Evolve 512 Delta, Photometrics, 图森, 亚利桑那州, 美国 | A18G150001 | 采集光学信号图像 |
| ET525/36 溅射镀膜滤光片 | Chroma Technology | 319106 | 激发滤光片 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | SLBT4811V | 用于配制台氏液 |
| 肝素钠 | 成都海通制药有限公司，中国成都 | (H51021209) | 用于防止冠状动脉内血栓形成 |
| 虹膜镊 | 上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，上海，中国 | YAA010 | |
| 异丙肾上腺素 | MedChemExpress，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国 | HY-B0468/CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | SLBS5003 | 用于配制台氏液 |
| MacroLED | Cairn Research, 法弗舍姆, 英国 | 7355/7356 | 荧光探针的激发光源 |
| MacroLED 光源 | Cairn Research, 法弗舍姆, 英国 | 7352 | 控制 LED |
| Mayo 剪刀 | 上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂，上海，中国 | YBC010 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | N/A | 光学信号采样 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | BCBS6841V | 用于配制台氏液 |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, 英国 | M5337 | 连接电刺激器与 Spike2 软件 |
| MyoPacer EP 场刺激器 | Ion Optix 公司，米尔顿，马萨诸塞州，美国 | S006152 | 电刺激器 |
| NaCl | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | SLBS2340V | 用于配制台氏液 |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | BCBW9042 | 用于配制台氏液 |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, 圣路易斯, 密苏里州, 美国 | SLBX3605 | 用于配制台氏液 |
| NeuroLog 系统 | Digitimer | NL905-229 | 用于心电图放大器 |
| OmapScope5 | MappingLab, 英国 | N/A | 钙交替和心律失常分析 |
| 眼科剪刀 | 淮安特生医疗器械有限公司，江苏，中国 | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, 法弗舍姆, 英国 | 6970 | 分光以同时检测 Ca2+ 和 Vm |
| 蠕动泵 | 保定兰格恒流泵有限公司，中国保定 | BT100-2J | 用于泵送溶液 |
| 培养皿 | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州, 美国 | 1899021 | 增强 Rhod-2 AM 的负载效率 |
| RH237 | Thermo Fisher Scientific, 沃尔瑟姆, 马萨诸塞州, 美国 | 1971387 | 电压敏感性染料 |
| Rhod-2 AM | Invitrogen, 卡尔斯巴德, 加利福尼亚州, 美国 | 1890519 | 钙离子指示剂 |
| 硅胶管 | 保定兰格恒流泵有限公司，中国保定 | 96402-16 | 连接至蠕动泵 |
| 丝线缝合线 | 扬州源康医疗器械有限公司，中国 | 20172650032 | 用于固定主动脉 |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, 英国 | N/A | 用于记录和分析心电图数据 |
| 刺激电极 | MappingLab, 英国 | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | 用于光源 |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | 用于光源 |
参考文献
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. P....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
